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中北大学2013届英文文献译文从葡萄酒泥中回收酒石酸并使用剩余固体作为乳酸菌的经济营养供体BEATRIZ RIVAS,ANA TORRADO,ANA BELE N MOLDES, AND JOSE MANUEL DOMI NGUEZ*摘要：采用响应曲面法和STATISTICA 5.0软件，针对从酿造白葡萄酒和红葡萄酒形成的葡萄酒泥中蒸馏回收酒石酸（TA）的工艺进行优化。通过蒸馏白葡萄酒泥，按次序溶解出来的酒石酸以及进一步溶解的酒石酸钙，其量高达最初含量的92.4。残余的葡萄酒泥就可以作为一种经济的营养素用于乳酸的生产，即：戊糖乳杆菌利用半纤维素的藤拍水解物CECT-4023作为碳源。经过蒸馏提取酒石酸后作为营养素的葡萄酒泥乳酸值为（18.4-18.9gL），总体积生产率为（0.82-0.84gL.h）,产品产量为（0.69-0.70gg）；而类似的乳酸杆菌利用一般介质，其产量分别为18.6gL，1.11gL.h和0.62gg,或者利用不经过蒸馏提取酒石酸的葡萄酒泥，其产量分别为(16.4-17.2gL)，(0.96-1.12gL.h)和(0.61-0.66gg)。该技术不仅有效地避免了污染物的处理问题，还代表着一种酒石酸的商业源以及经济营养素的生物技术工艺。关键字：葡萄酒泥；酒石酸；乳酸；戊糖乳杆菌1 介绍酿酒过程涉及从葡萄变为葡萄酒期间的所有步骤1。在西班牙，它虽然作为季节性的活动，但仍是最重要的农业活动之一，占农业生产总值的10%。大量产生的废物（18106m3年，这比法国或者意大利葡萄酒生产废水高出了6倍，其原因主要是它们的处理成本低）的特点是高含量的有机生物降解化合物和固体悬浮物，包括植物去梗后的遗骸，正变澄清的沼泽，挤压的蔗渣和不同阶段获得的葡萄酒泥。因此，将葡萄酒酿造产生的废物转化为有价值的产品是好的酿酒方式非常重要的一部分，它能够进一步减少废物处理问题，削减部分进口葡萄酒添加剂的成本，比如：酒石酸2。在一定程度的发酵之后，采用滗水过程将葡萄酒上清液和葡萄酒泥（含有死酵母，葡萄果渣，葡萄皮和籽）分离开。这些葡萄酒泥通常占5%（体积体积），可通过蒸馏用于成产酒精，经过蒸馏后，形成的残余物为蒸馏酿造酒泥3。在开始的时候，葡萄酒泥被认为能够作为动物的营养提供体，但是蒸馏后的葡萄酒泥经过离心得到的酵母具有极度贫穷的营养价值，因此它的这一作用4并不成立。可能是由于高含量的多酚与蛋白质结合使得它们能够被同化，或者是由于处理后的残余物存在有毒元素，并在脂类酵母中积累。在以前的作品中5- 8。我们提到，利用葡萄酒泥作为一种营养基质，为一些乳酸杆菌提供低廉的微生物必需营养源，实现了有趣的结果。直接使用的这些葡萄酒泥没有回收酒石酸。在乳酸菌中，乳酸杆菌属于最有趣的。由Mercier9等的提议，乳酸杆菌一般于复杂的基质中在实验室规模的条件下培养。这种培养基最主要的缺陷就是必须的营养物量以达到高的乳酸产量，同时这些营养素（包括酵母提取物和蛋白胨）也花费很高的价钱，它占了最终营养价值10的30%。因此，在发展工业过程中，这个难题阻碍了运用适当的研究为商业提供可行性建议。蒸馏后的葡萄酒泥的营养价值除了作为乳酸杆菌的营养物质以外，还有是得到最重要的副产物之一，酒石酸。酒石酸特殊的特点是其相对的微生物稳定性。腐败菌和酵母菌几乎不代谢降解酒石酸。因此，一些产品，例如：糖果，糕点，饼干，饮料包括苏打水，在不太需要化学和热保护的情况下，也会变得越来越稳定。作为一种纯粹的自然酸，酒石酸代替了柠檬酸或磷酸广泛应用于食品和饮料行业，同时也发现在制药工业11中有许多应用。此外，它还有许多其他的用途，从纺织业的着色到电镀以及制镜工业2，都有其应用。酒石酸12（20时0.53 g/L，60时1.16 g/L）和酒石酸氢钾（20时5.7 g/L，60时24 g/L）相比几乎不溶。虽然近来提出使用电渗析法13，溶剂萃取法14，活性炭吸附法15从葡萄酒泥中回收酒石酸，但是传统工艺涉及它的溶解性，和再加入钙盐形成酒石酸钙沉淀（CAT）16 17。如果最终产物是用在软饮料中作为酸化剂或者是作为药品、化妆品等13，就必须特别注意酒石酸的纯化过程。这些所有的工业废水都有可能回收数量可观的酒石酸盐。然而，有必要开发新技术来考虑去除酒石酸后所剩的严重污染物的处理方案，COD为5-20104 mg / L时，酒石酸含量相当于酒石酸在100-400 g/L12。这项工作评估从经过了红、白葡萄酒酿造技术后得到蒸馏酿造葡萄酒泥中回收酒石酸，然后进一步利用残余的葡萄酒泥作为戊糖乳杆菌CECT-4023的单一营养素，来利用半纤维素的藤拍水解物作为碳源。2 材料与方法葡萄酒泥的采集与储备：蒸馏前的葡萄酒泥（可回收酒精，用于生产浓烈芳香口味白酒）由Vitivin cola合作社（奥伦塞，西班牙）友情提供，贮存在4条件下。从白葡萄酒和红葡萄酒而来的蒸馏葡萄酒泥，分别在文中称为“蒸馏白葡萄酒泥”和“蒸馏红葡萄酒泥”。修剪废物和酸水解：裁剪本本地收集的废物，干燥，研磨至颗粒尺寸小于1，匀化到单一的特定程度以避免成分差异，储存备用。依照克斯18等人描述的方法，采用匀化的特定组分进行分析。修剪废物的成分组合如下：结果如下：提取物7.1；纤维素34.1；半纤维素19.0（木聚糖12.8，阿拉伯聚糖0.9，乙酰基5.3）；其他12.7。向液/固比为8g/g的修剪废物中加入3% H2SO4 ,在130的高压釜中反应15分钟，得到水解物为：17.4 g/L的木糖，11.1 g/L的葡萄糖，4.3 g/L的阿拉伯糖，4.0 g/L的乙酸，0.7 g/L的糠醛，以及0.1 g/L的羟甲基糠醛。实验设计和统计分析：从100mL葡萄酒泥中回收酒石酸的连续过程，如图1所示。第一步，加入HCl使酒石酸溶解，第二步加入钙盐形成酒石酸钙沉淀。这两步的研究都采用不完整的33因子设计方法19，实验数据利用STATISTICA 5.0软件进行响应曲面分析。在表1和表2两种设计都提供了无量纲和编码独立变量的信息。根据因变量和操作变量的相互关系，建立一个包括线性、互动的二次模型：是因变量，b表示的回归系数（根据实验数据使用最小二乘法多元回归计算），x表示自变量。图1：技术测定的流程图用红、白葡萄酒酿造得到的蒸馏葡萄酒泥作为原料进行实验，设计考虑的单因素变量分别为：反应温度（T），其取值范围是20-80；盐酸体积（37%），其取值范围是（1-10mL）；反应时间（t），其取值范围是5-30 min。标准化因次变量的取值范围是（1，1），变量的低、中、高三个水平分别以-1、0、1 进行编码。选取反应温度，盐酸体积，反应时间三个因素，分别以以 X1、X2、X3表示。编码与非编码变量之间的对应关系，是通过推导它们各自的变化范围形成线性方程而建立的（见表1）。在这项研究中，因变量Y1、Y2分别表示蒸馏白葡萄酒泥中溶解的酒石酸量、蒸馏红葡萄酒泥中溶解的酒石酸量。表1（a 独立变量）变量命名法单位变化范围温度T20-80HCl体积VmL1-10反应时间tmin5-30经过第一步实验设计得到最佳值后再进行第二步工序的独立变量因子设计。这一步考虑的新的独立变量因子是：氯化钙的浓度，变化范围是0-100 g/L；pH值，变化范围是0.5-9.5；反应时间，变化范围是10-240min。标准化因次变量的取值范围是（1，1），变量的低、中、高三个水平分别以-1、0、1 进行编码。选取氯化钙浓度，pH值，反应时间三个因素，分别以以 X4、X5、X6表示。根据编码和未编码变量之间的对应关系，建立了线性方程推导出它们各自的变化范围（见表2）。在这项研究中考虑的因变量Y3表示酒石酸的回收率。这些酒石酸产量的检测方法是：将生成的酒石酸钙沉淀先溶解于含有5mLHCl（37%）的100mL热水中，再使用高效液相色谱分析。表2L.微生物：具有西班牙文化的集合类型的戊糖乳杆菌CETE-4023T(ATCC8041)能选择性的发酵戊糖和己糖。根据Mercier等人的提议菌株应该在30条件下于平坦的完全培养基上培养12h。且该培养基组分为：葡萄糖20 g/L，酵母提取物5 g/L，蛋白胨10 g/L，醋酸钠5 g/L，柠檬酸钠2 g/L，K2HPO4 含量2 g/L MgSO47H2O含量0.58 g/L，MnSO4.H2O含量0,12 g/L, FeSO4.7H2O含量0.05 g/L,琼脂20 g/L。接种物的制备通过用5mL的无菌水进行细胞增溶来实现，加水稀释将接种浓度调整为4.0 g/L，其浓度的确定是在600nm处测量光密度值。乳酸发酵：加入碳酸钙中和酶解物，最终调节pH至6.5，再过滤使硫酸钙析出，从而和上清液分离开来。根据Mercier等人的建议，通过完全培养基来补充澄清酒液作为阳性对照组，或者将20 g/L的葡萄酒泥（有或无酒石酸的萃取）直接灭菌后作为发酵用培养基。根据以前的作品，加入浓度为20g/L葡萄酒泥100mL到250mL的三角烧瓶中。在发酵的初始阶段，加入30g/L的碳酸钙中和产生的乳酸，发酵的整个过程在35，150 rpm的轨道摇床中进行。取发酵给定时间后的2mL样品，在6000rpm条件下离心3min，保留上清液用于分析。实验数据按一式三份的方式报告。根据发酵时间对应斜率由高到低的剖面来计算乳酸和醋酸的体积生产率，以及QP,LA和 QP,AcH分析方法：使用高效液相色谱法和流速为0.4 mL/min的RI检测法测定，葡萄酒泥中的液体馏分（葡萄糖，乙醇，苹果酸，乳酸，乙酸，酒石酸，和甘油）以及发酵中消耗的葡萄糖量和生产的乳糖量。将葡萄酒泥中的干物质在120下烘箱中干燥至恒重，将葡萄酒泥灰烬在550烘箱中干燥至恒重。葡萄酒泥中碳和氮的含量分析使用的是Thermo Finnigan闪光元素分析仪1112系列，San Jose, CA.。葡萄酒泥灰烬中铜，镁，铁，锰，钙，铝，锌等的含量分析，采用原子吸收光谱仪。此前，根据意大利的Mega, Milestone, Bergamo试验，在1200微波中，0.1g葡萄酒泥灰烬消耗65的HNO35mL，30的H221mL，40的HF 0.5mL。酚类物质浓度的测定是在279 nm处用分光光度法进行测量，因为在该波长下的吸光度代表着可溶性木质素的存在量。3 结果与讨论葡萄酒泥特征：葡萄酒泥组成成分有固体(solid)，灰烬（ashes），碳和氮，其含量见表3。干燥物质主要有死酵母和固体悬浮物（其它微生物，胶体，有机物等）组成。氮和碳的含量分析根据葡萄酒泥的干燥部分而定，然而，灰烬含量则要将这些固体物质化为灰。很明显，白葡萄酒泥与红葡萄酒泥相比，具有更高百分含量的干燥物质和灰烬。葡萄酒泥中的碳和氮百分含量明显低于Rivas等人所报道的来自木糖醇生产工业的死酵母（它的含量分别为C: 42.2-46.2,N: 5.7-6.3%）。之所以有这样一个事实是因为，葡萄酒泥中不仅含有死酵母，还有土、葡萄皮、葡萄籽等。Ziegler也测定过葡萄酒泥中氮含量的百分比，得到向类似的结果，含量为：3 -6%。表3数据表明，4次重复的平均值。标准偏差分别低于2.8的平均值。有机化合物：两种葡萄酒泥中葡萄糖，乙醇，苹果酸，乳酸，乙酸，酒石酸，和甘油的浓度见表4。由表可看出，在各种情况下都没有检测到葡萄糖的存在，这就说明它在发酵过程中被消耗而转化为了乙醇。但是如表所示乙醇的含量依旧9 g/L，主要原因是在蒸馏葡萄酒泥以获得葡萄酒酒精时，乙醇挥发。苹果酸的缺乏可能与存储过程中的苹果酸-乳酸发酵或者是其他的发酵有关，也有可能是由于成熟度高的葡萄中含有葡萄液糖。苹果酸-乳酸发酵能够有效地降低葡萄酒的酸度，使它具有更好的风味和稳定性。发酵过程是通过细菌，主要是酒类球菌的作用，使苹果酸脱羧形成乳酸。苹果酸-乳酸发酵的进行程度以及最终乳酸的含量与葡萄酒泥中多酚类化合物：如棓酸，咖啡酸，阿魏酸，对香豆酸，儿茶素，槲皮素等的含量密切相关，这是因为它们对发酵具有阻碍作用。由表可看出，红葡萄酒泥中乳酸含量约为2.4 g/L，而白葡萄酒中的乳酸含量达到5.9 g/L。由于乙酸杆菌（氧化葡萄糖酸杆菌，醋酸菌，醋化醋杆菌）的保护作用，红葡萄酒泥中乙酸的浓度比白葡萄酒泥高出5倍。这些乙酸杆菌从葡萄成熟期开始到酿造葡萄酒的整个过程都存在着。因为红葡萄的酿造需要葡萄皮，这就提高了乙酸杆菌存在的可能性，从而使乙酸含量提高。在葡萄酒泥的液体部分中没有检测到酒石酸，是因为酒石酸以酒石酸钙，酒石酸氢钾的沉淀形式存在。葡萄酒泥从形成、处理到转入冷冻室，这段长时间的贮存过程有利促进了沉淀的形成。表4：数据表明，4次重复的平均值。标准偏差分别低于2.2的平均值。矿物质：葡萄酒泥干灰烬中中铜，镁，铁，锰，钙，铝，锌的浓度（）如表5所示。尽管红、白葡萄酒的酿造技术不同，但酒泥中含有的多种金属元素含量很相近。表5数据表明，4次重复的平均值。标准偏差均低于平均值的3.2%，没有检测到ND。从葡萄酒泥中回收酒石酸：酒石酸溶于HCl.从葡萄酒泥中的酒石酸钙和酒石酸氢钾沉淀中回收酒石酸，通常需要两个步骤（见图1）。第一步，酒石酸盐溶于HCl；第二步，提取出来的酒石酸选择性的形成酒石酸钙沉淀；也就是说通过这两步使得酒石酸和原料中的其他化合物分离开来。为了提高该过程的收率，我们对两个步骤都采用不完全析因设计进行优化。由于操作变量对从葡萄酒泥中回收酒石酸有比较敏感的影响作用，这会导致需要进行大量的实验工作，于是进行不完全析因设计。表6显示出了，不同实验条件即：反应温度X1，HCl用量X2，反应时间X3（以编码量表示）下，得到变量y1和y2的实验数据。这多组实验进行的顺序是随机的，用以减少系统误差对实验结果造成的影响。表7列出了回归系数和它们的统计显著性（基于测试）。在同一个表中分别包括了统计参数（r2和F）的测量相关性和模型的统计显著性。可以说，红、白葡萄酒泥这两个模型的统计参数都表现出良好的相关性。此外，图2中的a和b两个版图显示的该模型与实际试验拟合情况良好。表7：*表示显著性高于99%，*表示显著性高于95%，*表示显著性高于90%从表7中可以看出，关于自变量变化对于因变量的影响，最明显的就是HCl的用量，其次就是反应时间，它们不管是对白葡萄酒泥还是红葡萄酒泥都有很强烈的作用。因此，图3中版图a和b显示，选择在最经济的室温条件即20C下，测定不同反应时间和HCl用量时，酒石酸的浓度（y1和y2）。响应曲面图显示，y1和y2随着反应时间的延长而缓慢的连续性增加，而随HCl用量显著增加，当盐酸用量达到8mL以后，浓度提高较为缓慢。应用Microsoft Excel，当x120, x2 9.77, x39.0时.，从白葡萄酒泥中回收的酒石酸量y1最多能达到1 77.5 g/L。然而在类似的情况下，当x120, x2 8.07, x35.0时，从红葡萄酒泥中回收的酒石酸y2最高量下降到45.6 g/L。从葡萄酒泥中回收酒石酸：提取出的酒石酸沉降为酒石酸钙。在将葡萄酒泥中酒石酸溶解出来的过程中还伴随着少量其他物质的溶出，比如苹果酸，甘油，或酚化合物（见表8），所以产物酒石酸还需要更进一步的比较困难纯化过程来获得最高浓度的酒石酸和最少含量的杂质。为了解决这一纯化问题，应该加入钙盐选择性的使酒石酸变为酒石酸钙沉淀。表8依照Versari等人所说，首先根据化学方程计量出加入Ca CO3的量，C4H6O6+ Ca CO3CaC4H4O6+ CO2+ H2O再加入过量的CaCl2以提高酒石酸的回收率。当加入7.6 g/L的CaCl2时，工业条件下酒石酸的回收率有58.3%，而实验室条件下达到62.4%。除了CaCl2加入量以外，pH对酒石酸的回收率影响也很大，因为过酸或者过碱都不利于酒石酸钙沉淀的形成。为了得到最佳反应条件，依照第一步也做不完全析因设计。表9显示，以第一步最佳条件下生产的酒石酸（A）提取液为原料，进行第二步沉降工序。在不同实验条件即：CaCl2用量X4，pH X5，沉降反应时间X6（以编码量表示）下，得到的回收率y3的实验数据。表9表10，列出了回归系数和它们的显著性测试结果。在同一个表中分别包括了统计参数（r2和F）的测量相关性和模型的统计显著性。图2（C）显示该模型与实际试验拟合情况良好。由表可看出：pH（X5）对酒石酸回收率的影响最为明显，置信水平达到99%；其次是CaCl2用量（X4）；沉降反应时间（X6）几乎没什么影响。表10：*表示显著性高于99%，*表示显著性高于95%，*表示显著性高于90%图3（C）表示，在沉降时间取t125min条件下，不同CaCl2用量（x4）和pH （x5）时，酒石酸的回收率y3。依照Versari等人所说：沉降过程中CaCl2应当加入过量，pH过高或过低都阻碍酒石酸钙的形成，则酒石酸回收率达到最高时参数应该为中间取值。应用Microsoft Excel，当x451.4, x5 6.84, x6162.5时.，酒石酸回收率y3最多能达到92.4%，这远比工业生产条件下的58.3高很多。参考文献1Navarro, P.; Sarasa, J.; Sierra, D.; Esteban, S.; Ovelleiro, J. 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