第6章（第二节）+人工种子.ppt

第二节人工种子的研制 人工种子概述 繁殖体种类及其培养技术 人工种子制备 人工种子研究及应用前景 一 人工种子概述 人工种子 artificialseeds 亦称体细胞胚种子 1978年Murashige在Reinert 1958 和Steward 1958 等人在体细胞胚胎发生 SomaticEmbryogenesis 的研究中发现 利用植物组织培养中体细胞所形成的胚状体可以获得人工种子 接着 Kitto和Janick也于1982年制成了胡萝卜胚状体的人工种子 因此 早期的人工种子 Plantartificialseeds 是指将植物离体培养物中产生的胚状体 包裹在含有养分和保护功能的外皮中 在适宜的条件下能够发芽出苗的颗粒体 它应符合以下条件 1 具有发育良好的胚状体 能发育成正常完整的植株 2 具有能提供种胚发育所需要的营养 即人工胚乳 3 具有能起保护作用种皮 即人工种皮 人工种子概念的拓展 随着人工种子研制工作的发展 其概念也发生了变化 Kamada 1985 认为 用含有营养成分的胶囊包裹着一个能发育成植株的培养体 包括胚状体 芽体 小鳞茎等 都可称为人工种子 1987年 Bapat等首次用桑树试管苗腋芽制成人工种子 证实了Kamada的观点 随后 Mather等 1992 用瓦氏缬草顶芽 沈大棱等 1991 用水稻不定芽 邓志龙等 1992 用安祖花愈伤组织块 何奕昆等 1997 用半夏组培产生的小块茎 都制成了人工种子 总体来说 完整的人工种子应包括能发育成植株的繁殖体 人造胚乳 有助于种子贮藏 发芽或生长的助剂 人工种皮等三大部分组成 但目前的研究通常将人工胚乳也种皮化了 由于一些植物在离体培养时能够产生小球茎 如荸荠 小块茎 如马铃薯 所以它们在制作人工种子时并不需种皮和胚乳包裹 因此 任何一种经人工种皮包被或裸露的 具有形成完整植株能力的繁殖体均可称之为人工种子 繁殖体 具有成株能力的离体培养物 人工种子的结构 繁殖体 人工种皮 人工胚乳 繁殖体 离体培养产生的胚状体 球茎 茎段 芽 块茎等 在实验中 有时将人工种子的种皮与胚乳合二为一 微鳞茎 微块茎等甚至不需要包被 标准结构 人工种子分类 根据包被的程度 裸露的或休眠的繁殖体如微鳞茎 微块茎等 它们在不加包被的情况下也具有较高的成株率 人工种皮包被的繁殖体一些胚状体 原球茎等不能够过度干燥 但只需要用人工种皮包被即可维持良好的发芽状态 如胡萝卜胚状体 水凝胶包埋再包被人工种皮 即有人工种皮和人工胚乳包被 的繁殖体大多数体细胞胚 不定芽 茎尖等均需要先包埋在半液态凝胶中 再经人工种皮包裹才能避免失水 从而维持良好的发芽能力 根据繁殖体的类型 胚状体人工种子 非胚状体人工种子 以胚状体为繁殖体的人工种子 以器官 芽 鳞茎 球茎等 为繁殖体的人工种子 研制人工种子的意义 在无性繁殖植物中 有可能建立一种高效快速的繁殖方法 它既能保持原品种的种性 又可以使之具有复壮效应 可以对优异杂种种子不通过有性制种过程而获得大量种子 特别是对于那些制种困难的植物更具实用意义 对于一些不能正常产生种子的特殊植物材料如三倍体 非整倍体 工程植物等 可通过人工种子在短期内扩大繁殖和应用 与田间制种相比 可以节省制种用地 不受季节限制 实现工厂化生产 并且避免了种子携带病原菌的危险 与利用试管苗相比 可避免移栽的困难 而且可进行机械化操作 便于储藏和运输 马铃薯试管小块茎人工种子 试管小块茎人工种子在田间种植 二繁殖体的种类及其培养技术 繁殖体是人工种子的主体 早期的研究认为 胚状体是制备人工种子的最佳繁殖体 但实际上 以胚状体作为繁殖体并不适用于所有的植物 因为其遗传变异大 而且许多植物的胚状体诱导很困难 因此 以微器官制作人工种子的报道日益增多 例如 1990年 有关人工种子的报道以胚状体为繁殖体的占63 6 以芽为繁殖体的占36 4 1994年 以胚状体为繁殖体下降到48 8 以芽为繁殖体的则占38 1 并另有13 1 为其它类型的繁殖体 不同类型繁殖体比较 繁殖体生产 一 不同繁殖体的比较 体细胞胚其形成至少需要经过两个阶段 1 在含高生长素的培养基中 诱导胚性细胞的形成 2 在较低生长素或没有生长素的培养基中形成胚状体并发育成熟 微芽其发生一般只需要一个培养程序 但为了增加繁殖体的数量 一般也需进行多代的继代增殖 微型变态器官如块茎 块根以及鳞茎 球茎类的繁殖体 其产生一般需要经过几个诱导程序 部分植物繁殖体诱导所需的培养条件 不同繁殖体成苗所需时间及成株率 BACK 二 繁殖体的生产 体细胞胚 微型变态器官 微芽 体细胞胚的规模化生产 作为人工种子繁殖体的胚状体 其最基本的要求是要有发育的同步性 并满足如下标准 其一 形态正常 具有完整的胚结构 其二 与母体植物的基因型基本相同 特别是在重要经济性状和农艺性状上没有发生变异 其三 具有较好的成熟性 能耐一定程度的脱水 另外 作为实用化的胚状体人工种子还必需实现批量生产 以大幅度降低生产成本 例如 Choi等 2002 建立了人参体细胞胚大规模液体培养体系 每500ml容器可生产胚状体12 000个 将发育至子叶期早期的胚状体转入1 2MS无机盐 9 蔗糖的培养基中 可诱导其进入休眠 获得了良好效果 其它一些植物如芹菜 苜宿等体细胞胚的批量化生产也取得较好结果 培养基的蔗糖浓度 现有研究资料显示 培养条件下变态器官的形成与培养基的蔗糖浓度有关 较高的蔗糖浓度对于一些植物的微型变态器官形成是必要的 激素 植物变态器官的形成常常与内源激素的变化有关 外源激素的作用也要通过内源激素的变化而起作用 微型变态器官繁殖体的培养 微器官的生产 光照 能够形成变态器官的植物常常具有光照周期的需要 而且光照强度也可能是影响变态器官形成的重要因素之一 温度 离体培养诱导变态器官形成时 必须充分考虑自然条件下该植物变态器官产生所需要的温度条件 芽繁殖体的培养 大多数情况下 微芽 不定芽往往直接从外植体上直接发生 培养方式比较简单 也不需要高浓度的激素处理 因此 所产生的繁殖体能够保持原有品种的特性 根据植物类型的不同 所选取的外植体也不大相同 例如 非洲紫罗兰一般选用叶片诱导不定芽 榆树类植物选用根来产生微芽 而石竹类花卉则选用茎尖来诱导侧芽 三 人工种子的包被 体细胞胚形成后 还需要在无激素培养基上经过一定阶段的后熟培养 才能进行脱水干燥 剔除畸形胚后再进行包埋 在脱水之前可用ABA处理 强迫其进入休眠状态 利于长期贮存 微器官繁殖体不能过度脱水 但也要适当干燥 除去表面及多余的水分 并需要进行表面消毒处理 防止包被后的微生物感染 为了延长贮存的时间 最好是根据使用的季节进行一定的休眠处理 以芽为繁殖体的类型 则不能进行脱水处理 但必须筛选生长健壮 组织充实的芽进行包埋 一 繁殖体的预处理 人工胚乳 由包埋基质和胚乳介质组成 对包埋基质的要求 对繁殖体及其它生物无毒害作用 具有一定的缓冲作用 以保证繁殖体在生产 运输和种植操作中的安全 具有一定的保水性 能吸水回涨 成本低 工艺简单 二 繁殖体的包埋 最常用的包埋基质为海藻酸钠 以CaCl2作络合剂进行固化 海藻酸钠具有生物活性 无毒 强度较高 成本低 操作简单等优点 但也存在保水性差 水溶性成分易渗漏 易失水 干燥到一定程度后不易吸水回涨等缺点 用某些纤维素衍生物与海藻酸钠进行复合改性后的包埋基质 如海藻酸钠 聚氮基葡萄糖等 既保留了海藻酸钠基质的特点 又具有良好的透气性 保水性和吸水回涨性能等 是新型的包埋基质 另外 也有人使用一些新材料 如婴儿用品 胚乳介质 胚乳介质的选择原则为 有利于人工种子的贮藏 萌发及转株 它至少应包含繁殖体萌发时所需的养分和生长调节剂 此外 还应含有一些防腐剂和防衰老物质等 在大多数的研究中 一般采用该植物组织培养时所用的培养基和激素来配制胚乳介质 由于繁殖体的含水量较高 贮存中极易受到微生物感染 在胚乳介质中还应有适当的杀菌剂 两种常用的胚乳介质配方 MS 或SH White 培养基附加1 5 的马铃薯淀粉水解物 SH 培养基附加1 5 的麦芽糖 几种植物人工种子的附加成分及成苗率 陈正华等 1998 以海藻酸钠作包埋剂的操作程序 在配制好的海藻酸钠溶液中 按一定比例加入繁殖体并混匀 将其逐滴滴入2 0 2 5 的CaCl2溶液中 经20 30min的离子交换作用后即形成包含繁殖体并具有一定刚性的人工种子 用无菌水漂洗20min 晾干备用 图多头自动人工种子包被系统示意图1 双活塞泵 2 灭菌器 3 加湿器 4 振动器 5 脉动腔膜 6 同轴沟 7 脉动腔 8 喷碟 9 旁路系统 10 反应池 11 搅拌子 12 硬化溶液及其输入 引自Brandenberger和Widmer 1998 a 番木瓜体细胞胚人工种子 Castillo等 1998 b 马铃薯微芽人工种子 Patel等 2000 c 人参体细胞种子 Choi和Jeong 2002 实验室制作人工种子 人工种皮的存在问题 人工种子在无菌条件下的转株率很高 如旱芹人工种子的转株率已达90 以上 三七人工种子达89 7 但在有菌条件下转株率还很低 有时甚至为 这也是人工种子转入生产实用化阶段的难题 这一问题有赖于人工种皮的解决 用至今所报道的包埋方法得到的人工种子 仍存在表面发粘 强度小 不利于运输及播种 营养渗漏快 保水能力差 易受土壤及环境影响等问题 因此 国内外都在试图寻找一种能接近天然种皮的高分子有机材料作为人工种皮 并取得了一些进展 三 人工种皮的装配 理想的人工种皮应具有如下特性 较好的封闭性以保证人工胚乳的各种成分不易流失 同时又具有良好的透气性 具有一定的坚硬度 以加强人工种子的耐储运性和适于机械化操作 无毒无害 能保证繁殖体顺利穿透发芽 成本低廉 操作简单 常用的人工种皮材料 早期使用Elvax4260涂膜 但价格昂贵 操作复杂 包裹效果也不尽人意 新近试验的二氧化硅化合物 它包括了疏水的Tullanox和微亲水的Cab O Sil 能够以粉末状包裹在人工种子胶