原核表达载体.doc

原核表达体系的构建一、实验材料（1）植物材料：拟南芥（2）载体及菌株：克隆及测序用载体为pMD18-T，购自Takara公司。宿主菌DH5。原核表达载体（pET30c ？）。（3）PCR引物：登陆GeneBank查找目的基因序列，以目的基因序列为模板设计引物。（4）药品试剂：反转录试剂盒（TaKaRa），质粒小提试剂盒（TIANGEN），胶回收试剂盒，Taq DNA聚合酶（TaKaRa），dNTPs（TaKaRa），限制性内切酶（TaKaRa），T4连接酶（TaKaRa），各种DNA和蛋白marker，各种抗生素类，二、方法（1）目的基因的获得（RT-PCR）：拟南芥叶片mRNA逆转录cDNAPCR基因（详见王希朝那份）；PCR产物用0.8%琼脂糖凝胶分离。 先设计好PCR的引物和PCR的反应程序。（2）克隆载体的构建：. 目的基因的切胶回收：在紫外灯下迅速用干净的手术刀切下含目的基因的琼脂糖凝胶块，放入已称重的离心管中，在保证目的基因全部回收的同时，应尽量减少胶的体积。计算凝胶重量（100 mg相当于100 l），加入3倍体积solution DE-A，75水浴6-8分钟，其间轻柔地颠倒离心管至胶完全融化。加入2倍体积solution DE-B，颠倒混匀，将溶液转移到吸附柱中，室温放置1 min，12000 rpm离心1 min。取下吸附柱，倒掉收集管中的废液，加入600 l Wash solution，室温12000 rpm离心30 s。重复步骤一次。取下吸附柱，倒掉收集管中的废液，室温12000 rpm离心1 min。将吸附柱放入新的1.5 mL灭菌离心管中，在柱膜中央加入30 l 75预热的ddH2O，室温放置2 min，12000 rpm离心1 min。离心管中的液体即为回收的目的基因片段，可立即使用或保存于-20备用。. 目的片断与克隆载体pMD18-T连接： pMD 19-T Simple Vector（T载体，小纸盒子中）1ulInsert DNA2ul 5ul dH2O2ulSolution I（冰中融化，小纸盒子中，跟T载体一起） 5ul（等量）16反应30min. E. coli DH5感受态细胞的制备：将E. coli DH5在LB平板上划线培养过夜。次日，挑取单克隆，接种到5 mL LB培养基中，37，200 r/min振荡培养过夜。将过夜培养的菌液1 mL加入到100 mL LB培养基中(1: 100)，培养2-3 h至OD600=0.5，转入预冷的无菌离心管中，冰上放置10 min，然后于4下3000 rpm离心10 min。弃去上清，用预冷的0.05 mol/L的无菌CaCl2 溶液10 mL轻轻悬浮细胞，冰上放置20 min，4下3000 rpm离心10 min。 弃去上清，加入4 mL预冷的含15%甘油的0.05 mol/L的CaCl2 溶液，轻轻悬浮细胞，冰上放置几分钟，即成感受态细胞悬液。感受态细胞分装成100 l的小份，于冰上备用，或液氮速冻贮存于-80。. 重组质粒转化E. coli DH5（热击法） 连接产物加至感受态E.coli DH52（200ul）或（100ul） 【非连接载体加2ul】 【加入后离火远点轻轻用手拨】冰上放置20min 42水浴热击90s 立即放置冰上2min（勿震荡） 于超净工作台加800ul LB培养液 37，150rpm预培养50min 6000rpm离心1min，吸除800ul上清；剩余液体用来悬浮沉淀 涂布LB+Amp平板上，37倒置培养12h（于超净工作台吹干液体）。. 挑取白色单克隆菌落，重悬于5 l ddH2O中，取其中1 l用于PCR鉴定。PCR反应体系和反应程序同上面获取目的基因的PCR一样。. 重组质粒的提取（TIANGEN质粒小提试剂盒，方法可以看试剂盒说明书） 将以上剩余的4 l菌液接种到5 mL含Amp抗生素的LB液体培养基中，37振荡培养过夜。取3 mL菌液，室温12000 rpm离心1 min。弃上清，加入250 l Solution I，重悬菌体细胞。加入250 l Solution，轻柔颠倒离心管4-6次。加入350 l Solution，轻柔颠倒离心管6-8次，此时应出现白色絮状沉淀，室温12000 rpm离心10 min。取上清（注意不要吸到蛋白），转入吸附柱，室温放置1 min，12000 rpm离心1 min。取下吸附柱，倒掉收集管中的废液，加入500 l Wash Solution，室温12000 rpm离心1 min。重复步骤一次。取下吸附柱，倒掉收集管中的废液，室温12000 rpm离心1 min。将吸附柱放入新的1.5 mL灭菌离心管中，在柱膜中央加入60 l 75预热的ddH2O，室温放置2 min，12000 rpm离心1 min。离心管中的液体即为质粒。可立即使用或保存于-20备用。. 重组质粒的酶切鉴定酶切反应体系、反应温度和反应时间根据内切酶的种类确定设计。酶切产物用0.8%琼脂糖凝胶分离。 . 重组质粒的目的基因的序列测定重组质粒由测序公司测序。 . 菌种保存取500l重组菌液加入等体积50%的无菌甘油(终浓度达到25%)，液氮速冻，-80保存。（3）目的基因的原核表达. 原核表达载体的构建 克隆载体的构建：必须考虑使用的克隆载体有无多克隆位点，没有就要特别设计一对上下游引物，分别带上酶切位点，以便插入原核表达载体上相应的多克隆位点。构建克隆载体的方法参见上面步骤。重组质粒和表达载体的酶切：酶切反应体系、反应温度和反应时间根据内切酶的种类确定设计。酶切产物用0.8%琼脂糖凝胶分离。 回收表达载体酶切片断和目的基因酶切片断： i. 在紫外灯下迅速用干净的手术刀切下含目的基因的琼脂糖凝胶块，放入已称重的离心管中，在保证目的基因全部回收的同时，应尽量减少胶的体积。ii. 计算凝胶重量（100 mg相当于100 l），加入3倍体积solution DE-A，75水浴6-8分钟，其间轻柔地颠倒离心管至胶完全融化。iii. 加入2倍体积solution DE-B，颠倒混匀，将溶液转移到吸附柱中，室温放置1 min，12000 rpm离心1 min。iv. 取下吸附柱，倒掉收集管中的废液，加入600 l Wash solution，室温12000 rpm离心30 s。v. 重复步骤一次。vi. 取下吸附柱，倒掉收集管中的废液，室温12000 rpm离心1 min。vii. 将吸附柱放入新的1.5 mL灭菌离心管中，在柱膜中央加入30 l 75预热的ddH2O，室温放置2 min，12000 rpm离心1 min。离心管中的液体即为回收的目的基因片段，可立即使用或保存于-20备用。 表达载体酶切大片断和目的基因的连接（根据连接酶说明书方法操作） 连接反应体系 反应液成分 体积10T4 Buffer 2.5 l ddH2O 15.5 lpET30c大片段 2 lSTS(salI/xhoI) 4 l T4 Ligase 1 l Total 25 l16过夜连接。 重组质粒转化E. coli 宿主菌（根据表达载体确定）（热击法） 连接产物加至感受态E.coli DH52（200ul）或（100ul） 【非连接载体加2ul】 【加入后离火远点轻轻用手拨】冰上放置20min 42水浴热击90s 立即放置冰上2min（勿震荡） 于超净工作台加800ul LB培养液 37，150rpm预培养50min 6000rpm离心1min，吸除800ul上清；剩余液体用来悬浮沉淀 涂布LB+Amp平板上，37倒置培养12h（于超净工作台吹干液体）。 转化菌的PCR鉴定（菌落PCR） 转化菌的酶切鉴定：转化菌菌液扩大培养，提取质粒，双酶切检测。 酶切反应体系、反应温度和反应时间根据内切酶的种类确定设计。酶切产物用0.8%琼脂糖凝胶分离。菌种保存取500l重组菌液加入等体积50%的无菌甘油(终浓度达到25%)，液氮速冻，-80保存。. 目的基因在E. coli表达载体宿主菌内的表达 SDS-PAGE蛋白胶配制 上层胶（3%）下层胶（12%）下层胶(10%) 下层胶(7.5%)ddH2O 1.085 mL 1.5 mL 1.85 mL 2.25 mL上层胶缓冲液 0.625 mL - - -上层胶储备液 0.75 mL - - -下层胶缓冲液 - 1.25 mL 1.25 mL 1.25 mL下层胶储备液 - 2 mL 1.65 mL 1.25 mL20% SDS 12.5 l 25 l 25 l 25 l10%过硫酸铵(AP) 25 l 50 l 50 l 50 lTEMED 5 l 7 l 2 l 7 lTotal 2.5 mL 5 mL 5 mL 5 mL在实验中，试用了不同浓度的下层胶，以获得最佳分离效果。 IPTG诱导蛋白表达（这个不确定）i. 将重组菌在含对应抗生素的LB平板上划线培养过夜。ii. 次日，挑取单克隆，接种到5 mL含对应抗生素的LB液体培养基中，37，200 r/min振荡培养过夜。iii. 将过夜培养的菌液100 l加入到10 mL LB培养基中(1: 100)，200 r/min振荡培养3 h左右至OD600=0.6。iv. 培养完毕后，取1 mL菌液12000 rpm离心，弃上清，200 l PBS悬浮。在剩余9 mL菌液中加100 mmol/L IPTG 54 l至终浓度0.6 mmol/L，此时记为0 h。v. 此后分别在1 h，2 h，3 h，4 h，5 h，6 h，9 h各取1 mL菌液，12000 rpm离心，弃上清，200 l PBS重悬。加2Loading buffer后沸水变性5 min。vi. SDS-PAGE检测蛋白表达。 检测重组蛋白可溶性（好像做多克隆抗体不用检测蛋白可溶性？） i. 将重组菌在含对应抗生素的LB平板上划线培养过夜。ii. 次日，挑取单克隆，接种到5 mL含对应抗生素的LB液体培养基中，37，200 r/min振荡培养过夜。iii. 将过夜培养的菌液100 l加入到10 mL LB培养基中(1: 100)，200 r/min振荡培养3 h左右至OD600=0.6。iv. 加入IPTG诱导至6 h，4，10000 g离心5 min。v