外周血PSA、PSAmRNA联合检测在前列腺癌诊断中的临床应用(1)(精).doc

外周血PSA、PSA mRNA联合检测在前列腺癌诊断中的临床应用(1)作者：辛华马雷高英英 郭宇航孙玉鸿江清林刘国辉【摘要】 目的 探讨利用外周血PSA、PSA mRNA联合检测诊断前列腺癌（PCa）的临床应用及意义。方法 运用酶联免疫分析和巢式RT?PCR检测22例PCa、10例良性前列腺增生（BPH）患者，5例健康男性和5例健康女性外周血中PSA、PSA mRNA的情况。结果PCa患者血清PSA的水平与临床分期、Gleason评分有关（P0?05），而与年龄无关（P0?05）；外周血PSA、PSA mRNA与临床分期、内分泌治疗有关（P0?05），而与年龄、Gleason评分无关（P0?05）；22例PCa标本中PSA mRNA阳性表达15例，阳性率68%，10例BPH和10例阴性对照标本无表达。结论 利用外周血PSA、PSA mRNA联合检测是一种早期发现PCa微转移，判断其临床变化过程、分期、预计复发和评价疗效的方法。 【关键词】 前列腺特异抗原；前列腺癌；前列腺增生；逆转录聚合酶链式反应临床上大约有50%的前列腺癌(PCa)病人在确诊时就已经发生了转移,病变已属晚期，预后不良13。国外报道血清游离PSA与外周血PSA mRNA联合检测PCa在鉴别良、恶疾病上有一定优越性4，5。国内这方面报道较少。应用RT?PCR技术检测外周血中存在的少量癌细胞，可以发现微转移，对肿瘤的复发、转移、预后及临床治疗具有指导意义6，7。本研究采用酶联免疫技术和巢式RT?PCR技术联合检测外周血PSA和PSA mRNA，以提高PCa微转移的诊断效率、监测复发、预测肿瘤分期及预后。1 材料与方法1?1 病例资料PCa组：选择20052006年佳木斯大学附属第一医院、佳木斯市中心医院门诊和住院病人。22例均为初诊PCa患者，均经前列腺穿刺病理诊断，年龄6482岁，平均72岁。22例PCa患者中有15例接受了内分泌治疗，7例未接受。BPH组：10例均为行前列腺经尿道电切术后病理证实患者，年龄3481岁，平均65岁。阴性对照组：5例男性健康志愿者（检测前1个月限制性生活）和5例女性健康志愿者，血液学指标均正常，年龄2545岁，平均38岁。1?2 仪器及材料Ficoll淋巴细胞分离液购自中国医学科学院天津血液病研究所，总RNA提取RNAiso试剂盒、两步法RT?PCR试剂盒购自大连生物工程有限公司，引物由上海生物工程服务技术有限公司合成，PSA定量试剂盒购自美国博检生物试剂有限公司。Biometra Tg PCR 仪：华粤企业集团有限公司；DU800核酸蛋白分析仪：Beckman公司；免疫分析仪器：DNM9602G型酶标分析仪（北京普朗仪器公司）。1?3 引物序列PCR引物：（1）外引物：PSA?494：5?TACCCACTGCATCAGGAACA?3；PSA?960：5?CCTTGAAGCACACCATTACA?3。（2）内引物：PSA?559：5?ACACAGGCCAGGTATTTCAG?3；PSA?894：5?GTCCAGCGTCCAGCACACAG?3。?actin 上游：5?CGGGAAATCGTGCGTGACAT?3；下游：5?GAACTTTGGGGGATGCTCGC?3。扩增目的片段长度为712 bp。1?4 血清的提取抽取空腹静脉血（各项检查前）5 ml，立即2 000 r/min离心10 min，分离血清置-20保存，1 w内完成实验。1?5 外周血单个核细胞的提取抽取5 ml静脉血（各项检查前）肝素抗凝，用Ficoll淋巴细胞分离液分离白细胞置-80冰箱保存，提取过程按其说明书操作。1?6 总RNA的抽提及质量鉴定用Trizal试剂提取总RNA，提取过程按其说明书操作。提取产物用1?2%甲醛变性琼脂糖凝胶电泳鉴定总RNA质量。紫外分光光度计下测OD260、OD280，测定RNA纯度和浓度。取OD260/OD280值在1?82?0范围内的标本进行逆转录。所有实验中的塑料制品及实验用具均经0?1轕C水处理后高压灭菌。1?7 RT?PCR取1 g总RNA进行逆转录反应；取逆转录产物2 l和PSA上下游外、内引物各1 l，使用20 l反应体系进行2次PCR（2次PCR反应体系相同），同时扩增PSA、?actin和阴性对照cDNA（由健康女性外周血白细胞RNA逆转录获得）。具体循环参数为：94 4 min，94 45 s，55 30 s，72 45 s；25个循环之后，72延伸10 min。PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳后用EB染色，经凝胶成像系统拍照。1?8 血清PSA的检测PSA定量检测由专人严格按说明书进行操作。1?9 统计学处理应用SPSS10?0软件对数据进行处理，采用t检验、2检验。2 结果2?1 PCa组、BPH组、阴性对照组血清PSA检测结果见表1。表1 PCa组、BPH组、阴性对照组血清PSA的检测结果（略）2?2 PCa组血清PSA检测结果与临床参数的关系见表2。表2 PCa组血清PSA与临床参数的关系(略)PCa组血清PSA的水平在3个年龄分组中总体比较无显著性差异（P0?05），在3个临床分期中总体比较有显著性差异（P0?05），在3种Gleason评分中总体比较有显著性差异（P0?05）。2?3 PCa组、BPH组、阴性对照组外周血PSA mRNA表达情况PCa病人外周血标本经PSA巢式PCR外、内引物两次扩增后，产物在同一琼脂糖上得到PSA的RT?PCR特异性条带（图1）。PSA经巢式PCR扩增最终可得到特异性条带（图2）。PCa组、BPH组、阴性对照组外周血PSA mRNA表达情况见表3。表3 PCa组、BPH组、阴性对照组外周血PSA mRNA表达情况（略） PCa组PSA mRNA阳性表达明显高于BPH组，差异有显著性意义（P0?05）。2?4 PCa组外周血PSA mRNA表达情况与临床参数的关系见表4。表4 PCa组外周血PSA mRNA表达情况与临床参数的关系（略） PSA mRNA表达情况在3个年龄分组中总体比较差异无显著性（P0?05），在3种Gleason评分中总体比较无显著性差异（P