新的蚊虫抗药性相关基因的功能研究.doc

项目类别申报学科代码1科学部编号A C030111国家自然科学基金申 请 书项 目名 称：新的蚊虫抗药性相关基因的功能研究 新的蚊虫抗药性相关基因的功能研究 新的蚊虫抗药性相关基因的功能研究 申 请 者： 所 在 单 位：本项目在2001年评审全优通过邮 政编 码： 通讯地 址： 话： 传 真： 电子信箱 (E-mail): 申 请 日 期： 2001年2月28日国家自然科学基金委员会1997年制 研究内容和意义摘要 本项目在已从淡色库蚊对溴氰菊酯抗性品系分离、鉴定的51个抗性相关序列的基础上，进一步获取全长基因并作细胞转染及共转染研究功能，鉴定蚊虫抗药性基因。 本项目鉴定的抗药性基因对于媒介抗药性检测、抗药性的分子机理研究和抗药性基因资源的开发和利用等具有重要意义；并可望在GenBank 登录一批新的全长基因，为我国在国际寄生虫/昆虫基因组计划中抢占一席之地作出贡献。主题词1. 主题词数量不多于三个；2. 主题词之间空一格（英文用/分隔）。中文蚊虫 抗药性基因 基因功能英文 mosquito/ insecticide-resistant gene/ function of gene 二、立论依据 （包括项目的研究意义、国内外研究现状分析，并附主要参考文献及出处）对基础研究，着重结合国际科学发展趋势，论述项目的科学意义；对应用基础研究，着重结合学科前沿、围绕国民经济和社会发展中的重要科技问题，论述其应用情景。 化学防治一直是媒介综合治理策略中的主要方法。杀虫剂的大量、连续使用导致了媒介抗药性的发生和发展。WHO(1992)报告，在全世界范围内已有146种媒介昆虫对不同杀虫剂产生了抗性1。媒介抗药性及其导致的环境改变加剧了虫媒病传播的恶化趋势。然而，由于化学防治容易操作，能够迅速、有效地控制猖獗的害虫种群，迄今乃至今后相当长的一段时期内无疑仍是媒介综合治理的主要方法之一。因此媒介抗药性已成为国内外媒介防制中的突出问题 2-4。 媒介抗药性是可遗传的复杂的生物进化现象。多年来媒介抗药性研究进展不大，其根本原因是抗药性机制的分子基础所知甚少。当前迫切的问题之一是分离抗药性基因，尤其是对广泛使用的拟除虫菊酯类杀虫剂的抗性基因5,6。 近20多年来，国外研究者采用经典的“功能克隆”法（从已知功能的蛋白质克隆基因的策略）仅克隆到个别昆虫抗性相关基因，其在抗性中是否起关键作用尚不得而知3，6。当前存在的问题是需要采用直接方法克隆媒介抗药性基因。 新近，Diatchenko等（1996,1999）建立并改进了抑制性差减杂交（suppression subtractive hybridization，SSH）这一“表型克隆”新策略。该法无须事先了解基因的蛋白质结构和功能等背景资料，仅根据表型便可直接分离目的基因7，8。 cDNA芯片是近年发展起来的分析基因表达图式的新方法，其可高效、快速地同时测定大通量基因的时空表达信息， 并且杂交点可经信号检测仪定量测定与经相应软件分析9。SSH 结合 cDNA 芯片是目前发展的目的基因分离、鉴定的最佳策略之一。迄今已见到国外用于疾病基因研究的3 篇报告10-12，寄生虫学与昆虫学研究领域尚未见报道。 淡色库蚊(Culex pipiens pallens)是分布广、种群密度高的重要家栖性病媒蚊种，近年来各地主要采用拟除虫菊酯类的溴氰菊酯进行防治，已陆续有敏感性显著下降的报告。迄今, 库蚊对拟除虫菊酯抗性基因国内外尚未见文献报道。本课题即是为此目的而设计的。 本实验室1999年在国家自然科学基金（批准号：39970666）的资助下，采用SSH 结合cDNA芯片法， 从淡色库蚊对溴氰菊酯抗性品系分离 并鉴定了3倍以上表达差异的抗性相关克隆51个；经测序，发现新序列 40个，由 GenBank 收录（ GenBank/NCBI BE247800-247839, 2000年 ）；大部分新序列未检索到同源基因或相关蛋白，线粒体rRNA基因、胰蛋白酶前体基因、糜蛋白酶A前体基因和视蛋白基因等同源基因在抗性品系中高表达。结果提示：昆虫抗药性可能涉及的并非个别基因，而是多基因或基因群13。 本项目拟在以上工作的基础上，进一步获取抗性相关克隆的全长序列,以抗性相关基因转染及共转染蚊细胞系，研究基因功能14，进而鉴定蚊虫抗药性基因。本项目拟鉴定的抗药性基因对于媒介抗药性检测、抗药性的分子机理研究和抗药性基因资源的开发和利用等具有重要意义；本项目可望发现一批新基因，为我国在国际寄生虫/昆虫基因组计划中抢占一席之地作出贡献。 主要参考文献 1WHO. Technical Report Series 818 1992; P9 2. 陆宝麟. 蚊虫综合治理（第二版）. 北京：科学出版社 1999; P17-20 3. Hemingway J, Ranson H. Annu Rev Entomol 2000; 45:371 4. Hirst SI, Stapley LA. Parasitol Today 2000; 16:1 5. Scott JG. Insect Biochem Mol Biol 1999; 29:757 6. Feyereisen R. Annu Rev Entomol 1999; 44:507 7. Diatchenko L et al. Proc Natl Acid Sci 1996; 93:6025 8. Diatchenko L et al. Methods Enzymol 1999; 303:349 9. Golub TR et al. Science 1999; 286:531 10. Yang GP et al. Nucleic Acids Res 1999; 27:1517 11. Sandhu H et al. Carcinogenesis 2000; 21:1023 12. Li JY et al. J Cereb Blood Flow Metab 2001; 21:6113. 国家自然科学基金委员会生命科学部. 国家自然科学基金资助医学 科研项目研究成果摘要汇编（武汉）2001; P57 14. Abul HK et al. Curr Eve Res 2000; 20:361 三、研究方案 1. 研究目标、研究内容和拟解决的关键问题 1.1. 研究目标 研究蚊虫抗性相关基因的功能，鉴定蚊虫抗药性基因。 1.2. 研究内容 1.2.1. 从已分离、鉴定的51个3倍以上表达差异的淡色库蚊对溴氰菊酯抗性相关序列中，选择4倍以上表达差异的9个序列获取全长基因；1.2.2. 候选基因转染蚊细胞系； 1.2.3. 检测转染细胞对溴氰菊酯的敏感性及主要代谢产物的生成量； 1.2.4. 将未显抗性表型的候选基因进一步以2个或3个随机组合，共转染蚊细胞系； 1.2.5. 检测共转染细胞对溴氰菊酯的敏感性及主要代谢产物的生成量； 1.2.6 鉴定抗药性基因。 注：如果实验顺利，拟根据计算机分析软件，结合cDNA芯片和Northern Blot结果，进一步从另42个3-4倍表达差异的抗性相关序列中选择性地获取全长基因和作细胞转染。 1.3. 拟解决的关键问题 提高细胞共转染效率（范乐明等. 生物化学与生物物理学报 2000；32：109 / 卢圣栋等. 现代分子生物学实验技术.高等教育出版社1993;P399-406）。 2. 拟采取的研究方法、技术路线、实验方案及可行性分析 2.1. 拟采用的研究方法 基因和蛋白数据库比对；cDNA文库筛选法或SMART RACE法获取全长；细胞转染及共转染；细胞对杀虫剂的敏感性及主要代谢产物的生成量测定 2.2. 拟采用的技术路线和实验方案 2.2.1. 获取候选基因全长序列 通过基因和蛋白数据库比对，结合cDNA芯片和Northern Blot结果，在已鉴定的51个3倍以上表达差异的淡色库蚊对溴氰菊酯抗性相关序列中，选择4倍以上表达差异的9个序列，从本实验室已构建的淡色库蚊对溴氰菊酯抗性品系cDNA文库筛选或以SMART RACE法获取全长序列并作测序分析(Takumi T et al. Biotechniques 1994; 17:443 / 基因有限公司. SMART RACE产品说明书，1997)。 2.2.2. 候选基因细胞转染 结合数据库资料，将9个候选基因逐个与阳离子脂质体作用、形成脂质体-DNA复合物，转染蚊细胞系，使候选基因被摄取和表达，收集细胞、检测转染效率（Dunkov BC et al. DNA Cell Biol 1997;16:1345 / 范乐明等. 生物化学与生物物理学报 2000；32：109 / 卢圣栋等. 现代分子生物学实验技术.高等教育出版社1993; P399-406）。 2.2.3. 检测转染细胞对溴氰菊酯的敏感性 比较实验组和对照组蚊细胞系对溴氰菊酯的敏感性及主要代谢产物的生成量,观察激光共聚焦显微镜、 电子显微镜和光学显微镜下细胞形态、结构和数量的变 化（冷欣夫等. 杀虫剂分子毒理学及昆虫抗药性.中国农业出版社1996; P13-14 / 蓝明扬等. 蚊细胞培养及应用技术.原子能出版社1994; P196-199 / 王新月等. 中国中医基础医学杂志 2000; 3:34）。 2.2.4. 未显抗性表型的候选基因的细胞共转染根据转染蚊细胞对溴氰菊酯的敏感性检测结果，将未显抗性表型的候选基因进一步以2个或3个随机组合共转染蚊细胞系，使候选基因被摄取和表达，收集细胞、检测转染效率（Dunkov BC et al. DNA Cell Biol 1997;16:1345 / 范乐明等. 生物化学与生物物理学报 2000；32：109 / 卢圣栋等. 现代分子生物学实验技术.高等教育出版社1993;P399-406）。 2.2.5. 检测共转染细胞对溴氰菊酯的敏感性 比较实验组和对照组蚊细胞系对溴氰菊酯的敏感性及主要代谢产物的生成量；观察激光共聚焦显微镜、电子显微镜和光学显微镜下细胞形态、结构和数量的变化（冷欣夫等. 杀虫剂分子毒理学及昆虫抗药性.中国农业出版社1996; P13-14 / 蓝明扬等. 蚊细胞培养及应用技术.原子能出版社1994; P196-199 / 王新月等. 中国中医基础医学杂志 2000; 3:34）。 2.2.6. 鉴定抗药性基因 综合候选基因转染细胞系和共转染细胞系的比较观察结果，鉴定抗药性基因 (ffrench-Constant RH et al. Proc Natl Acad Sci USA 1991; 88:7209 / Mutero A. Proc Natl Acad Sci USA 1994; 91:5922)。 技术路线示意图 已鉴定的51个3倍以上表达差异的抗性相关序列 选择其中4倍以上表达差异的9个抗性相关序列 cDNA文库筛选或SMART RACE获取全长基因 阳离子脂质体-候选基因复合物转染蚊细胞系 将未显抗性表型的候选 检测转染细胞对 基因2个或3个随机 溴氰菊酯的敏感性 组合共转染蚊细胞系 检测共转染细胞对 溴氰菊酯的敏感性 鉴定抗药性基因 2.3. 可行性分析 2.3.1. 本实验室在前一个国家自然科学基金项目中，已成功地从淡色库蚊对溴氰菊酯抗性品系分离并鉴定了抗性相关序列51个；已构建抗性蚊虫cDNA文库； 2.3.2. 本项目采用的均为成熟的技术方法和常规的实验步骤,均有文献为依据,并结合本实验室具体条件制定。 2.3.3. 申请者及课题组成员对本项目工作具有研究经验。本项目迄今已进行了二年多的前导工作（详请参“四.研究基础”）。 本项目各阶段工作均有人员、技术、实验材料和仪器设备方面的保证。如获资助,可望达到预期目标。 3. 本项目的创新之处 3.1. 有关库蚊对拟除虫菊酯类杀虫剂抗性基因, 国内外至今尚未见文献报道。 3.2. 目前仅报道的几个昆虫抗药性基因均采用经典的“功能克隆”法获得；本研究则采用SSH这一“表型克隆”新策略并结合cDNA芯片直接分离,有可能发现起关键作用的抗药性基因。 3.3. 可望在GenBank 登录一批新的全长基因，为我国在国际寄生虫/昆虫基因组计划中抢占一席之地作出贡献。 3.4. 目前报道的昆虫对拟除虫菊酯类杀虫剂抗性相关基因,其试验材料为用苯巴比妥诱导的抗性品系；本项目则以室内逐代选育的淡色库蚊对溴氰菊酯抗性品系为材料，研究抗药性基因。 4. 年度研究计划及预测进展5. 预期研究成果