有丝分裂过程中染色体行为的观察.docx

有丝分裂过程中染色体行为的观察实验时间2016.11.15晚摘要： 根尖细胞作为植物体细胞分裂最旺盛的部位之一，并且由于其没有叶绿体等有色物质的干扰，长期以来一直担当着有丝分裂观察的最佳材料之一。本实验对洋葱、大蒜等植物的根尖分裂细胞进行了观察，获得了不同时期的有丝分裂细胞图像，对不同形态时期的有丝分裂细胞进行描述并进行归类。同时对根尖进行秋水仙素的预处理，获得更多的有丝分裂中期的分裂相，并与未处理的材料进行对比，分析讨论有丝分裂细胞进行秋水仙素处理后对有丝分类观察的影响。1引言19世纪后半叶微生物学的迅猛发展，广泛寻找微生物的过程中，开发了大量的染料，为染色体的发现提供了技术基础1。1842年，瑞士生物学家Carl Nageli观察了花粉形成过程中细胞分裂的过程，两年后他在人类历史上第一次描述了细胞有丝分裂过程中染色体的行为2。1882年，Flemming用苯胺染料染色，观察蝾螈胚胎细胞的分裂过程，绘制了详细的分裂过程图，并描述这个过程为“mitosis”。Flemming另外定义了“chromatin”用于描述在分裂中常见到被染色的细丝。1888年德国的解剖学家Wilhelm Waldeyer在详尽研究当时文献的基础上，首次使用“chromosome”一词准确而简洁地描述了在有丝分裂过程中出现的棒状、点状的深染的小体3。通过大量观察和前人的实验结果，德国生物学家August Weissmann在1892年提出染色体是遗传物质的载体4。人们后来发现，植物材料固定和染色剂用一些试剂(如水合氯醛、溴苯、对二氯苯、秋水仙素)处理，可以使得染色体的形态更为清晰，着丝粒、次缢痕、随体等的结构更易于看到5。根尖细胞作为植物体细胞分裂最旺盛的部位之一，并且由于其没有叶绿体等有色物质的干扰，长期以来一直担当着有丝分裂观察的最佳材料之一。本实验对洋葱、大蒜等植物的根尖分裂细胞进行了观察，获得了不同时期的有丝分裂细胞图像，对不同形态时期的有丝分裂细胞进行描述并进行归类。同时对根尖进行秋水仙素的预处理，获得更多的有丝分裂中期的分裂相，并与未处理的材料进行对比，分析讨论有丝分裂细胞进行秋水仙素处理后对有丝分类观察的影响。2实验材料2.1实验材料每一个学生：显微镜、擦镜纸、松柏油、二甲苯，载玻片、盖玻片(22mm22mm或20mm20mm)；眼科钳一只；吸水纸片(约3cm5cm)，吸管；1.5ml离心管一至两个；每小组：醋酸洋红染液；解离液(1mol/L HCl。小麦、大麦根尖可用95%乙醇：浓盐酸=1:1混合解离)；废液缸；整个实验班：洋葱，大蒜；烧杯，培养皿；滤纸；卡诺固定液；预处理液(秋水仙素)。2.2实验步骤2.2.1获取生长良好的根尖洋葱或(Aillum cepa)大蒜，剥除鳞茎处干枯的表皮，将洋葱或大蒜置于一盛清水的烧杯上，让水没过根部。可在鳞茎上插入牙签再放在烧杯上。培养过程中要注意每天换水。25培养至根长13cm时即可取材。材料可分为两部分：一部分进行预处理，另一部分做对照继续生长。2.2.2预处理预处理的目的是抑制纺锤丝的形成，收集更多中期分裂相，使染色体缩短、伸直，分散。预处理液本身对根尖生理活动有害。因此预处理时材料要放在大容器中，不能太密集；预处理液没过种子或根尖即可；温度以1015左右为宜，不能太高。像洋葱、蚕豆这样的植物，需将根尖切下进行预处理，而大麦、小麦可剪根尖，亦可直接将发根种子投入预处理液。离体根尖预处理34小时，不离体种子预处理56小时。预处理可能使染色体加倍。2.2.3固定固定的目的是将组织与细胞杀死，并使所要研究的成分尽量保持原状。将预处理及做对照的种子/根尖水洗两次，移入卡诺氏固定液中(固定液量约为材料的10倍，一容器中所装材料不能太多，温度不能太高)。固定224小时后用95%乙醇冲洗后再转入70%乙醇中，4保存，保存时间最好不超过二个月。2.2.4解离 解离的目的是将细胞分散开来，使组织软化易于压片。解离还能清除细胞质中的一些成分，使制片中的染色体背景清晰。取两种根尖：一种是经预处理的，一种是未经预处理直接固定的。每组取三至五个，置于小指管中。加入1mol/L HCl(洋葱)的解离液，加的量大约是材料的三至四倍，室温解离1015分钟。解离完毕，用蒸馏水换洗3次，每次5分钟，将解离液及其解离出的可溶性物质彻底洗净。除酸之外，果胶酶、纤维素酶等也是很好的解离试剂。2.2.5染色及压片经酸解离后可见根尖顶端有一小段乳白色的组织即为分生组织。去一条根，将这段组织切下，置于载玻片上加染液510分钟，之后进行压片。洋葱的染色体较大有丝分类过程中染色体的行为放大400左右即清晰可见。细节则需在油镜下观察。3结果与讨论3.1有丝分裂各个时期的图像图1a-e为不同时期未经秋水仙素预处理的大蒜根尖细胞有丝分裂图像。图1a中核膜明显，染色质呈细丝状分布在整个细胞核中，且可以看到染色较浅折光率较大的核仁，为有丝分裂间期；图1b中染色体已经有明显的收缩，形成染色较深的染色体，散乱分布在细胞中，此时核膜已经消失，但仍能看到些许折光率较大核仁，为有丝分裂前期；图1c中可以看到着丝粒排在细胞板上，染色体整齐的排列在细胞中央，为有丝分裂中期；图1d中染色体姐妹染色单体分离，在着丝粒的牵引下移向细胞两级，为有丝分裂后期；图1e中染色体逐渐解旋，失去染色体的形态，重回染色质丝的形态，细胞核重新形成，细胞板处形成新的隔离区，为有丝分裂末期。图1f-k为不同时期经过秋水仙素预处理的大蒜根尖细胞有丝分裂图像，由于间期图像与未处理组的图像一样，没有特别标出处理组的间期图像。图1f-g中染色体形态明显，散乱分布在细胞中，可以很容易的分辨出染色体数目为16，与查找的文献值一致。图1h-i中染色体排列在细胞中央，为有丝分裂中期,其中图1h中的染色体能清楚的看到为长条状排列在细胞中央，即为有丝分裂中期细胞侧面观，图1i中的染色体则只能看到一小部分，可能为有丝分类中期细胞极面观。图j中染色单体分离，移向细胞的两级，为有丝分裂后期，但是与图1d中后期的图像有所不同，后面会进行分析；图1h可以看到姐妹染色单体已经分离，但是并没有移向细胞两极，只是散乱的分布细胞中。另外，笔者所用的5个经预处理的根尖材料所制成的装片中均未找到末期图像。abcdefghijk图1 不同时期经秋水仙素预处理及未处理的大蒜根尖分裂细胞3.2秋水仙素预处理对植物细胞有丝分裂的影响通过对比不同时期的经秋水仙素预处理及未经秋水仙素预处理的大蒜根尖分裂细胞的有丝分裂图像，可以看到：(1)与未预处理的相比，预处理组的有丝分裂前期细胞的染色体形态更加的清晰可见，可以看到染色体呈X型的形态，并能很容易的数出染色体条数(图1f-g)。(2)与未预处理的相比，预处理组有丝分裂后期细胞的染色体显然没有被“拉开”(图1j)，与秋水仙素抑制纺锤体形成有关，使得染色体无法在着丝粒的牵引下移向两极。在图1k表现最为明显，染色体中的姐妹染色单体已经分离，但是由于经过秋水仙素的处理，没有纺锤丝的存在，姐妹染色单体无法在着丝粒的牵引下移向细胞两极，全部聚集在细胞中央。这也最终导致了细胞无法完成一个完整的细胞周期，所以没有在制作的装片中找到预处理组的有丝分裂末期细胞。细胞无法完成完整的细胞周期，并且由于没有纺锤体的存在，有丝分裂中期、后期过程均被抑制，前期细胞相对未处理组所占比例更多。更多的染色体呈现如图1f-g所示的有丝分裂前期状态。3.3植物有丝分裂模式图abcde图 2 植物有丝分裂模式图图 2为本人自己绘制的植物有丝分裂模式图。参考文献1 Lima-de-Faria A. 2003. One hundred years of chromosome research and what remains to be learned. Springer Science&Business Media.2 Fukui K, Nakayama S eds. 1996. Plant chromosomes: laboratory methods. CRC Press.3 Zacharias H. 2001. Key word: chromosome. Chromosome Research, 9(5): 345-355.4 Harper PS.A short history of medical genetics. Oxford Univer