微藻转基因研究进展.doc

哈尔滨工业大学工学学士学位论文 工学学士毕业论文微藻转基因研究进展 冯仕洋哈尔滨工业大学2013年6月 生物工程工学学士毕业论文微藻转基因研究进展 导 师：郭长禄 申请学位级别：工学学士 学科、专业：生物工程 所 在 单 位：海洋科学与技术学院 答 辩 日 期：2013年6月 授予学位单位：哈尔滨工业大学A Thesis for the Degree of B. EngResearch progress of microalgae genetically modifiedCandidate：Shiyang Feng Supervisor：Changlu Guo Academic Degree Applied for: forco: for：Bachelor of EngineeringSpecialty：Biology EngineeringDate of Oral Examination：June, 2013University：Harbin Institute of Technology 哈尔滨工业大学学士学位论文 摘要摘 要 微藻是一类单细胞水生生物，在水产养殖、制药、营养和生物燃料等领域都有着巨大的潜在使用价值。自上世纪报告莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)中存在稳定的基因转化以来，转基因微藻的研究得到了迅速的大规模发展。通过转基因技术，获得新的微藻品种、生产外源性物质、提高产品产率，并最终满足快速发展的市场需求已成为微藻转基因重要的研究目标。 本文从转基因微藻的种类、转基因过程、以及转基因微藻的应用及其展望等方面概述了国内外转基因微藻的研究进展。同时还分析了提高外源基因表达效率和转基因微藻生长速率的各种方法，以利于转基因微藻应用于大规模工业生产。关键词：微藻；转基因；药物基因；筛选标记；外源基因表达；应用哈尔滨工业大学学士学位论文 外文摘要AbstractMicroalgae are a group of unicellular aquatic organisms, having great potential in a number of areas including aquaculture, pharmaceuticals, nutrition, and biofuels. Since last century, the first time stable genetic transformation was reported in Chlamydomonas reinhardtii, genetic transformation of microalgae has been brought to fruition within quite short time. The overarching goal of microalgae biotechnology is to cultivate new species, produce external substances, and enhance the productivity of traditional algal compounds so as to meet the demands of a rapidly growing market. The aim of this review is to synthesize the overall progress on microalgal transformation in the following aspects: the introduction of transgenic microalgae; the process of genetically modified;accomplished biotechnological applications and prospect. At the same time, it analyzed various methods of increasing in the exogenous gene expression efficiency and the growth rates of transgenic microalgae. And this analyzation is good for large-scale industrial production of transgenic microalgae.Key words: Transgenic microalgae; Transform; Therapeutic genes; Screening marker; Exogenous gene expression; Application哈尔滨工业大学学士学位论文 目录目 录摘 要IABSTRACTII第一章 转基因微藻简介21.1 转基因微藻21.2 转基因微藻种类21.2.1 蓝藻门21.2.2 绿藻门41.2.3 硅藻门61.2.4 甲藻门7第二章 微藻转基因过程82.1 核转化82.1.1 筛选和制备目的基因82.1.2 构建表达载体92.1.3 成功的核转化方法 102.1.4 转化子的筛选152.1.5 转化子的分子检测162.2 叶绿体转化222.2.1 叶绿体转化的方法22第三章 转基因微藻的应用243.1 外源基因表达和微藻生长速率的提高243.1.1 微藻生物量的测定243.1.2 外源基因表达与转基因微藻生长速率的提高的策略253.2 转基因微藻的应用的介绍323.2.1 生物能源323.2.2 污水治理333.2.3 生物农药杀灭害虫343.2.4 医药工业343.2.5 动物饲料353.2.6 生物传感器36第四章 转基因微藻的展望37致 谢39参考文献41附 录480哈尔滨工业大学学士学位论文 第一章 可转基因微藻的简介第一章 转基因微藻简介1.1 转基因微藻微藻是一类低等植物，分为原核生物和真核生物（冯等，2004），通常是指含有叶绿素A并能进行光合作用的微生物的总称（秦等，2010）。藻类基因工程是以藻类为研究对象将某种生物基因通过基因载体或其他手段运送到藻活细胞中，并使之增殖(克隆)和行使正常的功能(表达)，从而创造出藻类新品种的遗传技术（汪等，2007）。微藻种类繁多，截至2012年，全球已知的微藻种类达两万多种。微藻广泛分布于海洋、淡水湖泊等水域中，可以为生物工程研究提供大量的素材。且微藻以其世代短与富含耐受性基因的特点，成为生物技术关注的热点。1.2 转基因微藻种类莱茵哈德衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)首次被报告了在叶绿体和核之间具有稳定基因水平的转化能力，此后随着转化所需的筛选标记、启动子和表达机制等的研究深入，微藻转基因得到了长足的发展，但直到目前为止只有少数的微藻能够成功有效的转基因。真核生物微藻属中稳定的核转化已报告的有3种:绿藻、硅藻、甲藻，也有红藻叶绿体转化成功的报道。（冯等，2004），同时也培育了转基因金藻。原核的蓝藻也常被用作转基因宿主细胞。1.2.1 蓝藻门 蓝藻又称蓝细菌，是一类可进行光合放氧的原核生物，是所有藻类生物中最简单、最原始的一种。其光合机制与高等植物的叶绿体类似，有些种类还具有能固氮、氢代谢的异型胞。蓝藻的细胞结构和遗传特性与革兰氏阴性细菌类似，自1973年发现蓝藻质粒以来，已有50余种单细胞或丝状蓝藻被证明含有质粒。质粒数目从110个不等，大小在1.3130 Kb之间，但只在极少数淡水蓝藻中找到质粒编码功能的证据，一般认为蓝藻质粒属隐秘型质粒（童等，2006）。蓝藻有独立的遗传结构质粒和天然转化与重组系统,为开展基因工程研究带来了诸多便利条件。1981年首次在蓝藻中表达外源基因获得成功,1996年聚胞藻PCC 6803作为第一个光合生物完成了基因组全序列测定,蓝藻的研究一直处于整个生物学的前沿（席等，2010）。蓝藻既具有像植物一样利用廉价的无机原料进行光合作用的功能，又具有微生物的适应性强、生长快的特点，且部分蓝藻不含有毒蛋白，以及蓝藻细胞表达的外源基因产物不形成包含体等特点，使得通过转基因蓝藻制备药物的下游加工过程大大简化，这些优势都使蓝藻成为理想的基因工程模式生物，且具有潜在的经济价值和社会效益（魏等，2004；汪等，2005）。蓝藻是继大肠杆菌和酵母菌后，新一代的转外源基因微生物宿主（赵等，2006）。但是，蓝藻基因工程也存在两个问题：一是对于蓝藻门繁多的种类来说，只有少数的几种蓝藻可被用于转化；二是外源基因在这些可转化蓝藻中的表达效率并不高（魏等，2004）。目前常见的用于基因工程的蓝藻有鱼腥藻(Anabaena)、聚球藻(SynechococcuS)和螺旋藻（Spirulina）等。1.2.1.1 鱼腥藻鱼腥藻属是蓝藻门念珠藻科中的一员，鱼腥藻主要由两种形状不同的细胞组成，即营养细胞和异形细胞。一连串形状较小的细胞称之为营养细胞，而形态较大的细胞称为异形细胞。营养细胞能进行类似于高等植物的光合作用，异形细胞则能进行固氮作用，异性细胞常间生。紧靠异性细胞之间有呈圆柱形的休眠孢子，休眠孢子可以抵御不良环境，当条件适宜时则可脱落而萌发成为新个体。鱼腥藻有些种可以固氮，有些种也会产生毒素。鱼腥藻不仅是光能自养型生物，同时它也能在光照条件下利用某些外源有机物进行生长，即混合营养型生长；甚至少数蓝藻还能在完全无光的条件下利用外源有机物进行化能异养型生长（邓等，2006）。目前已经有多种基因成功导入了鱼腥藻细胞体内，大多数是药用基因，如 胸腺素A1基因、人粒细胞集落刺激因子（hGCSF）基因（李等，2005）、肿瘤细胞坏死因子基因（刘等，2004）等。1.2.1.2 螺旋藻螺旋藻为一类单细胞或多细胞丝状蓝藻，含有大量的蛋白质及多种生物学活性物质，具有较高的营养价值和独特的药理作用，是众所周知的优良天然营养源（徐等，2002）。螺旋藻细胞具有使蛋白质高效表达的机制，且能容受高浓度的单一蛋白，内源蛋白更新速度慢，对外源蛋白质容受力高，繁殖迅速，再生快，培养条件简单，成本低廉等诸多优点，而使螺旋藻成为了备受关注的生物反应器材料（Lou等，1996）。但是，由于螺旋藻细胞内存在高活性的核酸酶和多种限制性内切酶，阻止了外源DNA的转入和整合。另外，缺乏良好的重组系统和有效筛选标记也使得螺旋藻转基因很难进行（徐等，2001）。成功转化螺旋藻的基因有，胸腺素基因（徐等，2002）和萤火虫荧光素酶基因（茅等，2000）等。1.2.1.3 聚球藻聚球藻是蓝藻中报道成功表达外源基因最多的一个，聚球藻中无异形细胞分化的单细胞藻株，在对数生长期能够有效吸收外源DNA（魏等，2004）。到目前为止已成功表达了人铜锌超氧化物歧化酶基因（周等，2006）、小鼠金属硫蛋白I基因（曾等，2008）、人尿激酶原基因（滕等，2005）、对虾白斑病毒基因VP28（Hu等，2005）、胸腺素1基因（汪等，2007）、耐盐基因（刘等，2002）、人表皮生长因子（施等，2001）等。1.2.2 绿藻门 绿藻是一种真核植物，富含叶绿素a、叶绿素b、叶黄素和胡萝卜素，且比例与种子植物相近。细胞壁由两层纤维素与果胶组成。细胞分裂形式是无中心粒的有丝分裂，且以四分裂形式分裂。绿藻作为真核生物，有自己的细胞器，有些绿藻不但可以进行核转化，还可以进行叶绿体转化。已成功进行转基因的绿藻有衣藻(Chamydamonas)、盐藻(Dunaliella)、小球藻(Chlorella)等。1.2.2.1 衣藻 衣藻为真核单细胞生物，具有两条等长的鞭毛，有一个红色眼点（周等，2004）。衣藻素有“绿色酵母”之称（张等，2007），是目前少数三套基因组(细胞核、叶绿体、线粒体)都能进行遗传转化的生物（胡等，2005）。衣藻序列已经完全测得序列结构比较清楚利于遗传操作：培养条件简单，可以大规模培养，易于工业化生产（Scott等，2005）。核转化与叶绿体转化方法成熟，基因表达产物下游纯化程序简单，生产成本低廉。衣藻作为真核生物，可以对真核蛋白质进行准确的翻译后加工(如：正确的折叠与糖基化等)；衣藻本身不带有对人体有害的病毒、细菌等，这就使得其表达的产物不会含有毒素等有害物质，从而简化下游纯化过程，降低了成本而提高了效率（张等，2007）。以上这些优点使衣藻成为典型的模式生物。 王潮岗等（2004）通过构建依赖pHbB基因(NADpH的乙酰乙酰CoA还原酶)的表达载体，将pHbB基因导入细胞壁缺陷的莱茵衣藻中，得到了表达pHbB基因且具有转录活性的转基因藻株。杨宗岐等（2006）通过构建来源于Pyrococcus furiosus的耐高温淀粉酶基因的表达载体p64A，成功地将该淀粉酶基因整合入衣藻叶绿体基因组并成功表达。胡章立等（2005）证明，以rbcS2序列为启动子的pH105是一个高效、可诱导的外源基因表达载体，为利用莱茵衣藻开发生物反应器奠定了基础。邓旭等（2007）证明，转基因衣藻抗重金属离子的能力和对Cd2+的富集能力都比野生衣藻强。1.2.2.2 盐藻盐藻又称杜氏藻，是一类极端耐盐的单细胞真核绿藻，属于真绿藻纲、杜氏藻目、杜氏藻科、杜氏藻属（邓等，2007）。盐藻没有细胞壁，原生质外面仅有一层糖蛋白外膜，由于缺乏纤维素细胞壁的束缚，使得盐藻在不同环境下有不同的形态。盐藻是极其耐盐的，可以在0.055 mol/L氯化钠的极端环境中生存。盐藻属于光合自养生物，能利用简单的培养基进行培养，细胞内富含胡萝卜素、甘油、蛋白质等营养物质。盐藻具有转录和翻译后的加工能力，可以使外源基因表达正常有活性的蛋白产物。用盐藻生产目的蛋白有经济廉价、简单有效、安全可靠等特点，且由于它能在高盐条件下培养，所以也不会污染其他的微生物(李等，2005)。耿德责等（2002）第一次利用电击法成功的将一葡糖苷酸酶(GUS)基因转入杜氏盐藻细胞内进行瞬间表达，并比较了CaMV35S、Ubil、Ubil、CaMV35S Ubi1和CaMv35Ubi 5种启动子的转化效率，结果表明，Ubil启动子转化效率最高，最佳转化条件为：培养5天、脉冲电压6kV、脉冲持续0.05s，脉冲210次。2006年10月30日郑州大学医学实验中心的科研成果转基因盐藻生物反应器，被美国专利商标局批准授权并颁发专利授权证书（2006）。冯书营等（2008）成功制备了人canstatin转基因盐藻株，为实现canstatin蛋白在肿瘤治疗上的临床应用奠定了基础。刘红艳等（2006）获得整合有SBRCTA1 基因且可正常转录的转基因盐藻藻株，并用该转基因藻株进行了启动子CaMV35S和Ubil的促转化效率的对比实验，结果表明Ubil启动子的转化效率更高，可用于转基因盐藻防龋疫苗的研制。吕玉民等（2004）用基因枪法将抗除草剂基因（bar基因）导入到杜氏盐藻细胞内，研究了不同轰击条件和启动子对杜氏盐藻转基因的影响，结果表明：在氦气压力为100 L/min条件下微弹轰击2次，可能是基因枪法转化杜氏盐藻的较好转化条件。在转基因杜氏盐藻研究中，DCAI（双拷贝碳酸酐酶基因）基因启动子可能是一种较为理想的启动子类型。1,2.2.3 小球藻小球藻（Chlorella）为绿藻门小球藻属普生性单细胞绿藻，是一种球形单细胞淡水藻类，直径38m，是地球上最早的生命之一，出现在20多亿年前，基因始终没有变化，是一种高效的光合植物，以光合自养生长繁殖，分布极广。小球藻除了含有丰富的蛋白质、维生素、矿物质、食物纤维、核酸及叶绿素外，还富含生物活性物质糖蛋白、多糖体以及高达13%的核酸等物质。小球藻对身体的强健作用比螺旋藻要强好几倍。小球藻对心、肝、肾肺、肠胃、皮肤、感冒发烧等病都有很好的效果。小球藻抗病毒的能力极为强悍，吸毒排毒的能力也极强。小球藻为世界上公认的健康食品，全世界微藻产业中产量最多的品种。 小球藻可以采用光自养、异养、混合营养3种营养模式进行培养，但光自养培养具有生长速率慢、易被微生物污染、很难保持纯培养等缺点（Shi等，1999；Liang等，2000）。小球藻是少数几个能进行异养培养的藻种之一，异养的生长速率比光自养快得多(Lin等，1999；Chen等，1991)。混合营养培养也是获得高密度微藻的另一有效途径，但其需要光照。韩兴梅等（2006）通过在250 ml摇瓶中研究光自养、异养、混合营养3种营养模式对转兔防御素基因(NP1)小球藻( chlorella)的生长、NPl表达量、总蛋白质含量、pH、葡萄糖消耗以及光衰减等几个方面的影响。结果表明，异养培养为转NP1基因小球藻的最适营养模式。1.2.3 硅藻门硅藻是一种常见的真核藻类，它的细胞壁都是由果胶和二氧化硅组成的，没有一般植物细胞壁的主要成分纤维素，硅藻的一个主要特点就是细胞外覆硅质（主要是二氧化硅）的细胞壁，它的硅质细胞壁上有呈辐射对称或左右对称排列的花纹。具有上下半壳套合而成的壳体。由于硅藻含有丰富的硅元素，使之成为许多医药产品和水产养殖的来源。迄今为止，成功转化的硅藻有：三角褐指藻(P. tricornutum)（Apt，1996），隐形小环藻(Cyclotella cryptica)，腐生舟形藻(Navicula sapropHila)（Dunahay，1995），仿锤细筒藻 (Cylindrotheca fusiformis)（Fischer，1999）和威氏海链藻(Thalassiosira weissflogii)（Falciatore，1999）。1.2.4 甲藻门甲藻又称“双鞭甲藻”，是一类单细胞具有双鞭毛的集合群。少数群体或具分枝的丝状体；多数有2条不等长，排列不相称的鞭毛。甲藻有一层由厚的纤维素组成的细胞壁，又称壳，可分为上壳和下壳。甲藻有一个细胞核，一个或多个核仁，染色体排列如串珠状或片层状。甲藻对水温的要求较其他藻类明显，在光照和水温适宜时，甲藻能够在短时期内大量繁殖，与硅藻一样为海洋动物的主要饵料，故有“海洋牧草”之称。但也时常由于突然死亡而造成毒害，甲藻有些能生成发光物质，另一些能产生对脊椎动物和人有毒的化合物。目前，已有前沟藻(AmpHidinium)和共生甲藻(Symbiodinium)（Lohuis，1998）被成功转化。49哈尔滨工业大学学士学位论文 第二章 微藻转基因过程的介绍 第二章 微藻转基因过程 藻类基因工程是以藻类为研究对象将某种生物基因通过基因载体或其他手段运送到微藻活细胞中，并使之增殖(克隆)和行使正常的功能(表达)，从而创造出藻类新品种的遗传技术。对于微藻转基因可分为核转化、叶绿体转化两种。 2.1核转化 所谓的核转化就是外源基因被导入到宿主细胞后被整合到宿主藻的细胞核染色体基因组中核转化的一般流程是（1）筛选和制备目的基因；（2）构建表达载体；（3）外源基因转化宿主；（4）转化子的筛选；（5）转化子的分子检测；(6)扩大培养用于生产或研究。2.1.1 筛选和制备目的基因目的基因的制备一般是根据已知目的基因的序列设计引物，进行PCR体外扩增获得大量目的基因片段。也可以已知蛋白质的多肽氨基酸序列，通过密码子推算出目的基因的mRNA序列，再通过逆转录PCR得到目的基因，但此方法得到的DNA片段中缺少非转录区和内含子等片段。侯李君通过GenBank查得蓝藻鱼腥藻7120中PEPC基因的全序列，从中选择基因片段，从起始密码子AUG开始大约670 bp的片段。进而设计引物：上游P1：5CATGGAGCArITITIG1TrACGGC 3，下游P2：3ACGGATCCATCCAGCACAG 5引入一个BamHI位点GGATCC；以蓝藻Anabaena spPCC 7120总基因组为模板用PCR法扩增片段，将该片段用PCR产物快速回收试剂盒，连接到pMDl8T载体上（侯等，2008）。利用PCR也可以在不改变目的蛋白氨基酸序列的前提下，利用密码子的简并性稍微改变目的基因的几个碱基。李清艳等利用PCR改变了人粒细胞集落刺激因子基因的几个碱基，冰果间穿梭表达载体转入鱼腥藻细胞，使很难在鱼腥藻细胞内表达的人粒细胞集落刺激因子基因得到高效表达（李等，2005）。2.1.2 构建表达载体藻类转基因的目的一般是通过基因工程手段获得高表达的目的基因产物，如利用转基因聚球藻生产胸腺素和人粒细胞集落刺激因子等，迄今构建的蓝藻质粒载体都是嵌入细菌遗传标记的重组质粒，能在细菌和蓝藻中复制，故称为穿梭载体。2.1.2.1 表达载体的结构特点表达载体的目的是将目的基因运载入宿主藻细胞内，并使之表达。所以表达载体不仅拥有克隆载体的复制起始位点、多克隆位点和标记基因，还含有转录所需的启动子等结构。原核藻类（蓝藻）的表达性载体的一般结构是：复制起始位点、多克隆位点、标记基因、启动子（由转录起始点、10序列、35序列以及10与35序列之间的序列组成）、终止子（在操纵子的3端提供转录终止信号，分为依赖因子的终止子和不依赖因子的终止子）、SD序列（原核基因起始密码子AUG上游310bp处的序列，是原核藻类核糖体识别和结合的位点）、衰减子（在某些前导序列中带有控制蛋白质合成速率的调节区）。与原核细胞表达载体相比，真核藻类细胞表达载体更加复杂。真核微藻表达载体的一般特征是：（1）、多克隆位点；（2）、复制起始稳点；（3）、标记基因；（4）、启动子元件，大多含有TATAbox和上游启动子元件两种识别序列。（5）、增强子元件，增强子能够增强启动子转录活性；（6）、加尾信号，大多数真核mRNA在3端都有多聚A尾巴，这就是在加微信号的作用下通过polyA聚合酶催化产生的；（7）、剪接信号；（8）、与翻译相关的元件（陈等，2007）。2.1.2.2 表达载体的构建载体质粒上拥有限制性内切酶酶切位点，利用相应的限制性内切酶切割载体和目的基因片段，使其拥有互补的粘性末端，再利用连接酶使目的基因连接到表达载体上，表达载体可携带目的基因进入宿主藻细胞内，使外源基因表达。表达载体一般拥有两个标记基因，一个指示载体进入宿主细胞；另一个指示外源基因是否成功插入载体中。穿梭表达载体，此类载体上含有两个或两个以上的复制起点，但他们所适用的宿主不同，可能一个复制起点适用于蓝藻，而另外的复制起点适用于绿藻。这种可以在两种生物间来回穿梭的载体被称为穿梭载体。通过构建穿梭表达载体，利用三亲接合转移法可成功将外源基因导入蓝藻细胞，与蓝藻染色体整合或与蓝藻内源质粒发生同源重组，从而稳定表达（李等，2005）。 （张等，2007）描述了构建表达穿梭载体的过程：（1）、首先用限制性内切酶BamH1和EcoR1切割目的基因b型GCSF基因和中间载体PRL439，再用T4 DNA连接酶将b型GCSF基因与中间载体PRL439相连；（2）、用限制性内切酶EcoR1和Sal1切割质粒PRLGCSF和质粒PDC8，形成相同的粘性末端，再利用T4连接酶连接，形成表达穿梭载体PDCGCSFb。构建成功的PDCGCSFb质粒就是三亲接合转化中的运载质粒，通过接合质粒和辅助质粒运送到宿主藻细胞中实现转化。2.1.3 成功的核转化方法在表达载体构建成功后，就需要一定的方法将重组质粒送入宿主藻类细胞内，才能使外源基因整合到宿主基因组中，来发挥功能表达目的蛋白。微藻细胞表面大多有一层细胞壁，这就成为了微藻转基因过程中外源基因转移到受体藻细胞内的天然屏障，所有的转基因方法都是通过打破这一屏障来实现的。可行的微藻核转化方法有：基因枪转化法、玻璃珠转化法、电击转化法、碳化硅纤维转化法、激光微束穿孔法、多聚物介导法、低能离子束法、超声波转化法、显微注射法、自然转化法与三亲接合法等。在这些将外源DNA导入微藻的技术中，最简单的方法为玻璃珠法。2.1.3.1 基因枪转化法基因枪转化法：利用基因枪传递的高压氦气加速包被DNA的金属微粒(金粉或钨粉)，在基因枪的真空室(轰击室)轰击受体细胞，从而把目的DNA导入受体细胞。基因枪法操作简便、可重复性高、拷贝数多、对宿主选择性不大（王等，2005），常用于植物细胞和组织细胞的转化，也用于真核细胞或原核生物细胞器的转化，该方法在转化绿藻（Mayfield等，2004；Cheng等，2005）、硅藻（Fischer等，1999；Falciatore，1999）中均获得了成功。2.1.3.2 玻璃珠转化法染色体转化最为有效、最简便的方法为玻璃珠研磨法。玻璃珠转化法最初由Kindle等（1990；1991）创立，用于莱茵衣藻的核转化和叶绿体转化，主要依靠振荡产生的剪切力瞬间损伤细胞，从而使外源DNA 进入细胞。用玻璃珠转化法转化莱茵衣藻时，要先用自溶酶、纤维素酶和果胶酶处理藻细胞除去细胞壁。此方法操作简易，对设备要求不高，但转化效率不如基因枪转化法，且需微藻细胞壁缺失（Dunahay等，1993）。2.1.3.3 电击转化法电击转化法又称电脉冲法：脉冲电场改变细胞膜的状态和通透性，形成可逆的瞬间通道，外源DNA由通道进入细胞。这个方法操作简单快速，转化率较高，常用于细菌、高等植物和藻类细胞的转化。聚球藻是第一个被电击法成功转化的海洋单细胞蓝藻，Brown等(1991)成功地运用电脉冲法转化莱茵衣藻核基因组。GUS基因在杜氏盐藻中的表达也常用此方法（Geng等，2003）。鱼腥藻、念珠藻都可用电击法转化。电击转化也广泛应用于一些蓝藻株系如鱼腥藻属、念珠藻属、眉藻属、聚球藻属与红藻门中的温泉红藻的转化，同时该方法也可用于杜氏盐藻和莱茵衣藻的转化。2.1.3.4 激光微束穿孔法将激光聚焦成微米级的微束照射细胞后，利用其热损伤效应使细胞壁上产生可恢复直径约0.50.7m的小孔，使加入到细胞培养基里的外源基因进入植物细胞，从而实现基因的转移。该法具有操作简便、适用性广、无宿主范围限制、能转化细胞器等优点。但该方法因仪器昂贵，转化率较低，故有待于进一步研究和完善。激光孔径小，为线粒体、叶绿体以及细胞质的遗传工程研究提供了方便。Weber等（1989）使用343 nm激光光束照射浸泡于DNA溶液中的油菜叶绿体，成功地将DNA转入叶绿体。同样用激光微束短时间照射微藻细胞，也能使外源基因进入微藻细胞，而不影响微藻存活（陈等，1998）。2.1.3.5 多聚物介导法Krens等(1982)首先建立多聚物介导法，在聚乙二醇(PEG)、多聚L鸟氨酸(plo)、磷酸钙及高pH值等条件下诱导原生质体摄取外源DNA分子。原因是多聚物（PEG）和二价阳离子(如Mg2+，Ca2+，Mn2+)及DNA常在原生质体表面形成沉淀颗粒，通过内吞作用进入细胞内部，发生同源重组。多聚物PEG 转化法操作简单、成本低、无需昂贵的基因转化仪器；所得到的转化体中，嵌合体很少；受体藻不受种类的限制，对已建立了原生质体再生体系的藻类都可采用；并且结果比较稳定，重复性好。但由于建立作物原生质体再生系统较为困难，加之PEG 转化法对原生质体活力的有害作用，使转化率低，一般在105103之间。将PEG 转化法与电击法、脂质体法和激光微束法等技术结合使用，可使转化率大大提高。2.1.3.6 碳化硅纤维转化法 碳化硅纤维法是将细胞或组织的培养物与质粒DNA及直径为0.6m，长度为1080 m的针状的碳化硅纤维混合，借助于在涡旋振荡引起的相互碰撞过程中纤维对细胞的穿刺作用，而将附着于纤维上的DNA导入细胞，实现植物细胞的转化，转化衣藻时，不用去除细胞壁。,碳化硅(SiC)细丝转化法是转化有细胞壁的硅藻细胞所必备的（Dreesen等，2010）。碳化硅纤维介导转化法是一种简单、快速的导入DNA进入植物完整细胞的方法。该方法操作简便，而且能较好的控制转化的DNA 数量。但也有一定的缺点：一是转化后细胞的生活率下降；二是这种方法现在只限于以悬浮细胞为受体的转化，三是对人体有危害。该转化方法已运用于前甲藻、双鞭毛藻等微藻。2.1.3.7 低能离子束法我国学者(杨等，1994)发现离子束对细胞壁有刻蚀作用，因而提出了离子束介导基因转化的设想。低能离子束介导外源基因转移的原理是：1、一定能量和剂量的离子束对微藻细胞的溅射作用破坏了它的细胞壁和细胞膜的结构，结果在局部产生了刻蚀或穿孔，从而使外源基因进入到细胞内；2、用于注入的正电荷离子部分中和了细胞表面的负电性，从而可以减弱细胞对带负电的外源基因的静电排斥力，使外源基因较容易的进入宿主藻细胞中；3、离子束的直接作用和某些间接作用使宿主藻细胞内的染色体DNA断裂，从而有利于外源基因插入整合到宿主基因组中（尹等，2001）。2.1.3.8 显微注射法利用显微注射仪将外源基因直接注入到已固定的植物细胞的细胞核或细胞质中，从而实现基因转移。显微注射中一个重要环节是固定受体细胞，只有在受体细胞固定的情况下，用显微注射仪才能准确地插入细胞内，而不产生偏移。目前人工固定的方法主要有3 种：（1）琼脂糖包埋法，即把低熔点的琼脂糖熔化，冷却到一定温度后将制备的细胞悬浮液混合于琼脂糖中，并使细胞体的一半埋在琼脂糖中而固定，一半暴露在琼脂糖的表面以便于进行显微注射；（2）多聚L赖氨酸粘连法，即先用多聚L赖氨酸处理玻片表面，由于多聚L赖氨酸对细胞有粘连作用。因此当分离的细胞或原生质体与玻片接触时，就可被固定在玻片上；（3）吸管支持法，即用一固定的毛细管将原生质体或细胞吸附在管口，起到固定作用。并且吸管可以旋转或移动位置，使操作者选择最佳位置进行注射。显微注射用的微针通常用拉针机制备，针尖直径以0.5m左右为宜。 SiC介导显微注射也可用于衣藻的转化（Gong等，2011）。显微注射在具备配套仪器和熟练操作技术的条件下，基因导入的速度快且操作简便，导入外源基因的大小片段无限制，且导入基因也无需载体。但是，在显微注射后，外源基因的整合是随机的，易引起突变和位置效应（吕，2005）。2.1.3.9 超声波转化法 超声波转化法的原理是利用超声波在溶液中产生的空穴作用而引发的局部高温高压和较大的切应力，使得空泡周围细胞的细胞壁和细胞膜出现可逆性孔洞或质膜透性的改变，从而使外源基因进入细胞（叶等，2006）。徐虹等（2002）将螺旋藻先用EDTA处理，再将螺旋藻置于冰水浴中，进行超声波处理(输出功率为30W，20s)，使藻丝断裂为510个细胞后，放入重组质粒冰浴三十分至一小时，再将螺旋藻放入Zarrouk液体培养基中，避光孵育过夜。这样重组质粒就会进入螺旋藻细胞，并整合到染色体上。2.1.3.10 三亲接合转移法接合是指借助于细胞间的接触将基因转移的一种现象。通过广谱接合质粒可以将基因从一种细胞移入另一种细胞中。典型的质粒载体，可使DNA转入到多种细菌和蓝藻中。接合转移已成为线性蓝藻中基因转移的方法，也可用于单细胞蓝藻（戴等，2008）。接合转移法涉及了三种质粒：运载质粒、辅助质粒和接合质粒。可转移到蓝藻中的运载质粒有一个称为oriT的位点，这个位点在转移前被辅助质粒产生的mob基因编码酶切开，然后被切开的运载质粒在接合质粒tra基因的作用下从供体细胞转移入受体细胞。在整个过程中要求辅助质粒、运载质粒与接合质粒必需先位于同一宿主细胞体内，在与受体细胞混合。获得的转基因蓝藻中，辅助质粒和接合质粒因无复制和整合而在蓝藻传代中逐渐丢失，而含有目的基因的杂交运载质粒因自主复制或与蓝藻染色体整合或与蓝藻细胞内的内源质粒发生同源重组而可以稳定遗传下去（陈等，2007）。李清艳等（2005）在制备转人粒细胞集落刺激因子鱼腥藻时的具体操作如下：（其中RP4质粒为接合质粒，pRL542质粒为辅助质粒，插入目的基因的载体为运载质粒。)(1)包含三种质粒的大肠杆菌的准备：在含相应抗生素的LB培养液中，分别接种含目的基因载体的HB101菌及含RP4质粒和pRL542辅助质粒的HB101菌，37培养，离心收集菌体，重悬于LB培养液中，等体积混合后备用。(2)蓝藻的准备：在三亲结合前2 d更换培养液，离心收集藻细胞，洗涤后重悬于BG11培养液中，做系列稀释。(3)三亲结合：将收集的细菌和藻细胞混合后，涂于放置在BG11培养平板上的纤维素脂微孔滤膜上。先在不含抗生素的培养平板上培养。然后连膜转移至含新霉素的BGII培养基上继续照光培养，直至转化子出现。自从wolk首创鱼腥藻接合转移系统以来，这个系统已被修改并可应用于很多藻株，如念珠藻属（Nostoc）、集胞藻属(Synechocystis)、聚球藻属(Synechococcus)、织线藻(Plectonema)等。2.1.3.11 自然转化法 在自然条件下，一些处在对数期的细胞能够主动的摄取外源基因并将其稳定遗传，该过程被称为自然转化。细胞的自然转化是一个受基因控制的生理现象，具备摄取外源基因能力的细胞，被称为感受态细胞(孙等，2012)。细胞主动吸收外源基因的障碍是细胞表面的细胞壁，章军等（2000）采用溶菌酶、纤维素酶和果胶酶混合处理法，首次较好地分离具活力的丝状蓝藻 Calothrix spPCC76Ol的原生质球，这为微藻的自然转化提供了便利。一些单细胞蓝藻，如:聚球藻7002、7942和集胞藻6803等，它们不需要诱导成感受态，即具有自然吸收外源DNA的能力。章军等（2001）将蓝藻培养至OD730达0.250.35时，取1520 ml离心收集藻细胞并用 10 % NaCl洗涤1次，离心浓缩藻细胞于原体积1/l0的新鲜BGI1培养基中，加入23 重组质粒，混匀，室温下避光孵育过夜，可得到转基因蓝藻。2.1.3.12 其他方法 病毒感染绿藻可以发展克隆和表达载体（章等，1991）。双链DNA病毒的大小(150330kb)允许较大的外源DNA片断导入微藻细胞中。然而，该方法能否应用需要进一步的研究。迄今为止，国内外广泛采用基因枪法、珠磨法和电穿孔法，同时也发展了一些新方法，如超声波法和人工转座子。人工小转座子通过转位酶处理后，转入目的细胞内，整合到目的细胞的染色体。Kojima和Kawata （2001）成功将小转座子转位酶复合体导入螺旋藻内。有些研究者认为转位酶法可用于真核微藻，但还没有这方面的报道。2.1.4 转化子的筛选 外源基因导入宿主细胞后，就需要筛选转化成功的藻细胞，在构建重组质粒时，载体上都携带着一个或多个标记基因，一般表达载体上携带两个标记基因，其中一个指示质粒是否进入受体细胞；另一个指示转入的载体是否是插入了目的基因的重组质粒。这些标记基因类型很多，如荧光素酶基因,氯霉素乙酰转移酶(CAT)基因,半乳糖苷酶(Lac Z)基因、抗除草剂（bar）基因、耐盐基因等等,通过酶的活性显示目的基因的表达。筛选的一般过程是将转化后的微藻混合后接种到含有相应抗生素或除草剂等具有筛选作用的成分的培养基上，经过一段时间培养，不含重组质粒的藻株因不能表达抗性基因，从而被抑制杀死，而转化子因含有重组质粒，可表达出抵抗抗生素或除草剂的物质（蛋白等），最后存活下来。这样就实现了转化子与非转化子的筛选过程。藻类基因工程研究中首先要解决的问题就是找出藻类细胞敏感的抗生素，并选择适当的标记基因（李等，2005）。黄健等人（2000）对6种海洋微藻，新月菱形藻（Nitzschia closterium Ehr.）、牟勒氏角刺藻（Chaetoceros muelleri Lemm.）、三角褐指藻（Phaeodactylum tricornutum Bohl.）、绿光等鞭金藻（Isochrysis galbana Parke 8701）、亚心形扁藻（Platymonas subcordiformis）和小球藻进行了对5种抗生素的敏感性实验。结果表明，不同的海洋微藻对各种抗生素的敏感性不同，其中氯霉素是6种海洋微藻普遍敏感的抗生素，它对6种海洋微藻72 h的半抑制浓度在56至289 mg/L之间。可以证明氯霉素是6种海洋微藻较理想的选择压力。因此CAT(氯霉素乙酰转移酶)基因可作为阳性选择标记基因广泛应用于海洋微藻的基因工程研究。赵兴贵等（2006）人在筛选转人细胞集落刺激因子鱼腥藻（鱼腥藻7120GCSF）时，将转基因藻7120GCSF在含新霉素25mg/L，250mg/L的培养基中交替培养，每周换一次培养液。因为转基因鱼腥藻的重组质粒上含有新霉素抗性基因，所以稳定的转基因鱼腥藻在含有新霉素的培养基上可以正常生长，而非正常转基因的鱼腥藻会被新霉素杀死，从而实现了对转基因鱼腥藻的筛选。然后将筛选后的蓝藻在含蔗糖的BG11培养基(蔗糖终浓度为0.5moL/L，4000rpm离心5min收集沉淀)中洗两次，划板纯化藻种。2.1.5 转化子的分子检测一般成功转化的微藻细胞，可以通过实验筛选出来。但为了更准确的了解外源基因在宿主细胞内的具体存在形式和表达状况，需要一些方法来对其进行检测。检测方向具体分为两个，第一，检测外源基因是否已经整合到宿主基因组中；第二，检测外源基因是否顺利表达出蛋白质。2.1.5.1 藻细胞破碎的方法 在检验转基因微藻细胞中外源基因的具体存在形式与表达状况时，首先需要破碎细胞，才能提取微藻基因和蛋白进行分子鉴定，准确的了解微藻转基因成功与否。一般来说微藻细胞的破碎方法有以下几种:(1) 高压匀浆破碎法 高压匀浆法是一种利用液体剪切力实现细胞破碎的方法。藻液经加压后，通过针形阀，通过阀芯和阀座之间的通道向撞击环撞击，然后从出阀口排出来。进口处要用冰调节温度维持在20摄氏度左右。(2) 超声波破碎法 超声波法是另一种剪切破碎法。频率超过15到20kHz（千赫兹）的超声波是人耳难以听到的，他可以使悬浮液中的微生物失活，在较大的输出功率下，可以破坏微藻的细胞。超声波破碎的原理和超声波转化相同，都与超声波引起的空穴现象有关。在相当高的输出声能下，液体中的每一个成核的部位都会形成许多的小气泡。在声波膨胀相中，这些气泡会增大，但在压缩相中，气泡会被压缩直至再也不能被压缩时，气泡就会破裂。气泡的破裂会释放出猛烈地震荡波，这些震荡波在液体中传播。在气泡发生空穴现象的破碎器件，会有大量的声波被转换成弹性波形式的机械能，从而近期局部剪切梯度使细胞破裂。声波破碎是细胞破碎的一种常见方法，在许多实验室中适用也很普遍。(3) 酶溶解法 利用酶（纤维素酶、果胶酶或自溶酶等）分解细胞壁上的特殊化学键的方法有很多优点，如产品释放的选择性高；对pH值和温度等外界条件要求低；不残留细胞碎片等，对于微藻细胞可用纤维素酶、自溶酶等酶类进行破壁。 （4）反复冻融法 冻融法是将细胞在低温下冷冻，然后在室温下融化，反复多次而使细胞破裂。因为在低温冷冻时，细胞膜上的疏水键被破坏了，从而导致细胞亲水性增加。同时，在细胞内的水会在低温下，形成冰晶，引起细胞膨胀，从而导致细胞破裂。（5）化学法 化学法是利用某些某些化学试剂溶解细胞壁或抽取细胞内某些组分的方法。酸、碱、某些表面活性剂及某些有机溶剂，都可以改变细胞壁和细胞膜的通透性，从而使内含物有选择的渗透出来。2.1.5.2 目的基因检测方法成功转化的外源基因有可能整合到宿主的染色体上，也可能是整合到宿主的内源质粒上。那么为了检测外源基因的具体状况，就需要提取宿主的基因组DNA和质粒。然后再对其进行分析。（1） PCR扩增检测技术PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶基因序列互补的两条寡聚核苷酸引物。PCR过程分为变性退火延伸三步骤，在应用PCR扩增时，需要根据目的基因的序列设计引物，以提取的DNA为模板进行扩增，PCR结束以后，将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，观察电泳条带，依靠marker判断是否存在目的基因电泳条带，以此初步判断目的基因是否整合到宿主的基因组中。（2） DNA斑点杂交技术 所谓的DNA斑点杂交技术是指将待测的DNA变性后点加在硝酸纤维素膜上（或尼龙膜），用已经用同位素标记的单链DNA探针进行杂交，洗膜后除去未与目的DNA结合的探针。经放射自显影观察是否有与探针结合的目的基因存在以及目的基因的多少。斑点杂交是将被检测标本点在膜上烘干固定，一张膜上可同时检测多个样品，耗时短，可做半定量分析。（3） Southern 印迹杂交技术 Southern 印迹杂交是研究DNA图谱的基本技术。Southern 印迹杂交的基本方法是将DNA标本用限制性内切酶切割后，经琼脂糖凝胶电泳分离断裂的DNA片段。然后经碱变性，使双链DNA变为单链DNA。用Tris缓冲液中和碱性，在高盐下通过虹吸作用将DNA从凝胶转印至硝酸纤维滤膜上，经烘干固定后可进行同位素标记的探针进行杂交。因为凝胶上目的基因的位置被准确的印迹到滤纸或尼龙膜上，在滤膜上的DNA被同位素标记的探针结合后，利用放射自显影技术可以确定与探针结合的目的基因的相对位置和大小，这样就可以确定目的基因含量的多少。2.1.5.3 外源基因转录水平上检测方法外源基因转录水平是指外源基因转录为mRNA的水平。主要通过对特定的mRNA分析，来大致估计外源基因的表达水平，但对外源基因转录水平上的分析不能替代翻译水平上的分析，因为还有翻译效率和RNA降解速度以及蛋白质剪切和分解速率的因素的影响。目前，常用的mRNA检测方法包括No