乳酸菌抑制致病菌黏附作用机制研究进展.doc

乳酸菌抑制致病菌黏附作用机制研究进展摘 要：乳酸菌是人类和动物小肠道中的优势菌群，对抑制病原菌的入侵与感染和维持消化道内微生物区系平衡等都具有重要意义。乳酸菌依靠其表面的蛋白、多糖等黏附宿主肠上皮细胞，使其定植进而发挥抑制致病菌黏附和抑制致病菌生长等重要生理作用。本文就乳酸菌表面与黏附相关的因子及其抑制致病菌黏附和抑制致病菌生长的作用机制进行综述。关键词：乳酸菌，致病菌，黏附，抑制，作用机制The development of the Lactobacillus adhensive effects mechanism ininhibiting the pathogen microorganismAbstract：Lactic acid bacteria is the predominant bacterium in the small intestine of human being and animals，which inhibit the pathogens invasion and infection and take a great significance to maintain the balance ofdigestive tract. The precondition of the anti-pathogen is by mean of the mechanism that lactobacillus can bindon the surface of the intestinal tracts epithelium by their surface protein and polysaccharide，then form thepredominant bacterium，which take a antagonistic action. Various factors about adhesion and the mechanism ofthe lactobacillus against the pathogenic bacteria were reviewed in this paper.Key words：Lactobacillus；pathogenic bacteria；adhesion；inhibition；mechanism乳酸菌（Lactic acid bacteria，LAB）是能发酵碳水化合物产L、D型乳酸的一类非病原性、不产芽孢、革兰氏阳性细菌的通称，包括乳杆菌（Lactobacillus）、乳球菌（Lactococcus）和双歧杆菌（Bifidobacterium）等至少18个属，共有200多种。乳酸菌在自然界中分布十分广泛，也是人类和动物小肠道中的优势菌群。乳酸菌菌体及其代谢产物等在动物小肠道中可形菌体屏障，提供人和动物所不能合成的维生素，也可抑制病原菌的入侵与感染和维持消化道内微生物区系平衡等。目前，乳酸菌已广泛地用于医药、食品和饲料等行业中，被公认为是安全的（generally recognizedas safe，GRAS）益生微生物1。肠道致病菌需先黏附肠上皮细胞并定植宿主，从而引发疾病。乳酸菌的细胞壁由多层肽聚糖（peptidoglycan，PGN）组成，肽聚糖上镶嵌着脂磷壁酸、壁磷壁酸、胞外多糖、Sortase依赖蛋白、S层蛋白及其他表面蛋白等2（见图1）。乳酸菌依靠其表面的蛋白、多糖等黏附宿主肠上皮细胞并定植，分泌代谢产物等，进而发挥抑制致病菌黏附和抑制致病菌生长等重要生理作用。本文就乳酸菌表面与黏附相关的因子及其抑制致病菌黏附和抑制致病菌生长的作用机制进行综述。1 乳酸菌表面与黏附相关的因子1.1 表面蛋白乳酸菌表面与黏附相关的表面蛋白主要包括s-层蛋白、引物酶Sortase依赖蛋白、黏膜结合蛋白、黏附胞外间质的表面蛋白等。这些表面蛋白大都由一个信号肽序列、一个LPXTG锚定基序和一个跨膜结构域组成的。s-层蛋白是由单一蛋白质或者糖蛋白亚基组成，呈一定规则的单分子晶状排列，并覆盖于LP/TG胞外多糖S层蛋白Sortase依赖蛋白分泌蛋白其它表面蛋白细胞壁细胞膜肽聚糖壁磷壁酸脂磷壁酸图1 乳酸杆菌表面分子结构示意图2Fig.1 Cell surface architecture pattern of Lactobacilli2386专 题 综 述2013年第20期Vol . 34 , No . 20 , 2013表1 乳酸菌中与黏附相关的表面蛋白Table 1 The surface protein of Lactobacillus about the adhensive effects表面蛋白 黏附素 黏附组织 菌种/菌株 参考文献S-层蛋白slpA、CdpA Caco-2细胞 Lactobacillus acidophilus NCFM 10-11CbsA 胶原，层黏蛋白 Lactobacillus crispatus JCM 5810 12slpA 鼠的回肠上皮细胞 Lactobacillus acidophilus M92 13slpA 纤连蛋白，人肠上皮细胞 Lactobacillus brevis ATCC 8287 14引物酶Sortase依赖蛋白LspA 人上皮细胞 Lactobacillus salivarius UCC118 15Mub（LBA1392） 人的上皮细胞系 Lactobacillus acidophilus NCFM 10Mub鸡的肠黏液，猪的黏液蛋白Lactobacillus reuteri 1063 16Msa甘露糖苷类物质Lactobacillus plantarun WCFS1 17黏膜结合蛋白Lsp 黏膜 Lactobacillus salivarius UCC118 15Mub 鸡的肠黏液，猪的黏液蛋白 Lactobacillus reuteri 1063 16Msa甘露糖苷类物质Lactobacillus plantarum WCFS1 17Mub人的上皮细胞系Lactobacillus acidophilus NCFM 10黏附胞外间质的表面蛋白CnBP 型胶原 Lactobacillus reuteri NCIB 11951 18MapA 猪的肠黏液，人的Caco-2细胞 Lactobacillus reuteri 104R 19-20FbpA纤连蛋白Lactobacillus acidophilus NCFM 10SlpA胶原蛋白Lactobacillus brevis ATCC 8287 14乳酸菌细胞表面形成蛋白质层。s-层蛋白具有呈倾斜网格排列，类似六边形或正方形的对称、高度有序、稳定的单体晶体三维结构3。乳酸菌表面蛋白的氨基酸组成中含有大量疏水性氨基酸，组成s-层蛋白的疏水性氨基酸含量在40%60%之间，如副干酪乳杆菌M7（Lactobacillus paracasei M7）S-层蛋白中疏水性氨基酸占氨基酸总量的43.24。高含量的疏水性氨基酸是乳酸菌自凝的基础，凝集的乳酸菌分布在肠上皮细胞上，形成阻止致病菌定植及繁殖的屏障5-6。另外，s-层蛋白中所含的疏水性氨基酸也有助于乳酸菌与致病菌竞争黏附位点，进而对致病菌的黏附和定植肠上皮细胞起到阻碍作用。另外，引物酶Sortase依赖蛋白（sortase-dependent proteins，SDPs）是能被引物酶Sortase识别，在苏氨酸（T）和甘氨酸（G）残基间剪切，苏氨酸残基共价连接肽聚糖交叉桥的氨基基团，一端嵌入细胞壁而另一端暴露在细胞表面的一种表面蛋白7。黏膜结合蛋白是一种以共价结合细胞壁肽聚糖的转运蛋白，具有一个黏膜结合区域（MUB）结构，这结构域含有的氨基酸数目在100到200个之间。von Ossowski等8研究发现鼠李糖乳杆菌GG（Lactobacillus rhamnosus GG）表面的LPXTG蛋白粘液结合因子（MBF），能作为特定粘液表面的粘附素，辅助参与由菌毛介导的黏膜粘连。乳酸菌表面还具有黏附胞外间质的蛋白，可黏附宿主细胞上的胞外间质，胞外间质是由从上皮伸向黏膜的层黏连蛋白、胶原蛋白和纤连蛋白组成的9。乳酸菌表面这些引物酶Sortase依赖蛋白、黏膜结合蛋白、黏附胞外间质的表面蛋白等，可帮助乳酸菌与致病菌竞争肠道受体并占据其潜在结合位点。这些表面蛋白都调控着乳酸菌对宿主组织的黏附（见表1）。1.2 脂磷壁酸乳酸菌细胞壁由肽聚糖和和磷壁酸（TAs）所构成，磷壁酸是所有乳酸菌细胞壁的重要成分，分为壁磷壁酸（WTA）和脂磷壁酸（LTA），磷壁酸通常由多聚磷酸甘油酯或多聚磷酸核糖醇的重复单位组成，它们通过共价键嵌定到肽聚糖形成壁磷壁酸（WTA），或结合在细胞膜上形成脂磷壁酸（LTA）。脂磷壁酸（LTA）是构成乳酸菌细胞外层疏水部分的主要成分，主要起非特异性黏附作用21。LTA中的游离类脂在乳酸菌的细胞表面形成微毛结构，在乳酸菌黏附肠上皮细胞过程中构成配体部位。LTA具有低等电点特性，可在乳酸菌表面形成较多的负电荷，乳酸菌通过这种静电引力与受体肠上皮细胞进行黏附。Granato等22发现从约氏乳杆菌La1（Lactobacillus johnsoniiLa1）中提取的LTA能够抑制致病菌对Caco-2细胞的黏附作用。Kim等23发现从植物乳酸菌中分离的LTA能抑制由病原菌引起的动脉粥样硬化斑块炎症反应，同时也能显著抑制人结肠癌细胞株HT-29中由TNF-诱导产生的炎症反应24。1.3 胞外多糖乳酸菌能分泌胞外多糖，多糖化学结构复杂，多糖的单体特性、单糖的链接及分支部位和替代基团方式都存在不同，构成乳酸菌特有的细胞壁结构25。乳酸菌的胞外多糖可通过影响乳酸菌细胞表面物理化学特性，使其在表面非特异性作用中起到关键作用；胞外多糖也可屏蔽其他细胞表面的黏附因子，间接影响其他细胞的黏附作用；也可作为宿主配体或抑制致病菌凝集，从而调节乳酸菌特异性黏附和凝集26。Ruas-Madied等26-27发现胞外多糖对于益生菌和肠道致病菌的竞争性黏附作用起到调控作用；同时，也发现乳酸菌及双歧杆菌产生的胞外多糖能减弱真核细胞细菌毒素。Lebeer等28发现在肠道内鼠李糖乳杆菌GG（Lactobacillus rhamnosus GG）产生的胞外多糖能为机体的先天免疫形成保护屏障，使其能在肠道内黏附。2 乳酸菌抑制致病菌黏附的作用机制2.1 竞争黏附位点乳酸菌可竞争性占据肠上皮细胞上的黏附位387Science and Technology of Food Industry专 题 综 述2013年第20期点，抑制致病菌的黏附。研究表明，乳酸菌主要通过其细胞表面的脂磷壁酸、s-层蛋白、胞外多糖等生物化学物质与宿主肠上皮细胞上的受体物质结合而完成黏附。Neeserjr等29的研究表明，约氏乳杆菌（Lactobacillus johnsonii）产生的重要糖类物质asialo-GM1能够竞争性占据致病菌EPEC（EnteropathogenicEscherichiacoli）、ETEC（Enterotoxigenic Escherichiacoli）在肠上皮细胞的潜在黏附位点，抑制致病菌EPEC、ETEC在肠上皮细胞上的黏附。Blomberg等30从乳仔猪小肠黏膜发酵乳杆菌（Lactobacillus fermentum）中分离到一种蛋白质类代谢产物，这种蛋白质类代谢产物有效地阻止了ETEC（Enterotoxigenic Escherichiacoli）K88ab、K88ac菌株纤毛对乳仔猪回肠黏膜的黏附作用。Fujiwara等31研究发现，长双歧杆菌SBT2928（Bifidobacterium longum SBT2928）分泌的一种蛋白质能有效地抑制产肠毒素大肠杆菌Pb176对糖脂受体GA1及肠上皮样细胞HCT-8的黏附。Dhanani等32发现植物乳酸菌CS24 . 2（Lactobacillus plantarumCS24.2）及鼠李糖乳杆菌GG（Lactobacillus rhamnosusGG）能竞争性抑制大肠杆菌O26H11对HT-29细胞的黏附。Ren等33发现唾液乳杆菌（Lactobacillussalivarius）及植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）能强烈抑制金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）对Caco-2细胞的黏附作用。Snchez等34从培养过植物乳杆菌BMCM12（Lactobacillus plantarum BMCM12）的MRS培养基中经沉淀、SDS-PAGE解析、质谱仪分离鉴定的胞外蛋白能显著的抑制大肠杆菌LMG2092（E. coli LMG2092）和沙门氏菌亚种enterica LMG15860（Salmonella entericasubsp.enterica LMG15860）对粘液的黏附。2.2 空间排阻作用乳酸菌能与致病菌竞争肠上皮细胞上的糖基位点，起着空间排阻作用。大多数乳酸菌能分泌出胞外多糖，这些胞外多糖可通过静电引力的作用松散地结合在乳酸菌细胞壁上，形成一层保护屏障，也起到空间排阻作用。如：Mukai等35研究发现：罗伊氏乳杆菌（Lactobacillus reuteri）竞争性的结合在肠上皮细胞表面中相同的糖基位点，抑制了幽门螺杆菌（Helicobacterpylori）的结合，使得幽门螺杆菌失去可结合黏附位点而被排出。2.3 乳酸菌及其代谢产物抑制致病菌基因的表达和刺激宿主抗病基因表达乳酸菌及其发酵代谢产物可有效地抑制致病菌黏附基因及毒力基因的转录，刺激宿主抗病基因表达。如Medellin-pena等36研究表明，嗜酸乳杆菌La-5（Lactobacillus acidophilus La-5）发酵液中分出的上清液与大肠埃希菌O157H7共同培养16h后，大肠埃希菌紧密黏附素基因eaeA转录水平由696 intensitymm2下降至244 intensitymm2，降低了64%；黏附蛋白基因espA转录水平由1173 intensitymm2下降至409intensitymm2，降低了65%；介导大肠埃希菌O157H7黏附的鞭毛蛋白基因fliC转录水平由1564 intensitymm2下降至557 intensitymm2，降低了64%。Carey等37参考Kostrzynska等研究发现的鼠李糖乳杆菌能显著降低大肠杆菌O157H7EDL 933的stx2A基因的表达，采用相对阈值实时荧光PCR技术研究表明，产志贺毒素大肠埃希菌（Shiga-Toxin-producing Escherichiacoli，STEC）与乳酸菌、片球菌、双歧杆菌等益生菌共同培养14h后，其毒力基因stx2A的mRNA表达水平，与单独培养的产志贺毒素大肠埃希菌组比较都显著下降。乳酸菌、片球菌、双歧杆菌分别与产志贺毒素大肠埃希菌共同培养后，产志贺毒素大肠埃希菌菌体数量与该菌对照组的差异并不显著（p0.05），该文推断其毒力基因stx2A的mRNA表达水平的下调与益生菌有关，非产志贺毒素大肠埃希菌死亡所致，而是由于益生菌发酵所产生的乳酸等有机酸抑制了stx2A的mRNA转录水平。通过验证观察醋酸、乳酸和盐酸对大肠杆菌O157H7EDL 933的stx2A基因表达水平的影响，结果发现：三种酸对stx2A基因表达的抑制作用都随pH的下降而增强。其中，醋酸的抑制作用最明显，乳酸居次，盐酸最弱。Dhanani等32发现植物乳酸菌CS24.2（Lactobacillus plantarum CS24.2）能降低感染了大肠杆菌O26 H11 的 HT -29 细胞中肿瘤坏死因子TNF-和白细胞介素IL-8的表达。Archambaud 等38研究发现：在人为感染李斯特菌的清洁级小鼠模型中，副干酪乳杆菌CNCM I-3689（Lactobacillus paracasei CNCM I-3689）及干酪乳杆菌BL23（Lactobacillus casei BL23）对小鼠干扰素刺激基因（ISGs）表达的影响最大；在小鼠微小核糖核酸（miR）的表达中，两种乳酸菌都增加了miR-192的表达，而只有干酪乳杆菌BL23（Lactobacillus casei BL23）增加了miR-200b及miR-215的表达。2.4 防御物质的抑制作用乳酸菌在肠上皮细胞上黏附和定植，还能刺激肠上皮细胞产生细胞防御保护物质，抑制致病菌在肠上皮细胞上黏附和定植，如热休克蛋白和-Defensin。Tao等39的研究发现：鼠李糖乳杆菌GG（LactobacillusGG）发酵液的上清液中的可溶性因子，能诱导肠上皮细胞Hsp25及Hsp72基因的表达，分泌热休克蛋白。双歧杆菌在生长过程中分泌产生胞外糖苷酶，降解肠黏膜上皮细胞上杂多糖，使致病菌失去黏附位点，而有效的阻止致病菌及细菌毒素对肠上皮细胞的黏附作用40。如青春双歧杆菌分泌产生的B-呋喃果糖苷酶，可催化降解棉子糖、1-蔗果三糖棉子糖和菊糖等寡糖等糖类，起到消除致病菌利用其进行的黏附作用41。3 结论与展望乳酸菌是人体肠道中的正常菌，也是一类非常重要的益生菌群，它在人和动物肠道中起着重要的作用。它具有调节宿主肠道菌群平衡、增强免疫力、提高宿主消化吸收能力、可形成保护屏障，消除致病菌在肠上皮细胞上黏附和定植等益生功能。这些功能主要表现在：乳酸菌表面蛋白-s-层蛋白所含的疏水性氨基酸可使乳酸菌自凝，从而分布在肠上皮细胞上，阻止致病菌定植及繁殖。乳酸菌表面的引物酶Sortase依赖蛋白、黏膜结合蛋白、黏附胞外间质的表面蛋白等，可帮助乳酸菌抢占肠道上的结合位点，抑388专 题 综 述2013年第20期Vol . 34 , No . 20 , 2013（下转第399页）制致病菌的定植。LTA具有低等电点特性，在乳酸菌表面形成较多的负电荷，乳酸菌通过这种静电引力与肠上皮细胞受体进行黏附，可抑制致病菌的黏附作用。胞外多糖促使乳酸菌在肠道内黏附，为机体的先天免疫形成保护屏障。乳酸菌代谢产物乳酸等可抑制致病菌基因表达和刺激宿主抗病基因表达等。因此，用乳酸菌制备益生菌剂，提高人体免疫力，维护人体肠道正常菌群平衡，抑制致病菌对人体小肠上皮细胞的黏附作用，增加肠道内益生菌的数量和降低致病菌在宿主体内的定植，都具有重要意义。参考文献1 Wassenaar T M，Klein G. 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