鸡卵粘蛋白活性的测定.ppt

亲和层析法纯化胰蛋白酶 1内容摘要亲和层析包括了一整套复杂的底物及其配体与生物大分子之间相互作用时所形成的独特的生物学特性 在亲和结合的过程中涉及到疏水力 静电力 范德华力及空间阻力等因素的影响 亲和层析的概念可以理解为配基以共价键的形式与水不溶性固体载体共价结合 形成具有高度专一性的亲和吸附剂 以该介质为填料填充亲和层析柱 从复杂的混合物中有针对性分离某一种成分 本实验以亲和层析方法分离纯化猪胰蛋白酶为目的 从猪胰脏提取液中分离纯化胰蛋白酶 最终得到纯度较高的胰蛋白酶 围绕亲和层析实验所涉及的蛋白质和酶基本性质及相关技术进行综合训练 其中主要包括亲和层析介质配基的制备 亲和介质的合成 蛋白质和酶的分离纯化 酶活性的测定等内容 通过综合训练 能够系统掌握蛋白质制备的基本原理和操作 学习如何进行实验设计 掌握实验过程中的关键环节 对实验中出现的问题进行科学的分析 使学生在学习实验技术的同时 自觉培养分析问题和解决问题能力 2实验目的方法掌握蛋白质分离纯化的基本原理与操作技术掌握亲和层析的基本原理及亲和介质合成技术掌握胰蛋白酶活性及抑制活性测定的原理和方法掌握消光系数法测定蛋白质的原理及计算方法 1 3实验流程鸡蛋清Spharose4B猪胰脏 提取 活化提取分离纯化 纯卵粘蛋白 CHOM 活化Spharose4B胰蛋白酶原粗提液 偶联激活 CHOM Spharose4B 胰蛋白酶提取液 亲和层析 酶促动力学 纯胰蛋白酶 酶活性测定 酶蛋白含量测定 1 4要求掌握的技术柱层析技术SephadexG 25分子筛层析DEAE Cellulose离子交换层析CHOM Sepharose4B亲和层析蛋白质提取技术10 TCA提取鸡卵粘蛋白3 5 乙酸 pH3 0提取胰蛋白酶原蛋白含量测定技术消光系数法测定胰蛋白酶含量消光系数法测定鸡卵粘蛋白含量 生物活性测定胰蛋白酶比活性测定鸡卵粘蛋白抑制活性测定亲和介质合成技术载体 Sepharose4B的前处理载体 Sepharose4B的活化活化载体 Sepharose4B的偶联 第二部分实验方法实验一鸡卵粘蛋白的分离纯化1鸡卵粘蛋白的基本性质1 1鸡卵粘蛋白的组成分子量 28000Da分子组成 四个分子量相近的亚基组成糖蛋白糖基部分 D 甘露糖 D 半乳糖 葡萄糖胺 唾液酸 1 2化学稳定性耐热 在80 条件下 理化性质不发生改变耐有机溶剂 在50 的丙酮溶液中 能保持良好的溶解度耐沉淀剂 在10 的TCA的溶液中不发生沉淀 1 3等电点性质等电点 pI在3 9 4 5之间溶液中的状态 在pH3 0的溶液中稳定 在pH8 0的溶液中容易分解鸡卵粘蛋白在10 的TCA不同pH值的溶液中的溶解状态见表1 表1 鸡卵粘蛋白在10 TCA溶液中的溶解度 1 2 鸡卵粘蛋白的提取2 1提取 每组发给50毫升的鸡卵清加入一定体积的10 pH1 15TCA溶液 轻轻搅拌一边搅拌一边加入 搅匀后用pH试纸检查pH值 待pH稳定在3 5 0 2后放置4 冰箱过夜 2 2离心 转移50毫升离心杯中 于3000rpm离心15min 2 3过滤 倾出上清液 滤纸过滤 滤去上浮脂类物质和不溶物2 4调pH值 用1mol LHCl将溶液精确调至pH3 5 量取体积 2 5丙酮沉淀 缓缓加入三倍体积预冷的丙酮 搅匀 用塑料薄膜封严 放置冰箱内静止4小时 2 6离心 虹吸出部分上清 将沉淀部分转移到50ml离心杯中 于3000rpm离心15min 2 7除残留丙酮 弃去上清液 将盛有沉淀的离心杯至于真空干燥器中 抽去残留丙酮 沉淀物的颜色由白变成透明胶状物即可 2 8溶解 加入25ml蒸馏水或20mmol L pH6 5磷酸缓冲液溶解 滤纸过滤 收集滤液 备用 3鸡卵粘蛋白的分离纯化3 1SephadexG 25柱脱盐 1 溶胀 称取15gSephadexG 25放入500ml的烧杯中 加入200ml蒸馏水 在室温下溶胀24小时或在沸水浴中溶胀2小时 2 装柱 取一支30 3cm的层析柱 将溶胀好的SephadexG 25装柱 自然沉降 3 处理 用2倍柱床体积的0 5mol LNaCl溶液洗柱 2倍体积的蒸馏水洗去残留的NaCl 4 平衡 用20mmol L pH6 5磷酸缓冲液平衡 流速控制在1 0 1 5ml min 紫外检测仪检测柱内平衡状态 直到仪器绘出稳定的基线 5 上样 将柱内的缓冲液液面流至于胶面相切 取20ml鸡卵粘蛋白提取液上样 待样液液面流至于胶面相切 加入2 3ml缓冲液冲洗层析柱内壁 待溶液液面流至于胶面相切 然后加入缓冲液距胶面高度约2 3cm 以同样的流速洗脱 6 收集 在检测仪上观察到开始出现峰时进行收集 见图1 图1SephadexG 25分子筛层析分离图谱 3 2Cellulose离子交换柱层析分离 1 溶胀 称取20gDEAE Cellulose放入500ml的烧杯中 加入150ml蒸馏水 在室温下溶胀24小时 2 装柱 取一支20 3cm的层析柱 将溶胀好的DEAE Cellulose装柱 自然沉降 3 再生 用200ml0 5mol LNaCl 0 5mol LNaOH混合溶液洗柱 再用蒸馏水洗至流出液的pH值达到pH8 0 用200ml0 5mol LHCl溶液洗柱 再用蒸馏水洗至流出液的pH值达到pH6 0 4 平衡 用20mmol L pH6 5磷酸缓冲液平衡 流速控制在1 0ml min 紫外检测仪检测柱内平衡状态 直到仪器绘出稳定的基线 5 上样 将经SephadexG 25柱脱盐的卵粘蛋白溶液上样 用20mmol L pH6 5磷酸缓冲液平衡 直到仪器绘出稳定的基线 流速控制在1 0ml min左右 6 洗脱 用0 3mol LNaCl 20mmol L pH6 5磷酸缓冲液 7 收集 在检测仪上观察到出现高峰时开始收集 见图2 图2 鸡卵粘蛋白在DEAE Cellulose柱的分离 3 3透析及丙酮沉淀 1 透析 将经DEAE Cellulose柱分离的鸡卵粘蛋白转入透析袋内 对蒸馏水透析 隔一段时间换一次水 直到渗出液经BaCl2溶液检查无氯离子存在 即可 2 调pH值 将透析好的鸡卵粘蛋白溶液 用0 1mol LHCl精确调至pH4 0 最好一次调成功 量体积 3 丙酮沉淀 加入3倍体积的预冷丙酮 搅匀 用塑料薄膜封严 在冰箱内静止4小时以上或过夜 4 离心 虹吸出部分上清 将沉淀部分转移到50ml离心杯中 于3000rpm离心15min 收集沉淀 5 干燥 将盛有鸡卵粘蛋白的离心杯放入真空干燥器中干燥 6 收集鸡卵粘蛋白成品 冰箱保存 4活性测定 1 标准胰蛋白酶活性测定空白 1 5ml缓冲液 1 5ml底物混匀 样品 1 5ml缓冲液 1 5ml底物 胰蛋白酶10 l混匀 立即测定 2 自提鸡卵粘蛋白抑制活性测定空白 1 5ml缓冲液 1 5ml底物混匀 样品 1 5ml缓冲液 鸡卵粘蛋白10 l 胰蛋白酶10 l混匀放置2min以上 1 5ml底物 立即测定 3 鸡卵粘蛋白含量测定取透析液0 3ml稀释10倍 测定A280 3实验结果 1 计算鸡卵粘蛋白收率 2 计算标准胰蛋白酶的比活性 3 计算鸡卵粘蛋白的抑制活性 5试剂配制5 1公用试剂 1 10 TCA溶液 pH1 15 1500ml 50ml 组 2 0 05mol L pH8 0Tris HCl缓冲液 内含0 2 CaCl2 200ml 3 2mmol LBAEE底物溶液200ml 4 1mg LTrypsin标准溶液10ml 5 2自配试剂 1 0 2mol pH6 6 PBS缓冲液120ml 10 2 0 3mol LNaCl 0 02mol L pH6 6 PBS缓冲液100ml 3 0 5mol LHCl溶液200ml 4 0 5mol LNaCl 0 5mol LNaOH溶液200ml 5 0 5mol LNaCl溶液250ml 6时间安排 实验二亲和层析纯化胰蛋白酶 1原理鸡卵粘蛋白 ovomucoid 简称CHOM 是胰蛋白酶的天然抑制剂 在pH7 8 8 0的缓冲溶液中二者发生专一性的亲和作用 以鸡卵粘蛋白为配基 偶联在已经活化的琼脂糖凝胶层析介质 Sepharose4B上 制备成鸡卵粘蛋白亲和层析介质 CHOM Sepharose4B 然后通过亲和层析法从胰蛋白酶粗提液中分离纯化胰蛋白酶 常用的载体活化与蛋配基偶联的方法有环氧氯丙烷活化和溴化氰活化法 反应的基本原理如下图所示 1 1环氧氯丙烷活化载体与蛋白质配基的偶联 活化 偶联 亲和结合 洗脱 1 2溴化氰活化载体与蛋白质配基的偶联 2亲和介质合成2 1琼脂糖凝胶层析介质 Sepharose4B 的活化2 1 1琼脂糖凝胶层析介质的处理称取10克琼脂糖凝胶层析介质 置于G 3玻璃烧结漏斗内 用100ml1 0mol LNaCl溶液抽洗 少量多次 100ml蒸馏水抽洗 抽干后转移到100ml三角瓶中备用 2 1 2配方琼脂糖凝胶层析介质 QT410克蒸馏水7ml1 4二氧六环8ml2mol LNaOH6 5ml环氧氯丙烷1 5ml 2 1 3活化将配制的好介质的三角瓶 放入45 恒温水浴中 于160转 分钟 振摇活化2小时 停止活化 转移到G 3玻璃烧结漏斗内 抽去活化剂 用100ml蒸馏水洗 少量多次 转移100ml到三角瓶中 准备偶联 2 2偶联称取约100mg鸡卵粘蛋白 用10ml0 1mol LpH9 5Na2CO3缓冲液充分溶解 取0 1ml稀释10倍测定OD280 计算溶液的蛋白浓度 然后将溶解好的鸡卵粘蛋白溶液 转移到100ml三角瓶中与活化的琼脂糖凝胶介质混匀 在40 恒温水浴中 于160转 分钟 振摇偶联22小时左右 停止偶联 2 3洗涤取一个洗净的500ml抽滤瓶 将已经偶联好的琼脂糖凝胶层析介质转移到G 3玻璃烧结漏斗内抽滤 收集滤液 测定滤液中剩余的鸡卵粘蛋白的含量 用100ml1 0mol LNaCl溶液抽洗 100ml蒸馏水抽洗 再用20ml亲和层析洗脱液洗涤 将亲和介质转移到50ml的小烧杯内 加入20ml亲和层析平衡液 浸泡20分钟 脱气 装柱 3胰蛋白酶粗提液的制备3 1胰蛋白酶的基本性质3 1 1存在形式 胰蛋白酶通常是以胰酶原的形式存在于动物的胰脏或其他组织中 在底物的诱导下或激活剂的作用下 酶原的C端水解 去6肽转变成具有活性的胰蛋白酶 6肽胰蛋白酶原胰蛋白酶Ca 2激活剂 3 1 2等电点与分子量 胰蛋白酶原的pI 10 8 分子量 24000Da胰蛋白酶的pI 8 9 分子量 23700Da 3 1 3稳定性胰蛋白酶在酸性环境中很稳定 在碱性环境中容易自溶 在提取的过程中要注意溶液的pH值 当溶液的pH 2 0容易变性pH 3 0生物活性稳定pH 7 0容易自溶 3 2胰蛋白酶原的提取 1 匀桨 取约30克猪胰脏 剥去结缔组织和脂肪 取净重20 25克左右 剪成碎块 转移到组织捣碎器内 加入150ml预冷的3 5 的乙酸酸化水 匀桨 2 提取 转移到500ml烧杯中 用2mol L硫酸调节pH值在3 5 4 0之间 10 搅拌提取约4小时 3 过滤 取一块纱布 折叠成四层 用水润湿 放在玻璃漏斗上 将胰蛋白酶原提取液过滤 收集滤液 4 酸化 用2mol L硫酸调节滤液的pH值至2 5 3 0之间 4 冰箱静止沉淀4小时以上 5 过滤 折叠滤纸过滤 收滤液 3 3胰蛋白酶原的激活 1 调节pH值 用5mol LNaOH将滤液精确调节pH值至pH8 0 量取溶液体积 2 加激活剂 加入固体CaCl2使溶液的Ca 2终浓度达到0 1mol L 然后加入约5mg结晶胰蛋白酶 混匀 激活 3 激活时间 在4 冰箱内激活12 16小时 在25 恒温水浴中激活2 4小时 3 4停止激活 1 活性测定 取1ml上清液分别测定蛋白浓度和活性 具体操作见活性测定部分 2 停止激活 等酶溶液的比活性达到1000u mg左右 用2mol L硫酸调节pH值到3 0 3 过滤 滤纸过滤 滤去CaSO4沉淀 收集滤液 4 冰箱保存 4亲和层析分离胰蛋白酶 1 装柱 取一支层析柱 10 1 0cm 将合成好的亲和层析介质CHOM Sepharose4B装入柱内 自然沉降 2 平衡 以0 1mol L pH8 0Tris HCl缓冲液 内含0 5mol LKCl 50mmol LCaCl2 平衡 3 上样 将以经激活的胰蛋白酶提取液 用5mol LNaOH精确调节pH值至pH8 0 滤纸过滤 取滤液上样 通过亲和介质的偶联量和胰蛋白酶粗提液的比活性 计算出上样所需体积 计算方法如下 偶联mg数 0 86 1 3 104 u mg 上样体积 ml 粗酶浓度 mg ml 比活 u mg 4 平衡 上完样以后 以0 1mol L pH8 0Tris HCl缓冲液 内含0 5mol LKCl 50mmol LCaCl2 平衡 洗去未被吸附的杂蛋白 5 洗脱 等平衡到基线稳定后 用0 1mol L pH2 5甲酸 0 5mol LKCl溶液洗脱 收集洗脱峰 6 亲和层析洗脱曲线 胰蛋白酶活性测定1胰蛋白酶活性测定1 1胰蛋白酶测定的基本原理胰蛋白酶是一种蛋白水解酶 它除了能水解碱性氨基酸与其它氨基酸形成的肽键外 还能水解碱性氨基酸所形成的酯键 催化活性具有高度的专一性 因此 可以用人工合成的N 苯甲酰 L 精氨酸乙酯 N benzoyl L argineethylester 简称BAEE 为底物测定胰蛋白酶活性 N 苯甲酰 L 精氨酸乙酯 BAEE 在碱性条件下 经胰蛋白酶作用水解去一个乙基生成N 苯甲酰 L 精氨酸 BA 催化反应原理如图所示 由于BAEE在波长253nm处的光吸收值远远弱于BA 因此 可以在加入酶为零点 测定在X分钟内的递增吸光值 通过酶的定义求出酶活性 1 2测定胰蛋白酶活性的定义底物浓度C 1mmol L光程 L 1cm波长 253nm1个BAEE单位温度 T 25 体积 V 3ml递增值 O D 0 001A 1 3计算公式 1 活性单位 O DBAEE单位 u ml N 稀释倍数 0 001 2 比活性测得的BAEE活性单位 u ml BAEE单位 u mg 胰蛋白酶浓度mg ml 加入体积 ml 2鸡卵粘蛋白活性的测定鸡卵粘蛋白是胰蛋白酶的天然抑制剂 通常1 g鸡卵粘蛋白能抑制0 86 g胰蛋白酶的活性 相当于1 0 86 在胰蛋白酶液中加入适量的鸡卵粘蛋白 胰蛋白酶活性就会降低 胰蛋白酶递减的活性就是鸡卵粘蛋白的抑制活性 在同样的条件下分别测定出未加鸡卵粘蛋白的胰蛋白酶活性A1和加鸡卵粘蛋白的胰蛋白酶活性A2 将A1 A2就可以得到鸡卵粘蛋白的抑制活性 计算公式如下 1 抑制活性A1 A2BAEE单位 Iu ml N 稀释倍数 0 001A1 胰蛋白酶活性A2 加鸡卵粘蛋白的胰蛋白酶活性 2 抑制比活测得的BAEE活性单位 Iu ml BAEE单位 Iu mg 鸡卵粘蛋白浓度 mg ml 加入体积 ml 3蛋白质含量测定3 1消光系数的定义 在蛋白质分子中含有芳香族氨基酸 芳香族氨基酸在280nm处有最大吸收峰 蛋白质分子中含有芳香族氨基酸的数量以及分子的紧密程度有差异 在280nm处的光吸收强弱不同 在一定的条件下 一种纯的蛋白质在在280nm处的光吸收值是一个常数 因此酶以纯的蛋白质在280nm处都有一个的消光系数A280 用符号表示为E1 1cm 这个符号的定义是指在浓度为1 W V 的蛋白质溶液中 测定光程为1cm的条件下 该蛋白的吸光值 如 胰蛋白酶的E1 1cm是13 5 是指胰蛋白酶的浓度为1 g 100ml 光程为1cm时光吸收值A280 13 5 当胰蛋白酶的浓度0 1g 100mg 100ml 时 光程为1cm 光吸收值A280是1 35 当鸡卵粘蛋白的浓度1 g 100ml 时 A280是4 13 浓度100 mg 100ml 时 A280是0 413 在计算时大多数使用的蛋白浓度都是1