基因克隆步骤完整版.docx

精品文档1总RNA提取(1) 液氮研磨或冰上匀浆实验材料；先将1ml Trizol加到离心管中待用(2) 将研磨好的样品加到离心管中混匀，室温放置5 min；打开离心机预冷(3) 加200 L氯仿，振荡15 sec，室温放置3 min，分层；(4) 4oC，12,000g，离心15 min；(5) 取上清，加500 L异丙醇，混匀，室温放置10 min；(6) 4oC，12,000g，离心10 min；(7) 弃上清，加1 mL75%乙醇，漂浮洗涤沉淀，振荡充分；再用100%乙醇清洗(8) 4oC，7,500g，离心5 min；(9) 弃上清，离心，用枪吸取多余液体，放在超净台里干燥后，加50 L DEPC水，80oC保存。此操作中所用到的器皿均需经过DEPC灭活RNA酶处理。提取的总RNA需经RNA电泳检测质量，并用紫外分光光度计测定浓度。OD260值为核酸的吸收值，OD280值为蛋白的吸收值，OD260/280值在1.8-2.0间一般说明该核酸蛋白含量在允许的范围内，可正常使用；此外还有OD230值为多糖和酚类的吸收值，比较干净的核酸OD260/230值能达到2.2左右。RNA浓度计算公式：总RNA 浓度（g/mL）=A260稀释倍数40。2反转录/cDNA第一链的合成纯化RNA以去除基因组DNA，操作按TaKaRa公司的PrimeScript RT reagent with gDNA Eraser(Perfect Real Time)说明书进行。其体系为：Total RNA1g5 gDNA Eraser Buffer2LgDNA Eraser1LRNase Free dH2O补齐至10L条件为：42oC，2min；RNA纯化后，即可进行反转录。其体系为：5PrimeScript Buffer 2（for Real Time） 4LPrimeScript RT enzyme mix 1LRT Primer Mix 1L上一步的反应液10LRNase Free dH2O补齐至20L操作条件为：(1) 37oC放置15 min； (2) 85oC，5 sec； (3) 4oC保存。3 PCR按TaKaRa公司的Premix Taq Version 2.0操作，PCR反应体系如下：Premix Taq25 L模板5L引物1 (10 M)1 L引物2 (10 M)1 LddH2O18LPCR反应条件为：94C预变性5min；94C变性30s，53C退火30s，72C延伸30s，循环36次；72C延伸10min。PCR反应完毕，取5L反应产物进行1%琼脂糖凝胶电泳（若割胶回收则用10L反应产物）。4 基因克隆及测序4.1 PCR产物切胶回收将PCR产物用1%琼脂糖凝胶进行电泳，在紫外灯下观察并切下预期大小的DNA片段。使用TIANGEN公司的Universal DNA Purification Kit割胶回收试剂盒进行纯化，步骤如下：(1)平衡吸附柱：向吸附柱CB2中（吸附柱放入收集管中）加入500L平衡液BL，13,400g离心1 min，倒掉收集管中的废液，吸附柱CB2重新套回收集管中；(2) 按100 mg agarose胶加入100L 溶液PC，置于50oC中10 min左右，中途混匀几次，至胶完全融化；(3) 将样品倒入一个吸附柱CB2中（吸附柱放入收集管中），室温下13,400g离心1 min，倒掉收集管中的废液，吸附柱CB2重新套回收集管中；(4)向吸附柱CB2中加入600L 漂洗液PW（加乙醇），室温下13,400g离心1 min，倒掉收集管中的废液，吸附柱CB2重新套回收集管中；(5) 重复上一步骤；(6) 将吸附柱CB2放入收集管中，室温下13,400g离心2 min，尽量除去漂洗液，将吸附柱置于室温放置数分钟，彻底晾干；(7) 将柱子套入一新的灭菌1.5 mL离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加50L 洗脱缓冲液，室温放置2分钟，13,400g室温离心2 min，收集到的洗脱液即为回收的DNA纯化液；(8) 取5L的纯化液体进行1%琼脂糖凝胶电泳，以检查纯度，并测量溶液中DNA含量。4.2目的片段与载体连接(1) 胶回收产物与T载体连接体系，参考Takara公司pMD18-T载体的试剂盒说明书。在灭菌的0.5 mL 离心管中配制如下溶液（10 L）：回收DNA4LLigation Solution5LpMD18-T Vector1L(2) 16oC反应30分钟，所得产物保存于4oC冰箱备用。4.3连接产物转化E.coli DH5(1) 将5 L连接产物加入到100LE.coli DH5感受态细胞中，轻轻旋转离心管混匀内容物，冰上静置30 min； (2) 42oC水浴热激转化90 sec，立即放回冰上，放置3 min；(3) 每管加入500 L LB培养基（室温放置），37oC 160-180 rpm振荡培养45-60 min，使菌体复苏并表达抗性基因；(4) 在含有Amp（100 g/mL）的选择性平板上加入60-100 L 菌液，用无菌涂布棒轻轻涂布均匀后，用Parafilm膜封好；(5) 将培养皿正放，37oC约50 min，待液体全部吸收后，倒置平板继续培养10-16 h。4.4转化子的筛选及鉴定(1) 用无菌枪头挑取LB平板上3-5个单菌落，分别接种到3.5 mL LB液体培养基中（含100 g/mL Amp），37oC，165rpm振荡培养10-12 h；(2) 用5 L菌液做模板，进行PCR鉴定（50 L 体系），操作步骤同3。