菌种鉴定范文.doc

菌种鉴定范文 中国工业微生物菌种保藏管理中心 CICC是我国唯一的国家级工业微生物菌种保藏管理中心，有近三十年菌种分类鉴定的历史，拥有先进的生物科学仪器和从事分类鉴定的专业化人员队伍。CICC承担全国工业微生物菌种的委托鉴定工作，所提供的菌种鉴定与评价技术服务获得“国家工商总局（SCIC）经营许可”，为国内科研机构、大专院校和生产企业等提供微生物菌种鉴定服务，涉及细菌、酵母、放线菌和丝状真菌等多类微生物。菌种鉴定手段包括形态学观察、生理生化特性鉴定、 BIOLOG碳源自动分析鉴定、分子生物学鉴定、API细菌数值鉴定、功能性分析及功能基因、RAPD、SSCP、TLC薄层层析、全细胞脂肪酸分析鉴定、（GC）mol测定、DNA/DNA同源性测定等。 鉴定项目 序号 服务项目 菌种类别 1 纯菌种鉴定（包含形态、理化、分子） 细菌、酵母、放线菌、丝状真菌 2 功能基因鉴定（pheS、gryA、atpD等） 乳杆菌、芽胞杆菌、双歧杆菌 3 产品微生物解析 4 产品污染菌种鉴定 5 菌群分析及纯种分离 6 细胞壁化学组分分析（氨基酸） 细菌、放线菌 7 细胞壁化学组分分析（糖） 细菌、放线菌 8 DNA（G+C ）mol含量 细菌、放线菌 9 DNA/DNA杂交 细菌、酵母、放线菌、丝状真菌 10 脂肪酸分析 细菌、放线菌 11 其它 鉴定手段 （1）常规鉴定 常规鉴定内容有形态特征和理化特性。形态特征包括显微形态和培养特征；理化特性包括营养类型、碳氮源利用能力、各种代谢反应、酶反应和血清学反应等。 （2）BIOLOG碳源自动分析鉴定 BIOLOG鉴定系统以微生物对不同碳源的利用情况为基础，检测微生物的特征指纹图谱，建立与微生物种类相对应的数据库。通过软件将待测微生物与数据库参比，得出鉴定结果。 该系统已获美国FDA认可，已逐步应用于食品和饮品企业、环保、海洋生物/水产品、制药、农业微生物、生物治理、化妆品、临床等领域的微生物鉴定试验中。 CICC拥有国内最全的BIOLOG数据库，涉及革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌、厌氧菌、酵母、丝状真菌在内近2000种微生物。 （3）分子生物学鉴定 应用分子生物学方法从遗传进化角度阐明微生物种群之间的分类学关系，是目前微生物分类学研究普遍采用的鉴定方法。CICC拥有微生物菌种分类鉴定的分子生物学实验室，配有PCR仪、高速冷冻离心机、电泳仪、HPLC、凝胶成像系统、紫外控温分析系统等先进仪器设备，以及DNAMAN、BIOEDIT、 CLUSTALX、TREEVIEW等序列分析软件。目前CICC可采用核酸序列分析法 分析细菌16S rDNA/16S-23S rDNA区间序列、酵母18S rDNA/26S rDNA（D1/D2）序列及丝状真菌的18S rDNA/ ITS1-5.8S-ITS2序列，提供科学的鉴定结果。 （4）API细菌数值鉴定系统 API鉴定系统涵盖15个鉴定系列，约有1000种生化反应，目前已可鉴定超过600种的细菌。鉴定过程中，可根据细菌所属类群选择适当的生理生化鉴定系列，通过软件将待测细菌与数据库参比，得出鉴定结果。 CICC目前可应用API 50CH系列、API 20 E系列、API Staph系列对乳酸杆菌（Lactobacillus sp.）和相关细菌、芽孢杆菌（Bacillus sp.）、葡萄球菌属 （Staphylocous sp.）、微球菌属（Microcous sp.）和库克菌属（Locuria sp.）进行鉴定。 （5）功能性分析及功能基因 CICC不断致力于工业微生物资源的功能及其功能基因研究，目前通过木聚糖酶、纤维素酶、葡萄糖异构酶、-甘露聚糖酶等功能基因的克隆进行菌种产酶的功能性分析。应用gyrA、atpD及pheS等看家基因于微生物菌种鉴定，在某些种、亚种、株间有较好的分辨效果。 （6）RAPD、SSCP技术 随着微生物菌种应用的进一步发展，在食品安全管理、生物产品出口认证、知识产权保护等行业需求日益增加，微生物菌种株水平的鉴别技术成为一个迫切需要解决的问题。 CICC采用随机扩增多态性DNA（Randomly amplified polymorphism DNA，RAPD）技术和单链构象多态性(Single Strand Conformation Polymorphism，SSCP）技术对微生物菌株进行鉴别。如采用RAPD技术能够对同一菌种原始菌株与诱变菌株进行鉴别，对诱变菌株知识产权保护具有重要意义；采用SSCP技术进行工业酒精酵母菌株的鉴别，此技术结合菌株发酵特性，在酒类生产的质量控制方面起到积极作用。 （7）TLC薄层层析 CICC将TLC薄层层析技术应用于微生物菌种鉴定，进行细菌、放线菌细胞壁化学组分分析（氨基酸、糖），作为划分属特征的重要鉴定技术手段，起到了良好的辅助作用。 （8）全细胞脂肪酸分析鉴定系统 采用Sherlock全自动细菌鉴定系统，通过对不同菌株的脂肪酸图谱进行分析，并与标准数据库进行比对，来鉴定细菌及酵母。该技术是细菌或酵母种水平鉴定的有效手段之一。 （9）（GC）mol及DNA/DNA杂交 CICC通过采用DU800核酸蛋白分析仪测定Tm值，从而得到微生物菌株的（GC）mol，并与模式菌株进行DNA/DNA同源性分析，该鉴定技术手段是多相鉴定的重要组成部分。 （10）其他手段 CICC可根据客户的特殊要求，为您量身定做，提供相应的技术服务，具体事宜请来电咨询。 菌种鉴定一般就只要提取基因组DNA，然后PCR扩增16srDNA片段，上GeneBank或者Eztaxon对比即可。一般序列相似度在97%以上就可以认为是同种细菌（当然也有例外，DNA序列仅仅是一个参考指标）。 菌种鉴定的分子生物学方法 16S rDNA测序鉴定菌种 一 原理 二 技术路线 该方法包括细菌基因组DNA提取、16S rDNA特异引物PCR扩增、扩增产物纯化、DNA测序、序列比对等步骤。具体技术路线如下： 三 方法步骤 （一）细菌基因组DNA提取（酶解法） 1. 挑取单菌落接种到10 mL LB培养基中37振荡过夜培养。 2. 取2 mL培养液到2 mLEP管中，8000 rpm离心2分钟后倒掉上清液。 3. 加140 LTE打散细菌，再加入60 L 10 mg/ml的溶菌酶。37放置10分钟。 4. 加入400 L Digestion Buffer，混匀。再加入3 L 蛋白酶K，混匀，55温育5分钟。 5. 加入260 L乙醇，混匀，全部转入UNIQ-10柱中。10000 rpm离心1分钟，倒去收集管内的液体。 6. 加入500 L 70乙醇（Wash Solution），10000 rpm离心0.5分钟。 7. 重复第六步。 8. 再10000 rpm离心2分钟彻底甩干乙醇。吸附柱转移到一个新的1.5mL的离心管。 9. 加入50L预热(60)的洗脱缓冲液，室温放置3分钟。12000 rpm离心2分钟，流下的液体即为基因组DNA。 10. 电泳。取3L溶液电泳检测质量。 注：如果待测菌为乳酸菌等不产生芽孢的菌类，且菌种非常纯净单一，则可以用直接煮沸法。 （二）PCR扩增 1. 根据16S rDNA序列设计保守的扩增引物。 27 F： 5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 1492 R： 5-GGTTACCTTGTTACGACTT-3 2. PCR扩增体系： 按下表加入引物、模板、Mix和ddH2O，建立PCR扩增体系（50L） 3. PCR将EP管放入PCR仪，盖好盖子，调好扩增条件。扩增程序如下为： 4. PCR拿出EP管，从中取出5 L反应产物，加入1 L上样缓冲液。点入预先制备好的1%的琼脂糖凝胶中。电泳30 min。在紫外灯下检测扩增结果。 （三）扩增片段的回收 根据上步实验结果，如果扩增产物为唯一条带，可直接回收产物。否则从琼脂糖凝胶中切 割核酸条带，并回收目的片段。 1. 称量一2mL的EP管质量，记录。 2. 在紫外灯下切割含目的条带的凝胶，放入2 mL的P管内，称量。计算凝胶质量。 3每100 mg凝胶加入100 L Binding Buffer，混匀。60温育至凝胶融化。 4全部转入UNIQ-10柱中。10000 rpm离心1分钟，倒去收集管内的液体。 5加入500 LBinding Buffer，10000 rpm离心1分钟，倒去收集管内的液体。 6加入70乙醇（Wash Solution），10000 rpm离心0.5分钟。 7再10000 rpm离心2分钟彻底甩干乙醇。吸附柱转移到一个新的1.5ml的离心管。 8加入30L预热的洗脱缓冲液，室温放置3分钟。12000 rpm离心2分钟，流下的液体即为回收的DNA片段。 （四）DNA片段测序 将回收的片段送至生物公司测序，测序引物为16S PCR引物。 （五）序列比对 将测序的结果在NCBI上进行序列比对，根据比对结果得出鉴定菌种。 *主要仪器： 1. PCR仪（用于进行PCR扩增反应，一般国产价格在2-3万元，最低也要1.8万左右） 2.电泳仪（用于琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，一般国产几个在3000左右） 附录：实验试剂表。 一、仪器与试剂 1 1. 二、实验过程 1、基因组DNA提取 按SK8255（细菌）、 SK8259（真菌）、 SK8257（酵母）试剂盒操作。 2、PCR扩增 2.2 PCR反应体系： 2.3 PCR循环条件： 3、凝胶电泳 1琼脂糖电泳，150V、100mA 20min电泳观察（见电泳图DNA Ladder Mix make）。16SrDNA18SrDNAITS 26S 4、纯化回收 PCR产物电泳条带切割所需DNA目的条带，纯化方式见附见说明书（SK8131 ），PCR产物用PCR引物直接测序。 如需要做克隆测序需要进行下面的步骤： 5、连接 ? 按Takara pMD18-T Vector 连接试剂盒操作。 6、感受态细胞的制备：（氯化钙法） 6.1 从于37培养16小时的新鲜平板中挑取一个单菌落，转到一个含有100 ml LB培养基的1 L烧瓶中。于37剧烈振摇培养3小时(旋转摇床，300转分)。 冰上放置10分钟，使培养物冷却至 0。 6.3 于 4 , 以4000转分离心10分钟，回收细胞。 6.4 倒出培养液，将管倒置1分钟,使最后残留的痕量培养液流尽。 6.5 以10 ml用冰预冷的 0.1 molL CaCl2重悬每份沉淀，放置于冰浴上。 6.6 于 4,，以4000 转分离心10分钟，回收细胞。 6.7 倒出培养液，将管倒置1分钟,使最后残留的痕量培养液流尽。 6.8 每50ml 初始培养物用 2 ml 用冰预冷的0.1 mol/L CaCl2(含20%甘油)重悬每份细胞沉淀。 6.9 将细胞分装成小份(100l/支)，放于-70冻存。 7、连接产物转化 7.1 取100?l感受态细胞，置于冰上，完全解冻后轻轻将细胞均匀悬浮。 7.2 加入10?l连接液，轻轻混匀。冰上放置30分钟。 7.3 42水浴热激90秒。冰上放置1520分钟。 7.4 加400?l LB培养基，37 200250 rpm振荡培养1小时。 7.5 用枪头吸取200 ?l培养菌液，涂布在预先用20?l 100 mM IPTG和100?l 20 mg/ml X-gal 涂布的氨苄青霉素平板上。 7.6 平板在37下正向放置1小时以吸收过多的液体，然后倒置培养过夜。 8、蓝白斑筛选 当外源DNA片段插入到pUC57中后，由于外源DNA的核酸序列存在改变了LacZ基因的编码，从而影响了其产物?半乳糖苷酶?片段的活性，因此重组克隆在X-gal/IPTG平板上呈现为白色，而非重组克隆呈蓝色，选择在IPTG/X-gal平板上生长的白色菌落， 9、质粒提取与测序 用M13+_引物扩增（体系如上）。.M13+/-引物测序 三、测序结果分析 16SrDNA 序列在核糖体数据库 上比对； 比对结果范例： domain Bacteria (0/20/1186838) （界） phylum Actinobacteria (0/20/176308)（门） class Actinobacteria (0/20/176308) （纲） subclass Actinobacteridae (0/20/167455) （亚纲） order Actinomycetales (0/20/1662