质谱分析蛋白质的相互作用.doc

蛋白质的相互作用蛋白质间的相互作用存在于生物体每个细胞的生命活动过程中，互交叉形成网络，成细胞中一系列重要生理活动的基础。其中，多数蛋白质是通过与配体分子结合或者是作为1个大的生物复合体的一部分，与细胞完整性维持、遗传物质复制、基因表达调控、信号转导、免疫应答等一系列生命过程。研究蛋白质间相互作用的方式和程度，将有助于蛋白质功能的分析、疾病致病机理的阐明和治疗和新型药物的开发等众多难题的解决。因此，确定蛋白质间相互作用关系、绘制相互作用图谱已成为蛋白质组学研究的热点。近年来有许多方法被用于蛋白质相互作用的研究，酵母双杂交技术，免疫共沉淀技术，串联亲和纯化技术，化学交联技术，蛋白质芯片技术，荧光共振能量转移技术，噬菌体展示技术等。酵母双杂交技术Fields和song等首先在研究真核基因转录调控中建立起来的，是在真核细胞中检测蛋白质与蛋白质之间的相互作用的方法。该系统是通过两个分别称之为“诱饵蛋白”和“捕获蛋白”的融合蛋白形成一个完整的转录激活因子，从而激活报告基因的表达，通过在营养缺陷型培养基上生长或呈现显色反应来检测系统的功能。酵母双杂交系统可在全基因组规模上进行蛋白质一蛋白质相互作用高通量的研究。免疫共沉淀技术免疫共沉淀是利用抗原和抗体的特异性结合以及细菌的Protein A或G特异性地结合到免疫球蛋白的Fc片段的现象开发出来的方法。其基本原理是，在细胞裂解液中加入抗兴趣蛋白的抗体，孵育后再加入与抗体特异结合的结合于Agarose珠上的Protein A或G，若细胞中有与兴趣蛋白结合的目的蛋白，就可以形成这样一种复合物：“目的蛋白兴趣蛋白抗兴趣蛋白抗体Protein A或G”，经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，复合物又被分开。然后经免疫印迹或质谱检测目的蛋白。这种方法得到的目的蛋白是在细胞内与兴趣蛋白天然结合的，符合体内实际情况，得到的结果可信度高。这种方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合；也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用搭档。串联亲和纯化技术串联亲和纯化(TAP)是一种能快速研究体内蛋白质相互作用的新技术，经过两步特异性亲和纯化，可快速得到生理条件下与靶蛋白质存在真实相互作用的蛋白质。该技术通过在靶蛋白质一端嵌入一个特殊的蛋白质标签(TAPtag)，不破坏靶蛋白质调控序列，且靶蛋白质表达量与体内水平相当；经过两步连续的亲和纯化获得接近自然条件的特定蛋白质复合体，后用质谱技术或Edman 降解法进行蛋白质鉴定。与传统的研究蛋白质相互作用的技术相比，TAP 技术具有周期短、假阳性结果少等优点。化学交联技术交联剂是能在线型分子间起架桥作用从而使多个线型分子相互键合交联成网络结构的物质。 促进或调节聚合物分子链间共价键或离子键形成的物质。化学交联剂是能够和蛋白质反应的带有双功能团的化学试剂。通过功能团和氨基酸残基反应，偶联两个蛋白质或者更多的蛋白质形成网状交联。功能团决定了交联剂的反应特异性。 化学交联试剂捕获感兴趣的发生了相互作用的蛋白质对，结合生物质谱的高解析能力，快速、高通量地获取蛋白质高级结构信息。蛋白质芯片技术蛋白质芯片是一种新型的生物芯片，是由固定于不同种类支持介质上的蛋白微阵列组成，阵列中固定分子的位置及组成是已知的，用未经标记或标记(荧光物质、酶或化学发光物质等标记)的生物分子与芯片上的探针进行反应，然后通过特定的扫描装置进行检测，结果由计算机分析处理。蛋白质芯片具有以下特点: 1)特异性强。这是由抗原抗体之间、蛋白与配体之间的特异性结合决定的；2)敏感性高。可以检测出样品中微量蛋白的存在，检测水平已达ng级；3)通量高。在一次实验中对上千种目标蛋白同时进行检测，效率极高；4)重复性好；不同次实验间相同两点之间差异很小；5)应用性强。样品的前处理简单，只需对少量实际标本进行沉降分离和标记后，即可加于芯片上进行分析和检测；6)适用范围广。适用于包括组织、细胞系、体液在内的多种生物样品。荧光共振能量转移技术荧光共振能量转移(FRET)是指两个荧光基团间能量通过偶极一偶极耦合作用以非辐射方式从供体传递给受体的现象，可被用于测定分子间的距离。FRET荧光探针主要有荧光蛋白、有机荧光染料、镧系染料和量子点，FRET方法的特点是适用于活细胞和固定细胞的各类分子，灵敏度和分辨率高，并能清晰成像，最直观地提供蛋白质相互作用的定位和定量信息，因而受到广泛重视。噬菌体展示技术噬菌体展示技术是一种亲和选择和基因表达产物相结合的技术，以改造的噬菌体为载体，将外源多肽或蛋白与噬菌体的一种衣壳蛋白融合表达，融合蛋白将展示在病毒颗粒的表面，而编码这个融合子的DNA则位于该病毒粒子内，通过检测病毒内部的DNA来测定融合蛋白序列。噬菌体展示技术使大量随机多肽与其DNA编码序列之间建立了直接联系，使得各种靶分子的多肽配体通过一种被称为淘选的体外选择程序得以快速鉴定。下面举一个具体的例子来说明酵母双杂交技术的应用酵母双杂交技术水稻条纹叶枯病是东亚地区普遍发生的毁灭性水稻病害，被称为水稻上的“癌症”。其病原是水稻条纹病毒（RSV），RSV 具有独特的基因组结构和编码策略， 它由4条RNA链组成，其核苷酸共参与编码7个蛋白， 包括RdRp、NS2、NSvc2、CP、NS3、SP、NSvc4。在本实验中，研究NS3与CP、SP、NSvc4的互作，为进一步探讨水稻条纹病毒的致病机理提供依据。材料：水稻健康和感病幼苗由福建农林大学病毒研究所培育。大肠杆菌DH5为本实验室保存， 克隆载体pMD18-T 购自TaKaRa公司。酵母双杂交试剂盒购自Clontech公司，其中包括载体pGADT7、pGBKT7、pGBKT7-53、pGBKT7-Lam、pGADT7-T、pCL载体质粒和酵母菌AH109；诱饵质粒pGBKCP、pGBK-SP、pGBK-NSvc4、pGADT7-CP为本实验室保存。1 方法1.1 目的基因NS3的获得称取感病水稻叶片组织1.02.0g， 用Trizol法提取总RNA，具体操作按照试剂盒说明进行。以病叶总RNA 为模板，以R1为引物反转录合成第一链cDNA，然后以F1/R1（F1：GGACTAGTATGAACGTGTTCACATCGTCTGTG；R1：CGGGATCCCTACAGCACAGCTGGAGAGCT）引物PCR扩增目的基因NS3，在1.0琼脂糖凝胶电泳后，按照QIAEXGel Extration Kit（QIAGEN公司产品）回收纯化说明书回收目的片段。1.2 NS3克隆载体的构建将上述回收产物与PMD-18T载体连接，16过夜，然后将连接产物转化到大肠杆菌DH5 感受态细胞，涂布于LB平板，于25培养过夜（1624 h），经过蓝白斑筛选后，对阳性克隆菌落提取质粒并进一步PCR和酶切鉴定。将实验获得的重组子命名为pMD-NS3。1.3 NS3酵母表达载体的构建用限制性内切酶Spe和BamH分别双酶切两个重组子pGADT7-CP和pGBKT7-CP，同时用Spe/BamH双酶切重组子pMD-NS3，琼脂糖凝胶电泳后，回收相应的目的片段pGADT7和pGBKT7及NS3。然后用T4DNA连接酶将NS3与同样酶切回收的酵母双杂交载体pGADT7和pGBKT7分别连接，于16 过夜，将连接产物转化大肠杆菌DH5，分别涂布于LB/Amp、LB/Kan平板，筛选转化子，然后用PCR和酶切鉴定插入片段，获得重组质粒PGAD-NS3和PGBK-NS3。最后测序，鉴定插入片段是否与目的基因一致。1.4 重组质粒对AH109细胞毒性检测以含有空载体pGBKT7或pGADT7的酵母菌AH109为对照，比较含有不同重组质粒的酵母菌在SD/-Trp或SD/-Leu 培养基中的生长情况，来检测各重组质粒表达产物对细胞的毒性情况。实验通过比较SD/-Trp或SD/-Leu 固体培养基上菌落的生长速率和克隆数来进行鉴定，或通过SD/-Trp 或SD/-Leu液体培养基进行鉴定。方法为： 分别挑取1 个较大的单克隆菌落（23mm）接种于含有50mL SD/-Trp/Kan（20g/mL）液体培养基的锥形瓶中；30，200 r/min，过夜培养（1624h）；取少量培养物， 用紫外分光光度计检测OD600。如果OD600远远小于0.8，说明重组质粒对细胞可能具有毒性。1.5 NS3蛋白自激活活性的检测活化酵母菌AH109，按照酵母双杂交手册进行制备酵母感受态细胞。分别取5L重组质粒PGAD-NS3、PGBK-NS3、阳性对照质粒pCL1、阴性对照质粒pGADT7，与10L herring tests carrier DNA 充分混合后，转化到酵母菌AH109感受态细胞， 具体操作按照酵母双杂交手册进行。其中PGAD-NS3、阳性对照pCL1、阴性对照pGADT7 转化产物分别涂布于SD/-Leu、SD/-Leu-His-和SD/-Leu-Ade-平板。PGBK-NS3转化产物涂布于SD/-Leu-Trp、SD/Leu-Trp-His-、SD/Leu-Trp-His-Ade-营养缺陷型平板，于30 培养箱倒置培养34d，用无菌牙签挑取SD/-Leu和SD/-Leu-Trp平板上的菌落分别划线或者涂布于SD/-Leu/X-Gal 和SD/-Trp/X-Gal 平板上，观察菌落生长情况及变蓝情况，从而鉴定蛋白NS3有无自激活活性。1.6 酵母双杂交检测NS3蛋白自身及与CP、SP、NSvc4的互作将重组质粒PGAD-NS3/PGBK-NS3，pGBK -CP/PGAD -NS3、pGAD -CP/PGBK -NS3、pGBK -SP/PGAD -NS3、pGAD -SP/PGBK -NS3、pGBK -NSvc4/PGAD -NS3、pGAD -NSvc4/PGBK -NS3及阳性对照质粒pGADT7/pGBKT7-53、阴性对照pGADT7/pGBKT7-Lam 分别共转化到AH109 感受态细胞，转化产物分别涂布于SD/-Leu -Trp、SD/Leu -Trp -His、SD/Leu -Trp-His-Ade-营养缺陷型培养基， 于30倒置培养34d，观察菌落生长情况，用无菌牙签挑取平板上生长的菌落转接于SD/Leu-Trp-His-Ade-/X-Gal平板，于30继续培养，看其生长及变蓝情况，以鉴定NS3自身及与CP、SP、NSvc4 之间是否存在互作。目前，研究蛋白一蛋白相互作用最经典的方法当属酵母双杂交技术。该技术几乎能进行整个细胞内的蛋白质相互作用的筛选，包括膜蛋白、转录活性蛋白以及定位于不同亚细胞结构的蛋白。它具有简便、灵敏、高效、高通量和价格相对低廉的特点。但该方法也存在有一定的局限性。首先，许多已知的相互作用并没有在大规模的筛选中被鉴定出来，表明这种方法存在这较高的的假阴性，其主要原因有：筛选方法不同检测到的蛋白间的互作也不同。例如经典的酵母的双杂交系统只能检测到核内蛋白，对胞质蛋白和膜蛋白则检测不到；融合的报告蛋白很可能空间排列受阻，从而影响蛋白的互作；有些蛋白间的互作是瞬间发生的，目前一些方法很难检测到，高级的真核生物在酵母中表达的蛋白缺乏转录后修饰，因此发生的互作很难检测到；报告基因的缺陷；RNA聚合酶1的变化等等。其次，假阳性可以反映蛋白质间非特异性相互作用，也就是说捕获蛋白能与许多不同的诱饵蛋白相互作用，即薪性捕获，这可能是由于有些蛋白需要与多个蛋白质相互作用才能正常使用其功能，如分子伴侣；同时，诱饵蛋白和捕获蛋白可能存在自激活能力，不需要发生蛋白质间的互作就能激活报告基因的表达；有些蛋白存在于不同的组织中，或在发育的不同时间表达，或分布在细胞不同的区域，它们在正常情况下不