紫外吸收光谱法分析应用...ppt

紫外 可见分子吸收光谱法 UV VISspectrometry 第一节概述 一 分子吸收光谱分析的发展概况可见 紫外 红外目视比色 光电比色 分光光度光声光谱 长光程吸收光谱 传感器 二 分子吸收光谱的分类和特征 紫外 可见电子光谱 Ee 1 20eV红外振动光谱0 05 1远红外转动光谱0 005 0 05 电磁波区域电磁波可分为高频 中频及低频区 高频对应放射线 g射线 C射线 涉及原子核 内层电子 而中等频率指紫外 可见光 近红外 中红外和远红外光 涉及外层电子能级的跃迁 振动及转动 低频指电波 微波 无线电波 涉及转动 电子自旋 核自旋等 光的本质是电磁辐射 光的基本特性是波粒二象性 waveandcorpuscleduality 光的波动性是指光可以用互相垂直的 以正弦波振荡的电场和磁场表示 电磁波具有速度 方向 波长 振幅和偏振面等 光可有自然光 偏振光 线偏振或园偏振 连续波 调制波 脉冲波等 电磁辐射的特性 物质具有能量 是诱电体 物质与光的作用可看成是光子对能量的授受 即hn E1 E0 该原理广泛应用于光谱解析 电磁辐射与物质的作用本质是物质吸收光能后发生跃迁 跃迁是指物质吸收光能后自身能量的改变 因这种改变是量子化的 故称为跃迁 不同波长的光 能量不同 跃迁形式也不同 因此有不同的光谱分析法 电磁辐射与物质的相互作用 谱图的三要素一般进行光谱分析时 要同时注意谱图的位置 能量 强度 跃迁几率 波宽这三个要素 才能得出正确的结论 远紫外紫外可见红外远红外 10 200nm200 380nm380 780nm0 75 50 m50 250 m 分子外层价电子跃迁分子外层价电子跃迁分子外层价电子跃迁分子中原子的振动分子的转动 远紫外吸收紫外吸收可见吸收红外吸收远红外吸收 光谱类型 分子运动形式 波长 光谱区域 分子内部运动价电子运动 分子内原子在平衡附近的振动 分子作为整体绕其重心的转动 分子能级电子能级 振动能级 转动能级分子总能量E Ee Ev Er 当分子吸收一定能量的电磁辐射时 分子由较低的能级E1跃迁到较高的能级E2 吸收辐射的能量与分子的这两个能级的能量差相等 E E2 E1 h hc 由于三种能级之间的差值很小 不能区分开 得到的分子光谱为带光谱 由于三种能级跃迁所需要能量不同 所以需要吸收不同波长的电磁辐射使产生跃迁 所产生的光谱应在不同的光学区域 ee E E abc RoRoRo Vo V1 Eo E1 E电子能级V振动能级R转动能级 分子在吸收过程中发生电子能级跃迁的同时伴随振动能级和转动能级的能量变化 原子对电磁辐射的吸收只涉及原子核外电子能量的变化 是一些分离的特征锐线 而分子的吸收光谱是由成千上万条彼此靠得很紧的谱线组成 看起来是一条连续的吸收带 溶液中相邻分子间的碰撞导致分子各种能级的细微变化 也会引起谱带的进一步加宽和汇合 当分子由气态变为溶液时 一般会失去振动精细结构 分子的电子光谱的特点 在波长范围内按一定强度分布的谱带 带光谱波长位于紫外 可见区 物质的紫外吸收光谱决定于分子中价电子的跃迁 因此分子的组成不同 特别是价电子性质不同 则产生吸收光谱也不用 三 分子吸收光谱的特点 可进行分子的定性和定量分析可用于一些物理化学常数的测定 如平衡常数等 仪器结构简单 价格便宜应用范围广泛 无机离子 有机化合物 生物大分子分析等 一 吸收光谱与分子结构 1 有机化合物的吸收光谱根据分子轨道理论 分子中的电子轨道有n 和 三种 n 第二节紫外 可见分子吸收光谱的理论基础 反键轨道非键轨道成键轨道 跃迁能量很大吸收光谱在真空紫外区多为饱和烃 甲烷125nm乙烷135nm n 跃迁所需能量小于 跃迁 150 250nm 含有未共用电子对 n电子 原子的饱和化合物都可发生跃迁的摩尔吸光系数比较小 一般在100 3000L molcm 化合物 max maxH2O1671480CH3OH184150CH3Cl173200 CH3 2O1842520 和n 跃迁 和n 跃迁能量低 200nm 含有不饱和键的有机分子易发生这类跃迁 有机化合物的紫外 可见吸收光谱分析多以这两类跃迁为基础 比n 跃迁几率大100 1000倍 跃迁吸收强 104n 跃迁吸收弱 500 生色团 含有 键不饱和官能团 能进行n 含碳碳双 三键 碳氧双键 氮氮双键基团 助色团 基团本身无色 但能增强生色团颜色为含有n电子 n 且能与 电子作用 产生n 共轭 OH NH2 SH SO3H红移和紫移 因取代基或溶剂的改变 使吸收带的最大吸收波长发生移动 向长波长方向移动为红移 向短波长方向移动为紫移 CH4 150 210nmCH3In 259nmCH2I2n 292nmCHI3n 349nm 影响紫外 可见光谱的因素 共轭效应 电子共轭体系增大 波长红移 吸收增强 取代基影响 能够引起 电子永久性转移的取代基使波长红移 助色团 溶剂影响 一般情况下分子的激发态极性大于基态 因此溶剂极性增大有利于激发态稳定 能量降低 波长红移 max 185nm 204nm 210nm 270nm 240nm 270nm 328nm 278 5nm 273 5nm 317 5nm max 取代基的影响 在光的作用下 有机化合物都有发生极化的趋向 既能转变为激发态 当共轭双键的两端有容易使电子流动的基团 给电子基或吸电子基 时 极化现象显著增加 给电子基为带有未共用电子对的原子的基团 如 NH2 OH等 未共用电子对的流动性很大 能够和共轭体系中的p电子相互作用引起永久性的电荷转移 形成p p共轭 降低了能量 lmax红移 吸电子基是指易吸引电子而使电子容易流动的基团 共轭体系中引入吸电子基团 也产生p电子的永久性转移 lmax红移 p电子流动性增加 吸收光子的吸收分数增加 吸收强度增加 给电子基与吸电子基同时存在时 产生分子内电荷转移吸收 lmax红移 emax增加 给电子基的给电子能力顺序为 N C2H5 2 N CH3 2 NH2 OH OCH3 NHCOCH3 OCOCH3 CH2CH2COOH H吸电子基的作用强度顺序是 N CH3 3 NO2 SO3H COH COO COOH COOCH3 Cl Br I 除了有机化合物的pp 和np 跃迁吸收带以外 当外来辐射照射某些有机或无机化合物时 可能发生一个电子从体系具有电子给予体特性部分 称为给体 donor 转移到该体系的另一具有电子接受体特性的部分 称为受体 acceptor 这种电子转移产生的吸收谱带 称为电荷转移吸收带 电荷转移吸收带涉及的是给体的一个电子向受体的一个电子轨道上的跃迁 激发态是这一内氧化还原过程的产物 电荷转移过程可表示如下 式中D与A分别代表电子给体与受体 下面是能产生电荷转移吸收带的一些化合物 NR2是电子给体 苯环是电子受体 苯环是电子给体 氧是电子受体 电荷转移吸收带的一个特点是吸收强度大 emax 104l mol cm因此含有这类结构的分子测定灵敏度高 该原理已被广泛应用于分子识别的主体分子设计中 2 无机化合物的吸收光谱 某些无机金属离子也会产生紫外 可见吸收 如含d电子的过渡金属离子会产生配位体场吸收带 依据配位场理论 无配位场存在时 能量简并 当过渡金属离子处于配位体形成的负电场中时 5个简并的d轨道会分裂成能量不同的轨道 不同配位体场 如八面体场 四面体场 正方平面配位场等使能级分裂不等 d d电子跃迁绝大多数过渡金属离子都具有未充满的d轨道 按照晶体场理论 当它们在溶液中与水或其它配体生成配合物时 受配体配位场的影响 原来能量相同的d轨道发生能级分裂 产生d d电子跃迁 配体配位场越强 d轨道分裂能越大 吸收波长越短 f f跃迁与此类似 一般配位体场吸收带在可见区 emax约0 1 100l molcm 吸收很弱 因此配位体场吸收带对定量分析用处不大 镧系及锕系离子5f电子跃迁产生的f电子跃迁吸收谱带出现在紫外 可见区 由于f轨道为外层轨道所屏蔽 受溶剂性质或配位体的影响很小 故谱带窄 少数无机阴离子 如NO3 lmax 313nm CO32 lmax 217nm NO2 lmax 360 280nm N3 lmax 230nm CS32 lmax 500nm 等也有紫外 可见吸收 例如 H2O配位场 NH3配位场Cu2 水合离子794nm浅蓝色Cu2 氨合离子663nm深蓝色 小结 分子结构 光谱特征 定性分析 不同结构的分子由于共轭程度不同 分子吸收的特征不同 相同共轭结构的分子骨架 因助色团的加入或改变 导致光谱位移和吸收系数变化 相同配体 因过渡金属离子不同 导致配位场的变化或电荷转移跃迁 或配体共轭结构的变化 光谱发生变化 Io I b S dx 二 吸收定律 定量分析的基础 Ix dIx dIxIx 吸收光强 入射光强 吸收率 任一截面的吸收率 A bc 吸收定律 二 吸收定律的适用性与限制 1 吸收定律具有加和性 即 特别是存在非吸收线 或吸收很小 杂散光 和浓度较大时 I变得很小 I i 常数 吸收定律或比尔定律 其成立条件是待测物为均一的稀溶液 气体等 无溶质 溶剂及悬浊物引起的散射 入射光为单色平行光 比尔定律在有化学因素影响时不成立 解离 缔合 生成络合物或溶剂化等会对比尔定律产生偏离 比尔定律在有仪器因素影响时也不成立 非单色光对比尔定律产生偏离 杂散光 非吸收光 也会对比尔定律产生影响 其他影响因素包括溶剂 光效应等也应考虑 三 紫外 可见吸收光谱的灵敏度 0 4343Naiai 1x10 15cm2吸光分子的截面积N 6 02x1023 因为 为摩尔吸光系数ai的单位是cm2 cm3是ml 变成L除1000 所以 0 4343Nai 0 4343x6 02x1023x1x10 15 1000 105 若1 吸收A 0 0044b 1C A0 0044 b100000 4 4x10 8 M 此即为方法的理论灵敏度 第三节紫外 可见分光光度计 一 基本结构 光源氢灯 氘灯 钨灯 常用的光源有热辐射光源和气体放电光源 利用固体灯丝材料高温放热产生的辐射作为光源的是热辐射光源 如钨灯 卤钨灯 两者均在可见区使用 卤钨灯的使用寿命及发光效率高于钨灯 气体放电光源是指在低压直流电条件下 氢或氘气放电所产生的连续辐射 一般为氢灯或氘灯 在紫外区使用 这种光源虽然能提供至160nm的辐射 但石英窗口材料使短波辐射的透过受到限制 石英 200nm 熔融石英 185nm 而大于360nm时 氢的发射谱线叠加于连续光谱之上 不宜使用 2 单色器 单色器的作用是使光源发出的光变成所需要的单色光 通常由入射狭缝 准直镜 色散元件 物镜和出射狭缝构成 入射狭缝用于限制杂散光进入单色器 准直镜将入射光束变为平行光束后进入色散元件 后者将复合光分解成单色光 然后通过物镜将出自色散元件的平行光聚焦于出口狭缝 出射狭缝用于限制通带宽度 棱镜和光栅分光原理与原子吸收类似 3 检测器 简易分光光度计上使用光电池或光电管作为检测器 目前最常见的检测器是光电倍增管其特点是在紫外 可见区的灵敏度高 响应快 但强光照射会引起不可逆损害 因此高能量检测不宜 需避光 一般单色器都有出口狭缝 经光栅分光后的光是一组以角度分布的l1 l2等的光线通过旋转光栅角度使某一波长的光经物镜聚焦到出口狭缝 二极管阵列检测器不使用出口狭缝 在其位置上放一系列二极管的线形阵列 则分光后不同波长的单色光同时被检测 二极管阵列检测器的特点是响应速度快 但灵敏度不如光电倍增管 因后者具有很高的放大倍数 4 样品室 1cm 5cm 石英 玻璃 二 紫外 可见分光光度计 紫外 可见分光光度计 按其光学系统可分为单波长与双波长分光光度计单光束与双光束分光光度计 1 单光束仪器 S1 单光束仪器中 分光后的单色光直接透过吸收池 交互测定待测池和参比池 单光束仪器的缺点 操作麻烦 空白 IO样品 I 任一波长 不能进行吸收光谱的自动扫描光源不稳定性影响测量精密度 2 双光束仪器 双光束仪器中 从光源发出的光经分光后再经扇形旋转镜分成两束 交替通过参比池和样品池 双光束仪器的特点和不足 测量方便 不需要更换吸收池补偿了仪器不稳定性的影响实现了快速自动吸收光谱扫描不能消除试液的背景成分吸收干扰 单光束仪器中 分光后的单色光直接透过吸收池 交互测定待测池和参比池 仪器结构简单 适用于测定特定波长的吸收 进行定量 而双光束仪器中 从光源发出的光经分光后再经扇形旋转镜分成两束 交替通过参比池和样品池 测得的是透过样品溶液和参比溶液的光信号强度之比 双光束仪器克服了单光束仪器由于光源不稳引起的误差 并且可以方便地对全波段进行扫描 3 双波长仪器 仪器既可用作双波长分光光度计又可用作双光束仪器当用作单波长双光束仪器时 单色器出射的单色光束为遮光板所阻挡 单色器1出射的单色光束被斩光器分为两束断续的光 交替通过参比池和样品池 最后由光电倍增管检测信号 当用作双波长仪器时 由两个单色器分出的不同波长 1和 2的两束光 由斩光器并束 使其在同一光路交替通过吸收池 由光电倍增管检测信号 双波长仪器的主要特点是可以降低杂散光 光谱精度高 单光束和双光束分光光度计 就测量波长而言 都是单波长的 由一个单色器分光后 让相同波长的光束分别通过试样池和测量池 测得试样池和测量池吸光度之差 双波长由同一光源发出的光被分成两束 分别经过两个单色器 同时得到两个不同波长 1和 2 的单色光 由斩光器并束 使其在同一光路交替通过吸收池 由光电倍增管检测信号 双波长仪器的主要特点是可以降低杂散光 光谱精度高 不仅能够测量高浓度试样 多组分混合试样 还能测定混浊试样 消除光谱重叠干扰A 1 Aa 1 Ai 1A 2 Aa 2 Ai 2Ai 1 Ai 2 A Aa 2 Aa 1 a 1 a 2 bCa 消除了共存组分的干扰 双波长仪器能否消除背景干扰 A 1 lgI0 I1 1bC AbA 2 lgI0 I2 2bC Ab式中Ab为背景吸收或干扰物质的吸收若波长选择合适 1和 2处Ab相同 A1 11C1 12C2 13C3A2 21C1 22C2 23C3A3 31C1 32C2 33C3 ij为在波长i测定组分j的摩尔吸光系数Ai为在波长i测得该体系的总吸光度 解上联立方程可求出待测物浓度C1 C2 C3 分光光度计的校正 波长校正 可采用辐射光源法校正 常用氢灯 486 13 656 28nm 氘灯 486 00 656 10nm 或石英低压汞灯 253 65 435 88 546 07nm 校正 镨钕玻璃在可见区有特征吸收峰 也可用来校正 苯蒸汽在紫外区的特征吸收峰可用于校正 在吸收池内滴一滴液体苯 盖上吸收池盖 待苯挥发后绘制苯蒸汽的吸收光谱 吸光度校正 以重铬酸钾水溶液的吸收曲线为标准值校正 将0 0303克重铬酸钾溶于1升的0 05mol l氢氧化钾中 以1cm吸收池 25 C测定吸收光谱 定性分析用于有机物的鉴定 同分异构体的鉴别 物质结构的测定 物质的紫外吸收光谱基本上是分子中生色团 助色团的特性 而不是它的整个分子的特性 化合物纯度鉴定鉴定未知试样推断分子结构 第四节紫外 可见分光光度法的应用 判断共轭状态 可以判断共轭生色团的所有原子是否共平面等 如二苯乙烯 ph CH CH ph 顺式比反式不易共平面 因此反式结构的最大吸收波长及摩尔吸光系数要大于顺式 顺式 lmax 280nm e 13 500 反式 lmax 295nm e 27 000 已知化合物的验证 与标准谱图比对 紫外 可见吸收光谱可以作为有机化合物结构测定的一种辅助手段 有机合物紫外光谱解析 了解共轭程度 空间效应 氢键等 可对饱和与不饱和化合物 异构体及构象进行判别 紫外 可见吸收光谱中有机物发色体系信息分析的一般规律是 若在200 750nm波长范围内无吸收峰 则可能是直链烷烃 环烷烃 饱和脂肪族化合物或仅含一个双键的烯烃等 若在270 350nm波长范围内有低强度吸收峰 10 100L mol 1 cm 1 n 跃迁 则可能含有一个简单非共轭且含有n电子的生色团 如羰基 若在2 0 300nm波长范围内有中等强度的吸收峰则可能含苯环 若在210 250nm波长范围内有强吸收峰 则可能含有2个共轭双键 若在260 300nm波长范围内有强吸收峰 则说明该有机物含有3个或3个以上共轭双键 若该有机物的吸收峰延伸至可见光区 则该有机物可能是长链共轭或稠环化合物 定量分析基本原理 朗伯 比尔定律A CL单组分作A C曲线多组分根据吸光度具有加和性的特点测定 单组分定量分析 紫外 可见吸收光谱是进行定量分析最广泛使用的 最有效的手段之一 尤其在医院的常规化验中 95 的定量分析都用此法 其用于定量分析的优点是 可用于无机及有机体系 一般可检测10 4 10 5mol l的微量组分 通过某些特殊方法 如胶束增溶 可检10 6 10 7mol l的组分 准确度高 一般相对误差1 3 有时可降至百分之零点几 分析条件的选择溶剂的选择 所选择的溶剂应易于溶解样品并不与样品作用 且在测定波长区间内吸收小 不易挥发 下表为某些常见溶剂可用于测定的最短波长 测定浓度的选择 溶液吸光度值在0 2 0 8范围内误差小 A 0 434时误差最小 因此可根据样品的摩尔吸光系数确定最佳浓度 即吸光度A 0 4343时 吸光度测量误差最小 将吸光度值控制在0 2 0 8之间 光度测量误差较小 三 测量误差 只有当 则 测量误差最小 此时 logT loge 0 434 A 即吸光度为0 434时 浓度测量才具有最小相对误差 一 络和物组成的测定 摩尔比法等摩尔系列法斜率比法平衡移动法 应用 摩尔比率法测定络和比 mM nRMmRn 配制 不同CR CM的系列溶液 如CR CM 1 2 3 n 分别测吸光度 A1 A2 A3 An 作A CR CM曲线 摩尔比法设有络合反应mM nY MmYn 固定一个组分 如M 的浓度不变 改变另一组分 如Y 的浓度 求得一系列 Y M 比 在络合物MmYn的最大吸收波长处测定吸光度的变化 则开始时 随 Y M 的增加 溶液吸光度线性增加 到达络合物的组成比后 继续增加 Y M 会有三种不同情况 吸光度达到饱和 不再增加 说明试剂Y无吸收 吸光度的增加只是络合物的单独贡献 如Fe III 钛铁试剂络合物 吸光度出现一转折点后继续增加 说明试剂Y在络合物的lmax处稍有吸收 如Zn PAN络合物 PAN 1 2 吡啶基偶氮 2 萘酚 吸光度出现一转折点后呈直线下降 说明分步生成了摩尔吸光系数小于络合物e的高次络合物 如Bi 二甲酚橙络合物 图代表了第一种情况 曲线转折点对应的摩尔浓度比 Y M n m 即为该络合物的组成比 摩尔比法测定络合物的组成比 若络合物稳定性差 络合物解离使吸光度下降 转折不明显 据此可以测定络合物不稳定常数 设 络合物解离度为 不解离时转折处浓度为C A0 A A0 K CM m CR n m C m n C nmmnn m nCm n 1 CMmCRn 1 C 1 二 酸碱离解常数的测定 1 同样由 2 得 则 A AHB AB HB HB B B 2 4 C HB B 第五节分光光度测定方法 普通分光光度法示差分光光度法双波长分光光度法导数分光光度法 一 普通分光光度法 以一定的标准溶液滴定待测物溶液 测定滴定中溶液的吸光度变化 通过作图法求得滴定终点 从而计算待测组分含量的方法称为分光光度滴定 一般有直接滴定法和间接滴定法两种 前者选择被滴定物 滴定剂或反应生成物之一摩尔吸光系数最大的物质的lmax为吸收波长进行滴定 滴定曲线有如下几种形式 间接滴定法需使用指示剂 光度滴定与通过指示剂颜色变化用肉眼确定滴定终点的普通滴定法相比 准确性 精密度及灵敏度都要高 光度滴定已用于酸碱滴定 氧化还原滴定 沉淀滴定和络合滴定 1 分光光度滴定 2 单组分的测定通常采用A C标准曲线法定量测定 3 多组分的同时测定 若各组分的吸收曲线互不重叠 则可在各自最大吸收波长处分别进行测定 这本质上与单组分测定没有区别 若各组分的吸收曲线互有重叠 则可根据吸光度的加合性求解联立方程组得出各组分的含量 A 1 a 1bca b 1bcbA 2 a 2bca b 2bcb 普通分光光度法一般只适于测定微量组分 当待测组分含量较高时 将产生较大的误差 需采用示差法 即提高入射光强度 并采用浓度稍低于待测溶液浓度的标准溶液作参比溶液 设 待测溶液浓度为cx 标准溶液浓度为cs cs cx 则 Ax bcxAs bcs x s b cx cs b c 二 示差分光光度法 示差法 A Ax As b cx cs b c测得的吸光度相当于普通法中待测溶液与标准溶液的吸光度之差 A 示差法测得的吸光度与 c呈直线关系 由标准曲线上查得相应的 c值 则待测溶液浓度cx cx cs c 普通法 cs的T 10 cx的T 5 示差法 cs做参比 调T 100 则 cx的T 50 标尺扩展10倍 示差法标尺扩展原理 不需空白溶液作参比 但需要两个单色器获得两束单色光 1和 2 以参比波长 1处的吸光度A 1作为参比 来消除干扰 在分析浑浊或背景吸收较大的复杂试样时显示出很大的优越性 灵敏度 选择性 测量精密度等方面都比单波长法有所提高 A A 2 A 1 2 1 bc两波长处测得的吸光度差值 A与待测组分浓度成正比 1和 2分别表示待测组分在 1和 2处的摩尔吸光系数 三 双波长分光光度法 测量波长 2和参比波长 1的选择与组合以两组分x和y的双波长法测定为例 设 x为待测组分 y为干扰组分 二者的吸光度差分别为 Ax和 Ay 则该体系的总吸光度差 Ax y为 Ax y Ax Ay如何选择波长 1 2有一定的要求 关键问题 选定的波长 1和 2处干扰组分应具有相同吸光度 即 Ay Ay 2 Ay 1 0故 Ax y Ax x 2 x 1 bcx此时 测得的吸光度差 A只与待测组分x的浓度呈线性关系 而与干扰组分y无关 若x为干扰组分 则也可用同样的方法测定y组分 可采用作图法选择符合上述两个条件的波长组合 在选定的两个波长 1和 2处待测组分的吸光度应具有足够大的差值 选择波长组合 1 2的基本要求是 可用于悬浊液和悬浮液的测定 消除背景吸收 因悬浊液的参比溶液不易配制 使用双波长分光光度法时 可固定 1为不受待测组分含量影响的等吸收点 于样品中依次加入待测组分 记录吸收光谱 得到的吸光度重叠的点为等吸收点 测定 2处的吸光度变化 可以抵消混浊的干扰 提高测定精度 因为使用同一吸收池 等吸收点 无须分离 可用于吸收峰相互重叠的混合组分的同时测定 设有混合组分x和y 1时 A1 1xbCx 1ybCy 2时 A2 2xbCx 2ybCy A A2 A1 2x 1x bCx 2y 1y bCy 选择 1和l 2 使 2y 1y 即 1和 是y等吸收点的波长 则 A 2x 1x bCx从而消除了y的干扰 如果体系中不存在等吸收点 可以通过作图法选择干扰组分的等吸光点 也可以消除干扰 如 三氯苯酚存在下苯酚的测定 1 nm 为等吸收点 测定 nm 苯酚吸收 导数分光光度法在多组分同时测定 浑浊样品分析 消除背景干扰 加强光谱的精细结构以及复杂光谱的辨析等方面 显示了很大的优越性 利用吸光度 或透光度 对波长的导数曲线来进行分析 0e bc假定入射光强度 0在整个波长范围内保持恒定 dI0 d 0则 dI d 0bce bcd d 0bcd d 四 导数分光光度法 dI d 0bcd d 一阶导数信号与试样浓度呈线性关系 测定灵敏度依赖于摩尔吸光系数对波长的变化率d d 吸收曲线的拐点处d d 最大 故其灵敏度最高 见图 同理可以导出其二阶和三阶导数光谱 略 随着导数阶数的增加 谱带变得尖锐 分辨率提高 但原吸收光谱的基本特点逐渐消失 导数光谱的特点在于灵敏度高 可减小光谱干扰 因而在分辨多组分混合物的谱带重叠 增强次要光谱 如肩峰 的清晰度以及消除混浊样品散射的影响时有利 动力学分光光度法是利用反应速度参数测定待测物型体原始浓度的方法 设有一反应速度较慢的显色反应 因催化剂H的存在而加速 五 动力学分光光度法 若F为在紫外 可见区有吸收的化合物 则F的生成反应速度可表示为 CH为常数 积分得 上式为动力学分光光度法的基本关系式 准零级法或初始速度法是指只在占完成反应总时间的 的起始期间内测量速度数据 此时反应物D E消耗不大 近似等于起始浓度 D 0 E 0 为常数 同时形成产物的量可以忽略不计 若逆反应可以不考虑 催化剂H的量也可视为不变 则上式可变为 测定CH的方法有 固定时间法在催化反应进行一固定时间 t 常数 后 用快速冷却 改变酸度 加入催化剂活性抑制剂等方法终止反应 测定体系吸光度 t为常数时 A k1CH 选择一系列CH的标准溶液 并测定固定时间t时的吸光度A 绘制A CH工作曲线 由待测样在t时的吸光度值求得CH 固定浓度法测量显色产物F达到一定浓度 一定吸光度值 时所需的时间 CF为常数时 CH K t 配制一系列不同浓度CH的标准溶液 测定达到一定吸光度A时的时间t 绘制CH 1 t工作曲线 由待测样经反应达到A时所需要的时间t求得CH 斜率法由吸光度A随反应时间的变化速率DA Dt来测定CH 因为DA Dt kCH 配制标准溶液具有不同的CH 分别测定A t曲线 求得曲线斜率DA Dt 再绘制DA Dt CH工作曲线 对待测样亦同样测定A t曲线 求得曲线斜率DA Dt 从DA Dt CH工作曲线上求得CH 斜率法实验数据多 准确度高 图4 31为催化反应测定痕量钨酸根的示意图 动力学分光光度法的特点是灵敏度高 10 6 10 9g ml 有的可达10 12g ml 但由于影响因素多 不易严格控制 测定误差较大 六 光声光谱法photoacousticspectroscopy 光声光谱法是1970年以后发展起来 可用于测定固体 半固体状态的生物组织或浑浊液体样品的紫外 可见吸收光谱 而普通的紫外 可见吸收光谱法由于散射及反射的影响 不能得到这类样品的理想谱图 以光声效应为基础的一种新型光谱分析检测技术光声效应1880年AlexanderGrahamBell等人研究光吸收效应时发现了光声效应 以经过斩光器调制的入射光照射密闭池中的气体时 气体对光产生吸收 被吸收的辐射使气体产生周期性热能 热能反过来使气体压力发生周期性涨落 如果斩光速率落在音频范围 气体压力脉冲可用一灵敏的微音器检测 若入射单色光波长可变 则可测到随波长而变的光声信号图谱 这就是光声光谱 若入射光是聚焦而成的细束光并按样品的x y轴扫描方式移动 则能记录到光声信号随样品位置的变化 这就是光声成像技术