芽孢杆菌XXXXXX抗稻瘟活性物质发酵.doc

X X X X大 学毕业设计说明书(论文)作 者:学 号：学院(系):专 业:生物工程题 目:芽孢杆菌XXXXXX抗稻瘟活性物质发酵条件的研究教授 指导者： (姓 名) (专业技术职务)评阅者： (姓 名) (专业技术职务) 2009年 6月毕业设计说明书（论文）中文摘要 本试验以芽孢杆菌XXXXXX发酵液抑菌活性为主要指标,研究了发酵培养基中不同氮源营养因子,以及接种量、装液量、初始pH、发酵时间、转速、温度等非营养因子对XXXXXX发酵液生物活性的影响。单因素试验结果表明，XXXXXX菌最适宜的发酵条件是pH 为8、接种量体积分数2%、发酵温度28、摇床转速210r/min。不同的装液量和发酵时间对XXXXXX发酵液的抗稻瘟活性并没有影响。采用合成培养基，氮源为硝酸钠时，XXXXXX菌的抗稻瘟活性优于其它氮源。正交试验结果表明，菌株XXXXXX优化发酵培养基的最佳配方：可溶性淀粉质量分数为3%，硝酸钠质量分数为0.25%，磷酸二氢钾质量分数为0.1%，pH为7。关键词 稻瘟菌 发酵条件 芽孢杆菌XXXXXX 正交设计毕业设计说明书（论文）外文摘要Title Effects of Culture Conditions on anti-Rice Blast fungus by Bacillus XXXXXX AbstractThe effects of the nutritional factors,inoculation rate,medium capacity, initial pH,fermentation time,rotate speed and fermentation temperature on biological activity of Bacillus XXXXXX were investigated by detecting the inhibition rate of rice blast fungus in the study.The result showed that the optimum fermentation conditions of XXXXXX included pH 8,inoculation rate 2%(v/v),fermentation temperature 28,rotate speed 210r/min.As to different fermentation time and medium capacity,the inhibitory effects of XXXXXX on rice blast fungus showed no different.When the nitrogen source was sodium nitrate,XXXXXX showed a stronger inhibitory ability than that the nitrogen source was yeast extract or peptone on synthetic medium. Orthogonal test showed that the optimum medium of XXXXXX fermentation was starch 3%,NaNO4 0.25%,KH2PO4 0.1%,pH 7.Keywords rice blast fungus; fermentation conditions; Bacillus XXXXXX; orthogonal design 本科毕业设计说明书（论文） 第 23 页 共 28页目 录1 引言11.1 稻瘟菌概述11.2 生物农药11.2.1 生物体农药21.2.2 生物化学农药21.2.3 生物农药发展前景31.3 发酵工艺控制31.3.1 温度对发酵的影响31.3.2 pH对发酵的影响41.3.3 接种量对发酵的影响41.3.4 转速对发酵的影响41.3.5 发酵时间对发酵的影响41.3.6 装液量对发酵的影响51.4 正交设计及其统计分析51.4.1 正交设计概述51.4.2 正交表及其特点51.5 本研究的目的及意义62 材料和方法62.1 材料62.1.1 菌种62.1.2 仪器设备62.1.3 试剂药品72.1.4 培养基72.2 方法72.2.1 菌种保存72.2.2 菌种复活72.2.3土豆液制备72.2.4 种子液制备72.2.5 活性检测72.2.6 单因素实验确定发酵条件对活性的影响82.2.7 正交试验确定最优培养基83 结果93.1 单因素实验确定发酵条件对活性的影响93.1.1 pH对发酵液活性的影响93.1.2 温度对发酵液活性的影响103.1.3 时间对发酵液活性的影响113.1.4 装液量对发酵液活性的影响133.1.5 转速对发酵液活性的影响143.1.6 接种量对发酵液活性的影响153.1.7 氮源对发酵液活性的影响163.2 正交设计确定最优化培养基18结 论20致 谢21参考文献22表 1 培养基优化正交试验方案8表 2 正交组合试验结果18图 1 不同pH条件下的抑菌圈9图 2 pH对产生抗生素的影响10图 3 不同温度条件下的抑菌圈11图 4 温度对产生抗生素的影响11图 5 不同发酵时间的抑菌圈12图 6 发酵时间对产生抗生素的影响12图 7 不同装液量条件下的抑菌圈13图 8 装液量对产生抗生素的影响13图 9 不同转速条件下的抑菌圈14图 10 转速对产生抗生素的影响15图 11 不同接种量条件下的抑菌圈15图 12 接种量对产生抗生素的影响16图 13 不同氮源条件下的抑菌圈17图 14 氮源对产生抗生素的影响17图 15 四因素与NUST菌株产抗的关系191 引言1.1 稻瘟菌概述水稻稻瘟病(Blast Fungus)，是全世界稻区危害最严重的水稻病害之一，义名稻热病，俗称火烧瘟、吊头瘟、掐颈瘟等，由稻梨孢菌（PyiculariaoryzaeCav.）引起。该病一年四季均可对水稻造成危害，其危害遍及水稻的各个部位，有苗稻瘟、叶瘟、叶枕瘟、节稻瘟、穗颈瘟、枝梗瘟和谷粒瘟等1。稻瘟病菌主要在稻草上和稻种上越冬，菌丝发育的温度为837摄氏度，以2428摄氏度最适合；分生孢子在1035摄氏度之间都可形成和发芽，经过46天便发育长大。分生孢子很轻，以空气为主要传播途径，一落到水稻上，只要得到一点水份都可成活，钻到水稻体内，便会破坏细胞，吸收养份。它钻入的地方，便可看到病斑，病斑再产生分生孢子，又传播到其它植株上，危害其它的植株。水稻在分蘖期和孕穗期抵抗力差，极易被感染。它的生长由天气、肥水管理、品种的抗性三大因素构成。从天气上讲，温度在2030度，相对温度在80%90%最适合病菌孢子发育和传播；肥水管理上讲，肥水管理也很密切，如偏施氨肥或肥料用量过大、施肥的时间等形成稻瘟病菌生长的有利条件。美国科学家在2005年4月21日出版的自然杂志上公布了常见的稻瘟病菌的基因组草图，这是科学家首次完成植物病原体的基因测序。美国北卡罗来纳州立大学科学家报告说，测序结果表明稻瘟病菌的基因超过1.1万个。另外，他们发现这种真菌的孢子上存在一个受体，这种受体能够区别水稻和其他作物。科学家说，该受体的发现在抗击这种病菌的道路上迈出了一大步。科学家可以通过转基因方法对水稻进行改良，使其不被受体识别。水稻稻瘟病的研究已有100余年的历史，我国早在1925年就开始调查研究，70余年来，在水稻种质资源的抗性鉴定、筛选和利用，抗瘟良种的选育、病菌生理小种、预测预报和综合防治等方面取得了显著的进展2。但由于品种的更替，气候的变化，栽培耕作制度的改革，以及病菌小种组成的变化等因素的综合影响，稻瘟病的发生和危害仍然是当今世界各稻区面临的难题，抗病良种在推广35年后，病菌常产生能侵染该品种的优势小种，从而引起抗性丧失。随着品种的单一化和品种抗性的“丧失”，往往出现流行，造成严重损失。1.2 生物农药生物农药是“可用来防治病、虫、草等有害生物的生物体本身及源于生物，并可作为农药的各种生理活性物质”。按上述定义，生物农药应包括生物体农药和生物化学农药。生物体农药是指用来防除病、虫、草等有害生物的商品活体生物，生物化学农药则是指从生物体中分离出的具有一定化学结构，对有害生物有控制作用的生物活性物质3。1.2.1 生物体农药生物体农药包括植物体农药、动物体农药和微生物体农药3大类。1.2.1.1植物体农药4植物体农药是利用作物本身为载体，经基因修饰或重组而开发为农药。1983年第一株转基因植物问世，1986年美国EPA 首次批准孟山都公司的转基因作物如抗虫棉、大豆和抗草甘膦玉米进行试验,1994年准许其商品化生产，并首次将之列入农药范畴。1.2.1.2动物体农药动物体农药主要是指商品化的天敌昆虫和捕食螨，以及采用物理或生物技术改造的昆虫等。在早期的生物防治中，最重要的措施就是利用天敌昆虫和捕食螨。捕食性天敌分属于8个目的200个科内，常用的种类有瓢虫、草蛉、胡蜂等。1.2.1.3微生物体农药微生物体农药是指用来防治有害生物的活体微生物。细菌类农药制剂有Bt(苏云金杆菌)、亚宝(枯草杆菌)、力宝(假单胞杆菌)、增产菌(蜡状芽孢杆菌)等。近年来，采用基因工程等高新技术获得了Bt工程菌株，其毒力水平较出发菌株提高了1.54.3倍口，部分指标达到国际先进水平。一些害虫对Bt产生了抗药性，为了延缓其抗药性的产生，应用Bt制剂与阿维菌素、昆虫生长调节剂等复合增效的方式，成功研制了Bt生物复合杀虫剂抑虫啉和克虫威，其杀虫效果良好，使用成本大大降低。1.2.2 生物化学农药生物化学农药包括植物性生物化学农药、动物性生物化学农药和微生物性生物化学农药3大类6。1.2.2.1 植物性生物化学农药自20世纪80年代以来，植物性生化农药在我国发展很快，至今已成功地开发出了许多植物性农药，烟碱等16种植物性农药已登记注册，生产企业达46家。植物性杀虫剂主要是利用植物体内的次生代谢物质如生物碱、萜烯类、黄酮等来抑制害虫的生长发育，干扰其正常行为。研究的内容涉及到楝科、禾本科、卫矛科、柏科、豆科、菊科、瑞香科等科的多种植物6。1.2.2.2 动物性生物化学农药动物性生化农药中最常见的为昆虫性信息素类。据统计，全世界现已合成昆虫性信息素l000多种，已商品化的有280多种。同时，对蚜虫的报警信息素、蜚蠊的聚集信息素和蚂蚁的踪迹信息素进行了研究，并取得了较大的成果。1.2.2.3 微生物性生物化学农药微生物产生的抗生素和毒素如Avermectin、井冈霉素、双丙氨磷、赤霉素、梅岭霉素等可防治多种病、虫、草、螨，效果很好。1987年Barron等报道了一种真菌粗皮侧耳菌丝产生的毒素可击倒线虫，1992年从粗皮侧耳中分离出一种杀线虫毒素transzecenedioic acid7。至今已发现9O余种杀线虫的真菌毒素，如担子菌、子囊菌及其活性代谢物。梅岭霉素对苹果红蜘蛛、柑橘红蜘蛛、二斑叶螨有很好防效。1.2.3 生物农药发展前景对我国来说，微生物性农药和植物性农药是生物农药发展的主体。当前，微生物农药特别是Bt发展得到了大力扶持，Bt资源丰富，产品工业化生产便捷，与多种生物农药复合增效能力极强，并已开发出用于防治农作物(蔬菜、水稻、棉花等)、森林(含城市园林)和公共卫生等方面主要害虫的系列产品，其杀虫潜力在蔬菜、水稻、棉花及经济林果主要害虫上逐渐得到发挥。因此，以Bt为依托研制开发新型高效、低毒、低成本杀虫剂是一条彻底改变我国现存杀虫剂品种布局不合理的捷径，也是短、平、快开发国产农药品种并与国外农药竞争的重要手段8。1.3 发酵工艺控制微生物发酵的生产水平不仅取决于生产菌种本身的性能，而且要赋以合适的环境条件才能使它的生产能力充分发挥出来。为此，我们必须通过各种方法了解有关生产菌种对环境因素的要求，如培养基、培养温度、pH、氧的需求等，并深入了解生产菌在合成产物过程中的代谢调控机制以及可能的代谢途径，为设计合理的生产工艺提供理论基础9。就产品的类型而言，发酵有下列几种主要类型10：以微生物菌体为产物的微生物菌体发酵、以微生物酶（含蛋白）为产物的酶发酵、以菌体代谢产物（含初级代谢产物和次级代谢产物）为目的的产品发酵和利用微生物酶修饰作用的微生物转化发酵等。1.3.1 温度对发酵的影响微生物能够在一个较宽的温度范围内生长，但是要获得高质量的发酵液，其最适温度区间很狭窄。温度的变化对发酵过程可产生两方面的影响：一方面是影响各种酶反应的速率和蛋白质的性质；另一方面是影响发酵液的物理性质11。产物的合成是由一系列的酶催化反应来完成的。一般发酵温度升高，酶反应速率增大，发酵周期缩短。但酶本身又很容易过热而失活，从而影响酶催化效率，最终降低产率。因此发酵产物的合成也有一个最适温度。另外，温度还会影响生物合成的方向。例如，四环素发酵中金色链霉菌同时能产生金霉素，在低于30下，合成金霉素的能力较强。合成四环素的比例随温度的升高而增大，在35下只产生四环素。近年来研究发现，温度对代谢有调节作用。在低于20时，氨基酸合成途径终产物对第一个酶的反馈抑制作用比在正常生长温度37大。1.3.2 pH对发酵的影响发酵培养基的pH值，对微生物的生长具有非常明显的影响，也是影响发酵过程中各种酶活动的重要因素。由于pH不当，可能严重影响菌体的生长和产物的合成，因此对微生物发酵来说有各自的最适生长pH。生长在高pH（8.5-11.5）的微生物称为嗜碱菌；嗜酸菌是指那些生长在低pH（0-5.5）中的微生物12。1.3.3 接种量对发酵的影响这是指移种的种子液体积与发酵液体积之比。不同微生物其发酵的接种量是不同的。接种量的大小是由该菌种在发酵过程中的生长繁殖速度决定的。通常，采用较大的接种量可以缩短生长达到高峰的时间，是产物的合成提前。这是由于种子量多，种子液中含有大量的胞外水解酶类，有利于基质的利用，并且生产菌在整个发酵罐内迅速占优势，从而减少杂菌生长的机会。但是，接种量过大，也可能使菌种生长过快、培养液黏度增加，导致溶氧不足，影响产物合成13。1.3.4 转速对发酵的影响在需氧发酵过程中，气态氧必需先溶解于培养液中，然后才可能传递到细胞表面，再经过简单的扩散作用进入细胞内，参与菌体内的氧化等生物化学反应。因此，实验室三角瓶发酵需要在摇床上进行。控制转速对于发酵来说至关重要，转速太小，氧气无法进入发酵液中；转速太快，分子氧无法与菌体充分接触。1.3.5 发酵时间对发酵的影响当一个细菌的细胞接种于含有生长所需基本成分的培养基时。细胞开始累积营养物，合成新的细胞结构成分，细胞长大，复制它的遗传物质，最后合成新的细胞壁和细胞分，一个细胞分裂变成两个细胞，经过另外一段时间分裂变成四个细胞。细菌在液体培养基中遵循典型模式规律生长，细菌接种后立即有一个适应培养基的阶段称为延迟期，接着就是对数生长期，以活细胞数目的对数对时间所作曲线，可以见到一小段直线，一旦营养耗尽或有毒代谢物积累，细胞数目的净增长停止，称作稳定期，再经过一段时间之后，紧接着是衰亡期，细胞数目下降，直到细胞裂解18。因此，发酵过程一定要在对数期即将结束的时候就停止。1.3.6 装液量对发酵的影响装液量的多少主要是影响发酵瓶内空气量的多少。依据细菌的代谢类型，它们对氧气的要求变化很大。好氧菌为在有分子氧条件下才能生长的细菌；厌氧菌为生长不需要氧的细菌；在此范围内还有专性厌氧菌在有氧条件下致死。兼性厌氧菌如大肠杆菌，有氧情况下生长的更好，无氧条件下也能生长。1.4 正交设计及其统计分析1.4.1 正交设计概述正交设计(orthogonal design)是一种研究多因素试验的设计方法。在多因素试验中，随着试验因素和水平数的增加，处理组合数急剧增加。例如，3因素3水平的试验，就有33=27个处理组合，4因素4水平的试验，就有44=256个处理组合。要全面实施这么庞大的试验室相当困难的。因而，D.J.Finney 倡议了部分试验法。而后日本学者倡导利用征缴款式设计部分试验，称为正交试验14。正交试验利用一套规格化的表格正交表（orthogonal table）来科学合理地安排试验的设计方法。这种设计的特点是在全部试验处理组合中，挑选部分有代表性的水平组合（处理组合）进行试验。通过部分实施了解全面试验情况，从中找出较优的处理组合。这样可以大大节省人、财、物和时间，使一些难以实施的多因素试验得以实施。例如，要进行一个4因素3水平的多因素试验，如果全面实施则需要34=81个处理组合，在试验中因规模太大而难以实施。但是，如果采用一张L9（34）的正交表安排试验，则只要9个处理组合就够了。1.4.2 正交表及其特点正交表是正交设计的基本工具。在正交设计中，安排试验、分析结果，均在正交表上进行。常用的正交表，已由数学工作者制定出来，试验时只要根据实验条件直接套用就行了，不需要另行编制15。用正交表进行试验安排具有以下两个特性：（1）均衡分散性：是说明正交表挑出来的这部分水平组合，在全部可能的水平组合中分布均匀，因此代表性强，能较好地反映全面情况。（2）整齐可比性：由于正交表中个因素的水平是两两正交的，因此任一因素任一水平下都必须均衡的包含着其它因素的个水平。常用正交表中，适用于二水平试验的L4（23）、L8（27），适用于三水平试验的有L9（34）、L27（313）等，还有适用于四水平、五水平及水平数不等的正交表，共设计时选用。1.5 本研究的目的及意义本实验室通过平板对峙法从土壤中分离出对水稻稻瘟病菌有拮抗作用的枯草芽孢杆菌XXXXXX。通过初步的研究发现，该菌对水稻稻瘟菌具有明显的抑制作用。本课题拟分析影响XXXXXX的发酵因素，研究不同条件对该菌代谢产物活性的影响，为开发抗稻瘟制剂确定最适的培养基。2 材料和方法2.1 材料2.1.1 菌种XXXXXX是本实验室保存菌种；水稻稻瘟菌（Blast Fungus）是本实验室保存菌种。2.1.2 仪器设备恒温振荡器 太仓市科技器材厂电子万用炉 天津泰斯特仪器厂电子天平 上海良年仪器仪表有限公司立式压力蒸汽灭菌器 上海博讯实业有限公司医疗设备厂 特制加厚铝锅 淮南市大通区泰达铝制品厂双人单面净化工作台 苏州净化设备有限公司隔水式恒温培养箱 上海博讯实业有限公司医疗设备厂全温度光照震荡培养箱 太仓市华美生化仪器厂高速微量离心机 长沙湘仪离心机仪器有限公司玻璃仪器烘干器 河南省巩义市英峪予华仪器厂2.1.3 试剂药品无水氯化钙，蔗糖，酵母膏，磷酸二氢钾，氯化亚铁，硫酸镁，硝酸钠，可溶性淀粉，蛋白胨，琼脂。2.1.4 培养基PDA培养基：蔗糖2.0%，土豆20%，琼脂 1.2%。种子培养基：蔗糖 2.0%，土豆 20%。发酵培养基：土豆 20%。Ht培养基：磷酸二氢钾 0.1%，无水氯化钙 0.01%，硫酸镁 0.015%，氯化铁 0.001%，可溶性淀粉 3%，硝酸钠 0.25%，水50mL。2.2 方法2.2.1 菌种保存采用20%甘油保存菌种，即甘油:菌液=20:80,800uL菌液加200uL灭菌甘油后,充分混匀后,-70保藏。2.2.2 菌种复活将保存的XXXXXX菌株，用接种环接入含有PDA培养基的培养皿中，28下培养24d。2.2.3土豆液制备将新鲜土豆去皮，称重，切成薄片，水煮加热，待沸腾之后保持微沸状态30min，冷却，用双层滤布过滤，并按照5：1的比例定容。2.2.4 种子液制备将活化好的菌种接种到种子液培养基中，在28、180r/min条件下振荡培养18h。2.2.5 活性检测发酵液经0. 45m微孔滤膜过滤灭菌后，取3mL过滤液与30mL冷却至55左右的PDA培养基混合倒入已灭菌培养皿中，待凝固后，在培养基中央接种生长旺盛的稻瘟病菌进行拮抗性测定, 以无菌空白培养基作对照，28下培养57d。测量菌落直径, 并计算相对抑菌率。相对抑菌率(%)=(对照菌落半径-处理菌落半径)/对照菌落半径100%或相对抑菌率(%)=拮抗带宽度/对照菌落半径100%2.2.6 单因素实验确定发酵条件对活性的影响2.2.6.1 pH对发酵液活性的影响16在其他培养条件一致的条件下，将培养基的起始pH值分别调至2、4、6、8、10、12、14，28、180r/min恒温摇床培养30h，测定发酵液活性。2.2.6.2 温度对发酵液活性的影响按2%接种量接种，分别在28、37下180 r/min振荡培养30h，测定发酵液活性。2.2.6.3 时间对发酵液活性的影响17将培养好的种子液，按2%接种于发酵培养基中，在28、180 r/min恒温摇床中分别培养12h、24h、36h、48h、72h、96h，测定发酵液活性。2.2.6.4 装液量对发酵液活性的影响18以摇瓶装液量变化方式来进行,在250mL三角瓶中加入发酵培养基分别为25mL、50mL、75mL、100mL、125mL和150mL, 按2%接种种子液于发酵培养基中，在28、180 r/min条件下培养30h,测定发酵液的抗稻瘟活性。2.2.6.5 转速对发酵液活性的影响19按2%接种量接种,分别在28，210r/min、100r/min转速下振荡培养30h,测定发酵液活性。2.2.6.6 接种量对发酵液活性的影响20分别采用装液量的1 %、2 %、5 %、7.5 %、10%、20%的接种量接种拮抗菌株XXXXXX于液体发酵培养基中, 28、180r/min恒温摇床培养30h,测定发酵液活性。2.2.6.7 氮源对发酵液活性的影响21在Ht培养基中分别添加1%的硝酸钠、酵母膏、蛋白胨作为氮源，接种后28、180r/min恒温摇床培养30h,测定发酵液活性。2.2.7 正交试验确定最优培养基选取可溶性淀粉、硝酸钠、磷酸二氢钾、pH为主要发酵条件, 设计四因素三水平正交试验, 见表2。配制培养基, 按不同发酵条件发酵培养后,测定各发酵液对稻瘟病菌的拮抗性22-24。表 1 培养基优化正交试验方案试验号（处理组合）1列：可溶性淀粉（A）2列：硝酸钠（B）3列：磷酸二氢钾（C）4列：pH（D）1234567891：0.5g1：0.5g1：0.5g2：1.5g2：1.5g2：1.5g3：2.5g3：2.5g3：2.5g1：02：0.125g3：0.25g1：02：0.125g3：0.25g1：02：0.125g3：0.25g1：02：0.05g3：0.1g2：0.05g3：0.1g1：03：0.1g1：02：0.05g1：42：73：103：101：42：72：73：101：43 结果3.1 单因素实验确定发酵条件对活性的影响3.1.1 pH对发酵液活性的影响对在不同pH条件下测定发酵液活性试验所得到的平板拍照如图1所示，测量稻瘟菌的生长直径并绘制成图如图2所示。图 1 不同pH条件下的抑菌圈注：a-2；b-4；c-6；d-8；e-10；f-12；g-14；h-对照图 2 pH对产生抗生素的影响结果表明发酵液pH 值对拮抗菌株XXXXXX产生抗稻瘟物质的抑菌活性关系密切,发酵液初始pH在8时代谢产物的活性最强；在微酸性或微碱性的环境中，发酵液对稻瘟菌的抑制作用较强；但是在过酸性（pH12）的环境中活性受到明显的抑制。3.1.2 温度对发酵液活性的影响对在不同温度发酵条件下测定发酵液活性试验所得到的平板拍照如图3所示，测量稻瘟菌的生长直径并绘制成图如图4所示。图 3 不同温度条件下的抑菌圈注：a-37；b-28；c-对照图 4 温度对产生抗生素的影响观察发现，XXXXXX菌在28条件下培养得到的发酵液活性大于在37得到的发酵液。相对于对照组，28的发酵液的抑菌率为17%，而37的发酵液几乎没有活性。3.1.3 时间对发酵液活性的影响对在不同发酵时间条件下测定发酵液活性试验所得到的平板拍照如图5所示，测量稻瘟菌的生长直径并绘制成图如图6所示。图 5 不同发酵时间的抑菌圈注：a-12h；b-24h；c-36h；d-48h；e-72h；f-96h；g-对照图 6 发酵时间对产生抗生素的影响研究发现，发酵时间的长短对XXXXXX菌发酵液的活性没有明显的影响。3.1.4 装液量对发酵液活性的影响对在不同装液量条件下测定发酵液活性试验所得到的平板拍照如图7所示，测量稻瘟菌的生长直径并绘制成图如图8所示。 图 7 不同装液量条件下的抑菌圈注：a-25mL；b-50mL；c-75mL；d-100mL；e-125mL；f-150mL；g-对照 图 8 装液量对产生抗生素的影响研究发现，小于75mL 装液量的发酵液的活性强于大于100mL装液量，但是，差异并不显著。3.1.5 转速对发酵液活性的影响对在不同转速发酵条件下测定发酵液活性试验所得到的平板拍照如图9所示，测量稻瘟菌的生长直径并绘制成图如图10所示。 图 9 不同转速条件下的抑菌圈注：a-210r/min；b-100r/min；c-对照 图 10 转速对产生抗生素的影响观察发现，XXXXXX菌在不同的转速条件下培养得到的发酵液的活性具有明显的差异，在转速为210r/min的发酵液活性大于在100r/min转速下得到的发酵液。相对于对照组，210r/min转速下发酵液的抑菌率达到40%；而在100r/min的转速下，发酵液抑菌率仅为14%。3.1.6 接种量对发酵液活性的影响对在不同接种量条件下测定发酵液活性试验所得到的平板拍照如图11所示，测量稻瘟菌的生长直径并绘制成图如图12所示。 图 11 不同接种量条件下的抑菌圈注：a-1%；b-2%；c-5%；d-7.5%；e-10%；f-20%；g-对照图 12 接种量对产生抗生素的影响结果显示，在接种量为2%时，发酵液的活性最强，其活性是10%接种量条件下的5倍左右。从整体上看，较小接种量条件下的发酵液活性普遍高于较大的接种量，说明在接种量过高时，由于培养基内菌体量过大，营养物质消耗过快，导致菌类大量死亡，产物的合成量大大减少。3.1.7 氮源对发酵液活性的影响对在不同氮源条件下测定发酵液活性试验所得到的平板拍照如图13所示，测量稻瘟菌的生长直径并绘制成图如图14所示。 图 13 不同氮源条件下的抑菌圈注：a-硝酸钠；b-蛋白胨；c-酵母膏；d-对照 图 14 氮源对产生抗生素的影响观察发现，不同的氮源发酵得到的发酵液活性从高到低依次为：硝酸钠、蛋白胨、酵母膏，三者的差异明显。对于芽孢杆菌XXXXXX菌来说，相较于有机氮源来说，无机氮源更有利于该菌的生长和产物的合成，其对无机氮源的利用率也更高。3.2 正交设计确定最优化培养基正交试验结果如表2和图15所示。表 2 正交组合试验结果No.ABCD直径/mm抑菌率/%12345678911122233312312312312323131212331223123132617221517181633.356.713.343.326.75043.34046.7T1T2T370.0113.3110090.0106.796.7100.0123.370.063.3133.396.7X1X2X323.337.836.730.035.632.233.341.123.321.144.432.2R14.45.617.823.3 图 15 四因素与NUST菌株产抗的关系由极差分析可以得出，以因素D对XXXXXX产抗稻瘟活性物质的影响最为显著，因素C、A次之，因素B最小。所以，pH为最重要因素，其次是磷酸二氢钾、然后是可溶性淀粉、硝酸钠为最不重要因素。各因素实验指标的影响因素作用按大小排序为:DCAB。理论优化方案为:A2B2C2D2。即可溶性淀粉质量分数为3%，硝酸钠质量分数为0.25%，磷酸二氢钾质量分数为0.1%，pH为7。结 论本实验室通过在不同的条件下培养XXXXXX菌，并测定其发酵液的抗稻瘟菌活性来评价其抑菌能力。根据单因素试验分析，不同的pH、转速、温度、接种量和氮源均能够不同程度的影响XXXXXX菌的生长。XXXXXX菌在发酵液的pH为8、接种量按照2%接种在28、210r/min的条件下生长情况较佳；相反，对于不同的装液量和发酵时间，XXXXXX菌均能够正常生长。采用合成培养基，氮源为硝酸钠时，XXXXXX菌的生长状况由于在其它氮源情况下。依据正交试验结果显示，理论的优化方案为: A2B2C2D2，即可溶性淀粉质量分数为3%，硝酸钠质量分数为0.25%，磷酸二氢钾质量分数为0.1%，pH为7。致 谢值此论文完成之际，要感谢在本科阶段给予我指导、帮助和关心的所有人。论文是在导师X教授的悉心指导和严格要求下完成的，从论文的选题、方案的确定与实施、以至实验的进行、论文的构思与撰写，无不倾注导师的心血与汗水。他求实创新的科研精神、严谨治学的科学态度、高尚的道德情操、诲人不倦的师长风范使我在学习和生活中受益匪浅，特别是他对学生严格要求认真负责的态度、对科研一丝不苟实事求是的精神、对工作勤奋执着兢兢业业的精神令我终身难忘。值此论文付梓之际，谨向X老师致以最崇高的敬意！在校学习及实验期间还得到了众多老师的指导和帮助，特向X老师、X老师、X老师、X老师等表示诚挚的谢意！特别感谢本实验室X博士和分子代谢中心诸位学长、学姐给予我的指导和帮助！感谢父母给予我的学习生活上无微不至的关怀鼓励、支持和帮助。他们对于我的关心、理解是我不断前进的动力。 再次向所有指导、关心、帮助和支持我的老师、同学、朋友、亲人致以最衷心的谢意!参考文献1 张宇，张敏，叶亚军.稻瘟病生防放线菌菌株A11发酵液中抗菌物质的稳定性测定J.中国农学通报，2005，21(6)：315316.2 孙国昌，杜新法，陶荣祥等.水稻稻瘟病防治研究进展和2l世纪初研究设想J.植物保护，2000，26(1)：33353 张宁波.农用抗生素研究进展J.湖北农业科学，2006，45(6)：830833.4 胡庆堂微生物农药生产技术进展J生物工程进展，199