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岛津液相色谱仪基础知识 岛津企业管理 中国 有限公司分析仪器事业部分析中心 岛津HPLC的历史 Startedin1969 1969 1972 1978 1981 1982 1984 1991 1997 2000 2004 2010 2010 GPC系统开发 LC 1 LC 830 销售 LC 3A系列销售 LC 4A系列销售 LC 5A系列销售 LC 6A系列销售 LC 10A系列销售 LC VP系列销售 LC 2010销售 LC 20AProminence销售 LC 15C销售 LC 30ANexera销售 与DuPont签订许可合同后制造销售 CDQR方式的单柱塞型送液单元为特征 内置微型计算机的全自动HPLC 世界上首创的微量型LC对应HPLC 世界上最早的积木型HPLC 现在的HPLC的前身 世界上最早采用微冲程送液单元和减低噪音技术的检测器 采用有效性支持功能的积木型HPLC 追求性能和操作性更加完善的一体型HPLC 为分析实验室带来革新的HPLC 为了让LC分析更为便捷 130MPa耐压系统 低系统容量 高温分析和样品自动前处理 在售产品 岛津HPLC的历史 2000 1997 THECNLOGYBREAKTHROUGH FlexibleHPLCSystemwithMicro strokeVolumeSolventDeliveryUnit THECNLOGYBREAKTHROUGH LC 2010 LC VP 2008 2004 THECNLOGYBREAKTHROUGH THECNLOGYBREAKTHROUGH 2010 THECNLOGYBREAKTHROUGH 2010 THECNLOGYBREAKTHROUGH LC 20AProminence UFLCProminence LC 15CEssentia UHPLCLC 30ANexera LC 20AProminence 基础知识讲解内容 1 色谱基础知识 2 硬件基础知识 3 定量基础知识 4 维护基础知识 第一部分 色谱基础知识 色谱起源 石油醚 色谱 色素混合物 碳酸钙颗粒 分离组分 色谱发展史 20世纪初 俄国植物学家M S Tswett提出经典液相色谱法 20 30年代 柱分配色谱和纸色谱 50年代 气相色谱 薄层色谱 60年代 凝胶渗透色谱及高效液相色谱 70年代 高效毛细管气相色谱法 80年代 电色谱 90年代 光色谱 色谱定义 色谱法 利用组分在两相间分配系数不同而进行分离的技术流动相 携带样品流过整个系统的流体固定相 静止不动的一相 色谱柱 色谱是一种分离技术色谱的主要目的是对混合物中的目标物分离和定量 EthylParaben PropylParaben MethylParaben ButylParaben 2 5 3 0 mV 500 400 300 200 100 0 0 0 0 5 1 0 1 5 2 0 min 色谱分类 高效液相色谱 HighPerformanceLiquidChromatography HPLC 气相色谱 GasChromatography GC 薄层色谱 Thin LayerChromatography TLC 毛细管电泳 CapillaryElectrophoresis CE HPLCvsGC 液相色谱 以液体作为流动相的色谱分离方法 适用于高沸点 大分子 强极性和热稳定性差的化合物的分析流动相具有运载样品分子和选择性分离的双重作用 气相色谱 以气体作为流动相的色谱分离方法 适用于沸点较低 热稳定性好的中小分子化合物的分析流动相只起运载样品分子的能力 HPLC简易流程图 输液泵 进样器 柱温箱 检测器 色谱柱 储液瓶 数据处理系统 HPLC特点 分离性能好 9 10 12g 灵敏度高 10 选择性高 同分异构 旋光异构 分析速度快 进样量小 1 100 L HPLC分类 反相色谱 reversedphasechromatography 离子对色谱 ion pairchromatography 正相色谱 normalphasechromatography 离子交换色谱 ionexchangechromatography 尺寸排阻色谱 GPC GFC 反相色谱 流动相的极性大于固定相的极性 C18 ODS C8 octyl C4 butyl 苯基TMS 氰基 非极性 O Si CH3 2 C18H37 SiO2 相互作用力是什么 疏水性 OH C18 ODS SiO2 强OH 弱 疏水性 如果样品有 CH3CH2CH2 碳链 作用力强 芳香基 如果样品有 COOH羧基 NH2氨基 OH羟基 作用力弱 反相色谱流动相的选择 优化水相 缓冲液 和有机相的比例非常重要 甲醇 乙腈和THF是常用的有机溶剂 在有缓冲液的情况下 缓冲液的浓度和pH值非常重要 流动相极性变化对分离的影响 20 水 30 水 40 水 1 2 3 4 对羟基苯甲酸甲酯对羟基苯甲酸乙酯对羟基苯甲酸丙酯对羟基苯甲酸丁酯 有机相 甲醇 固定相极性变化对分离的影响 C8 SiO2 C18 ODS 一般 样品 SiO2 强 样品 C4 SiO2 弱样品 固定相极性变化对分离的影响 ODS C8 TMS 分析条件柱 Shim packCLC ODS流动相 MeOH H2O 7 3流速 1 0mL min温度 40 进样体积 10 L检测器 UV 254nm 色谱峰1 苯甲酸甲酯2 苯甲酸乙酯3 n 苯甲酸丙酯4 n 苯甲酸丁酯 反相离子对色谱 原理 固定相 流动相 样品离子与流动相中离子对试剂的反离子生成疏水 性离子对 而为反相色谱固定相保留 疏水性的苯乙烯 二乙烯基苯树脂或键合的硅胶 水 缓冲液 离子对试剂 有机溶剂 所带电荷与待测离子相反 离子对试剂 常用离子对试剂 阴离子化合物 氢氧化四丁基铵 溴化四丁基铵 阳离子化合物 丁烷基磺酸钠 戊烷基磺酸钠 己烷基磺酸钠 庚烷基磺酸钠 辛烷基磺酸钠 癸烷基磺酸钠 十二烷基磺酸钠 C4 C5 C6 C7 C8 C10 SDS 反相离子对色谱流动相的选择 离子对试剂的类型 所带电荷与待测物质相反 离子对试剂的浓度 10 4 10 2mol L 在一定范围内 浓度越大 被分离物的保留值越大 流动相的pH 反相离子对色谱应用 有机酸 碱 盐的分离 包括 阴阳离子表面活性剂大分子脂肪酸烷基磺酸盐和芳香硫酸盐含氮化合物生物碱水溶性维生素酚类 正相色谱 流动相的极性小于固定相的极性 硅胶柱 氰基柱 氨基柱 二醇基柱 常用常用分析糖分析蛋白质 Si CH2CH2CH2CN SiO2 SiO2 硅胶 Si CH2CH2CH2NH2 Si CH2CH2CH2OCH OH CH2 OH 化学键合相 相互作用力是什么 强 SiOH SiOH 弱 非常弱 OH HO 氢键力 氢键力 如果样品有 COOH羧基 NH2氨基 OH羟基 氢键力强 如果样品没有任何官能团 如碳水化合物如果样品有大的基团 由于空间位阻 氢键力弱 正相模式下流动相的选择 主要试剂烷烃 戊烷 己烷 庚烷 辛烷 芳香烃 苯 甲苯 二甲苯 二氯甲烷氯仿四氯化碳 辅助试剂甲基 t 丁基醚 MTBE 乙醚 四氢呋喃 THF 二氧杂环乙烷 嘧啶 乙酸乙酯 乙腈 丙酮 异丙醇 乙醇 甲醇 为了调整保留时间 可以选择主要试剂然后再加入辅助试剂 流动相极性变化对分离的影响 0 甲醇 2 甲醇 5 甲醇 1 2 3 4 邻苯二甲酸二辛酯邻苯二甲酸二丁酯邻苯二甲酸二乙酯邻苯二甲酸二甲酯 主要试剂 己烷 反相色谱与正相色谱的对比 反相色谱 流动相极性大于固定相极性适用于能溶于水 有机混合物的中性或非离子化合物分离 正相色谱 流动相极性小于固定相极性适用于不溶于水 有机混合液的亲脂样品 异构体混合物的分离和制备HPLC 反相色谱与正相色谱的对比 反相 保留时间重现性好 固定相耐用 正相 对立体异构体有很好的分离 VitaminE等 保留时间重现性稍差 离子交换色谱 原理 利用被分离组分与固定相之间发生离子交换的能力差异来实现分离 固定相 离子交换树脂 流动相 水缓冲溶液 常用 或有机溶剂与水缓冲溶液的混合液 离子交换色谱所用的缓冲液 阴离子分离 氢氧化物 硼酸盐 碳酸盐 酚盐和两性离子等 阳离子分离 矿物酸 如硝酸 盐酸 硫酸和甲基磺酸等 离子交换色谱作用力 离子吸引力 样品 样品 R RN R SO 3 离子交换色谱应用 生物领域 蛋白质 农药 氨基酸分析 离子分 阳离子交换剂 强阳离子交换剂 SCX R SO3 弱阳离子交换剂 WCX R COO 阴离子交换剂 强阴离子交换剂 SAX R4N弱阴离子交换剂 WAX DEAE 尺寸排阻色谱法 SEC 原理 利用多孔凝胶固定相的独特特性 而产生的一种主要依据分子尺寸大小的差异来分离的液相色谱方法 固定相 一种表面惰性 具有一定孔径的多孔凝胶 应用 聚合物及生命科学领域 SEC分类 凝胶渗透色谱 GPC 主要用于聚合物领域以有机溶剂为流动相 氯仿 THF DMF 常用固定相填料 苯乙烯 二乙烯基苯共聚物 凝胶过滤色谱 GFC 主要用于生命科学领域以水溶液为流动相常用固定相填料 亲水性有机凝胶 葡聚糖 琼脂糖 聚丙烯酰胺等 GPC分离原理 固定相是多孔填料 小分子样品可以进入孔径内部 样品与固定相之间无作用力 保留时间不同 样品 大 填充物颗粒 中 小 孔穴 GPC分离原理 排阻极限 Log MW 渗透极限 V 第二部分 硬件基础知识 HPLC简易流程图 脱气机 色谱柱 进样器 输液泵 储液瓶 柱温箱 数据处理系统 检测器 储液瓶 由机械性能和化学稳定性好的不锈钢 玻璃或聚 四氟乙烯材料制成 使用过程中储液瓶应适当密闭 所有溶剂应先过滤 再装入储液瓶 溶剂前处理 过滤 过滤 0 45 m或更小孔径滤膜 目的 除去溶剂中的微小颗粒 避免堵塞色谱柱 尤其是使用无机盐配制的缓冲液 滤膜类型 聚四氟乙烯滤膜 适用于所有溶剂 酸和盐 醋酸纤维滤膜 不适用于有机溶剂 特别适用于水基溶剂 尼龙66滤膜 适用于绝大多数有机溶剂和水溶液 可以用于强酸 不适用于DMF THF CHCl3等溶剂 再生纤维素滤膜 蛋白吸收低 同样适用于水溶性样品和有机溶剂 溶剂前处理 脱气 脱气 除去流动相中溶解或因混合而产生的气泡 气泡对测定的影响 1 泵中气泡使液流波动 改变保留时间和峰面积2 柱中气泡使流动相绕流 峰变形3 检测器中的气泡产生基线波动 常用脱气方法 超声脱气 减压脱气 在线脱气 脱气机 在线真空脱气 组成 脱气机主要由脱气管 真空室和真空泵组成 脱气管 真空室 到泵 真空室内的脱气管由特殊的透析材料制成 当溶剂流经脱气管时 溶解在溶剂中的气体穿过管壁被脱出 储液瓶 输液泵 性能要求 能在高压下连续工作 输出流量范围宽 输出流量稳定 精确度 重复性高 47 岛津输液泵系列 目的 单元 LC 20ATLC 15C 流速范围 0 001 10ml min 特性和应用 非凡的耐用性 适于常量分析 极低脉动 适于半微量LC和LC MS分析 极低脉动 适于半微量LC和LC MS分析 分析 LC 20ADLC 30A LC 20AB 0 0001 10ml min0 0001 5ml min 0 0001 10ml min LC 20AT 选配件支架 压力传感器 泵头固定座泵头 辅助进口单向阀 主进口单向阀 LC 20AT 主泵头 副泵头 串联式柱塞往复泵 单向阀 LC 20AD 选配件支架 出口单向阀 压力传感器 泵头 泵头固定座 进液口 泵头 LC 20AD 进口单向阀 泵头 单向阀 并联式微体积柱塞往复泵 LC 20AB 压力传感器 连接块 出口单向阀 泵头 泵头固定座 进口单向阀 泵B LC 20AB 进液口 泵A 柱塞往复泵结构示意图 单向阀工作原理 单向阀结构 单向阀工作原理 吸液冲程 宝石球 抛光面 泵头 球座 进口单向阀 出口单向阀 排液冲程 洗脱系统组成 等度洗脱系统 梯度洗脱系统 高压梯度洗脱系统 低压梯度洗脱系统 等度 B B 梯度 时间 时间 使用梯度洗脱的原因 当采用等度洗脱时 MeOH H2O 6 4 分析时间长 分离度差 MeOH H2O 8 2 column ODS 使用梯度洗脱的原因 当采用梯度洗脱时 95 甲醇浓度 30 在最短时间内获得最佳的分离 梯度洗脱要点 梯度洗脱 优点 可提高分离度 缩短分离时间 降低最小检测量和提高分离精度 注意事项 溶剂的纯度要高 否则梯度洗脱的重现性差梯度混合的溶剂互溶性要好梯度洗脱应使用对流动相组成变化不敏感的选择性检测器 如紫外吸收检测器或荧光检测器 而不能使用对流动相组成变化敏感的通用型检测器 如示差折光检测器 查看空白实验的数据遵守分析周期 最初的分析数据不采用 等度洗脱 输液泵 进样器 柱温箱 检测器 色谱柱 单一或混合溶剂 高压梯度系统 A 泵 B 混合器 泵 进样器 分析柱 柱温箱 检测器 数据处理系统 C 泵 梯度准确率高需要2 3个泵 可以不配在线脱气机 低压梯度系统 混合器 分析柱 进样器 输液泵 低压梯度比例阀 检测器 柱温箱 数据处理系统 脱气机 一台泵最多可使用4种流动相 泵前预混合 需带在线脱气机 A B C D 流动相的选择 采用 HPLC 级溶剂 避免使用会引起柱效损失或保留特性变化的溶剂 对试样有适宜的溶解度 溶剂粘度要小 与检测器相匹配 水的等级 水的等级 纯化水蒸馏水去离子水 吸光率 去离子水 纯化水 波长 nm 因为不纯物的存在 去离子的吸光率较高 纯化水中去除了无机和有机的污染物 水的等级 HPLC用水可以通过以下几个方法得到 专门的纯水机或超纯水机 理想的HPLC用水应为18 2M 的超纯水 并通过0 22 m的滤膜 除去热源 有机物 无机离子及空气等 去离子水重蒸二次或三次重蒸水 不管采用何种途径 配制流动相应用新鲜水 水的等级 未注入样品时空白梯度的色谱图 水中不纯物的出峰 水中的不纯物保留在柱中 随之被乙腈洗脱 有机溶剂的等级 有机溶剂的等级 HPLC级优级纯分析纯 微量分析 梯度洗脱 都经过蒸馏和0 45 m的过滤 除纤维毛 未溶解的机械颗粒 优级纯的纯度比分析纯大 但里面含有防腐剂和抗氧化剂 HPLC级经过0 2 m的过滤 且除去有紫外吸收的杂质 有机溶剂的等级 分析纯级和HPLC级溶剂的吸光度比较图 甲醇 乙腈 正己烷 选择缓冲液的步骤 1 确定最佳分离状态时的流动相pH 2 选择具有与流动相的pH相近的pKa的缓冲液 即使浓度稀也具有较强的缓冲能力 3 确认检测波长下缓冲液是否有大的吸收 在波长210nm附近进行检测时 不能用醋酸和柠檬酸的缓冲液 常用代表性的弱酸的pKa值 pK1 醋酸 柠檬酸 磷酸 4 87 3 13 2 16 pK2 pK3 4 76 7 21 6 40 12 32 缓冲液的使用 使用前必须过滤 使用后一定要进行清洗 以免造成腐蚀 磨损 阻塞 用纯水冲洗30 60min 1ml min 再用甲 醇冲洗30min 易受到细菌和霉菌的影响 不能直接用有机溶剂冲洗缓冲盐溶液 进样器 手动进样器自动进样器 要求 无残留扩散小进样体积可变可承受高压 手动进样器的原理图 装填状态 泵 进样状态 泵 6 1 2 6 1 2 5 4 3 5 4 柱子 3 柱子 1 6 5 1 6 5 4 4 进样量和检测器响应的关系示意图 检测器响应值 全量注入 部分注入 定量环体积的一半 3倍定量环体积 进样体积 部分注入和全量注入 部分注入 一般要求进样量最多为定量环体积的一半 如 20 L的定量环最多进样10 L的样品 并且要求每次进样体积 准确 相同 全量注入 进样量最少为定量环体积的3至5倍 即20 L的定 量环最少进样60至100 L的样品 这样才能完全置换样品定量 环内残留的溶液 达到所要求的精密度及重现性 交叉污染产生的原因 红色表示残留样品 手动进样方法 一般的方法 1 在进样状态下清洗针口 2 在装填状态下插入微量注射器 3 注入样品 4 切到进样状态 手动进样方法 便捷的方法 不需清洗 1 进样状态下插入微量注射器 2 切到装填状态 3 注入样品 4 切回到进样状态 自动进样器 由计算机自动控制定量阀 按预先编制注射样品的操作程序工作 自动进样器 清洗 Rinse 进样针移动到清洗口 针的外壁被清洗液清洗的过程 排气 Purge 排除管路中的气泡和更换旧流动相的过程 色谱柱 常用色谱柱 反相 C18 ODS C8 C4 苯基 TMS 氰基 正相 硅胶 氰基 氨基 二醇基 离子交换色谱 阳离子交换剂 强阳离子交换剂 SCX 弱阳离子交换剂 WCX 阴离子交换剂 强阴离子交换剂 SAX 弱阴离子交换剂 WAX R SO3 R COO NR4 DEAE 体积排阻色谱 苯乙烯 二乙烯基苯共聚物 葡聚糖 琼脂糖 聚丙烯酰胺 分离模式的选择 反相色谱 第一选择 反相离子对色谱 正相色谱 第二选择 特殊 高分子量化合物 聚合物 蛋白或糖类无机离子光学异构体 色谱柱的选择 105 分子量 104 非水相 体积排阻 离子交换 离子对反相 反相 103 水相正相 非极性 中等极性 高极性 色谱柱的连接 死体积可能会引起分离度变差和重现性变差等问题 色谱柱 公螺母 死体积 管线 好的连接 差的连接 色谱柱的使用 新色谱柱使用前 最好用强溶剂在低流量下 0 2 0 3ml min 冲洗30min 长时间未用的分析柱也要同样处理新色谱柱先测柱效 并保留色谱图和实验条件定期检测柱效 色谱柱的使用 1 流动相 高纯度 过滤pH范围有机溶剂与色谱柱匹配互溶 并能溶解样品 2 净化样品 3 使用保护柱 与色谱柱填料 内径一致避免色谱柱污染 色谱柱的使用 4 分离条件 流速 柱温 梯度的变化幅度 5 定期使用强溶剂冲洗柱子 6 使用缓冲盐后 要先用含10 甲醇的水溶液冲洗 再用有机溶剂冲洗 7 流动相正相反相转换时用异丙醇过渡 色谱柱的存放 存放前充分冲洗 合适的存放溶剂 接好堵头 避免固定相干涸 存放环境 柱温箱 分析结果重现性好 提高柱效 降低柱压 保证检测稳定性 柱温箱 CTO 20A AC空气强制循环式 CTO 15C 模块加热式 CTO 30A CTO 10AS 液相色谱检测器的选择 样品的性质 分离目的不同 对检测的要求不同 定量 高选择性 高灵敏度 定性或制备 通用性 常用检测器 紫外可见光检测器 UV 二极管阵列检测器 PDA 荧光检测器 RF 示差折光检测器 RID 电导检测器 CDD 蒸发光散射检测器 ELSD 质谱检测器 LCMS 紫外可见光检测器 样品池 C 浓度 Ein l Eout 朗伯 比耳定律 A Cl log Eout Ein A 吸光度 紫外可见光检测器 样品池 光栅 Ein Eout 光电二极管 Ein Ein 参比池 光电二极管 D2 W光源 紫外可见光检测器 紫外检测器 原理 基于被分析组分对特定波长紫外光的选择性吸收 定量基础 朗伯 比耳定律 A CL 优点 1 灵敏度高 2 对温度和流速不敏感 3 可用于梯度洗脱 缺点 仅适用于测定有紫外吸收的物质 双波长检测 日本饮用水标准 2004年4月起实施 1 磺草灵 asulam 2 甲基硫菌灵 thiophanate methyl 3 环草隆1 siduron 4 环草隆2 siduron 5 依普同 iprodione 分析条件 色谱柱 Shim packVP ODS 150mmL 4 6mmI D 流动相 Acetonitrile 50mMKH2PO4 pH3 0 55 45 v v 流速 1 0mL min 柱温 40 C 检测 230nm 270nm 进样 10 L 饮用水中4种农药残留双波长分析 波长切换 波长扫描 紫外检测器 启动仪器或开灯后 需要一定的时间使基线稳定 检查流通池与管路有无漏液 检测时 请关闭前面板 清洗流通池 防止堵塞 标准流通池 12 L 耐压12MPa 半微量流通池 2 5 L 氘灯 2000小时 不要频繁的开关 3小时 二极管阵列检测器 二极管阵列检测器 样品池 光栅 D2 W灯 每一组分可在每一波长处得到一吸光度值 二极管阵列 二极管阵列检测器 光谱 色谱 吸光度 波长 时间 二极管阵列检测器 二极管阵列检测器 采集三维谱图 可以发现单波长检测时未 检测到的峰 光谱定性 谱库搜索 峰纯度检验 二极管阵列检测器 启动仪器或开灯后 需要一定的时间使基线稳定 检查流通池与管路有无漏液 检测时 请关闭前面板 清洗流通池 防止堵塞 标准流通池 10 L 耐压12MPa 半微量流通池 2 5 L 氘灯 2000小时 不要频繁的开关 3小时 荧光检测器 激发波长 h 1 A h 1 A h 2 h 2 发射波长 荧光 荧光检测器 氙灯 光电倍增管 光栅 样品池 荧光检测器 荧光检测器 原理 基于被分析组分发射的荧光强度进行检测 优点 1 灵敏度高 是最灵敏的检测器之一 2 选择性好 3 对温度和流速不敏感 可用于梯度洗脱 缺点 仅适用于测定可产生荧光的物质或能经过衍生化 反应产生荧光的物质 可检测物质 多环芳烃 霉菌毒素 卟啉 儿茶酚氨等 具 有对称共轭体系 或氨基酸 脂肪酸等需衍生后检测样品 荧光检测器 启动仪器或开灯后 需要一定的时间使基线稳定 检查流通池与管路有无漏液 检测时 请关闭前面板 清洗流通池 防止堵塞 oC时 温度上升 荧光强度下降 常温附近温度变化超过1 有些化合物强度变化达到5 标准流通池 12 L 耐压2MPa 氙灯 2000小时 RF 20AxL 不要频繁的开关 荧光检测器应用 氨基酸检测 OPA衍生 CHO A A N R R NH2 CHO o phthalaldhyde OPA 脂肪酸检测 ADAM衍生 R COOH CHN2 9 anthryldiazomethane ADAM CH2OCOR 氨基酸检测 OPA柱后衍生 Taurine mV700检测器A Ex 350nm Em 450nm 600 500 400 300 Asp 200 100 0 0 0 5 0 10 0 15 0 20 0 25 0 30 0 35 0 40 0 45 0 50 0 55 0 60 0min ThrSer Gly MetisoLeuLeuTyrPhe His LysAmmonia GluPro 各组分浓度 0 02 mol mL 进样10 L Cys Val Arg Ala 示差折光检测器 光学系统 钨灯 准直镜 狭缝 物镜 狭缝 反射镜 调零透镜 硅光电池 样品池 示差折光检测器 示差折光检测器 示差折光检测器 原理 连续测定流通池中溶液折射率来测定试样中 各组分浓度 优点 通用型检测器 缺点 1 对温度变化敏感 2 对溶剂组成变化敏感 不能用于梯度检测 3 属于中等灵敏度的检测器 示差折光检测器 检测时 请关闭前面板 清洗流通池 防止堵塞 流通池 9 L 耐压2MPa 进口 63 5 L 出口 280 2 L 钨灯 20000小时 糖分析例 分析条件色谱柱 Shim packCLC NH2流动相 乙腈 水 7 3流速 1 0mL min温度 室温 峰 1 甘油2 木糖3 果糖4 葡萄糖5 蔗糖6 甘露糖7 乳糖 电导检测器 V I K 电导 I A E V 2 L cm xk A cm k 电导率 k I E x L A A A 电极 L 电极 电导检测器 原理 根据物质在某些介质中电离后所产生的电导率的变化来测定电离物质含量 广泛应用于离子色谱法 优点 对流动相流速和压力的改变不敏感 缺点 对温度变化敏感 温度每升高1 电导率增加2 2 5 用途 主要用于离子色谱 检测无机和有机离子 电导检测器 清洗流通池 防止堵塞 流通池 0 25 L 耐压2 9MPa 海水中阴离子分析例 分析条件色谱柱 Shim packIC A3流动相 8 0mMp hydroxybenzoicacid3 2mMBis Tris流速 1 5mL min温度 40 进样体积 100 L 色谱峰1 F 2 Cl 3 NO2 4 Br 5 NO3 6 SO42 1 4ppm 10200ppm 10ppm 43ppm 44ppm 431ppm 阳离子分析例 2 2 分析条件色谱柱 Shim packIC C1流动相 5nM硝酸溶液流速 1 5mL min温度 40oC进样 50 L 蒸发光散射检测器 流动相 雾化 载气 雾化器 蒸发 光电倍增管 检测池 检测 光源 光电倍增管 漂移管 LED 蒸发光散射检测器 原理 流出物在检测器中被高速氮气喷成雾状液滴 溶剂挥发后 溶质形成微小颗粒 被载气带到检测系统 进入散射室中 检验散射光的强度 优点 消除了溶剂干扰以及温度变化带来的基线漂移 可梯度洗脱 灵敏度高 是HPLC的通用型检测器 缺点 不能使用非挥发性缓冲盐做流动相 如磷酸盐 蒸发光散射检测器 废气不能直接排放在室内如果流动相中含有机溶剂 使用惰性气体做雾化气避免使用在工作温度下能引起爆炸的溶剂和雾化气流动相中不使用非挥发性盐雾化气压力不要超过450kPa先开气 后开泵保证雾化器虹吸出口充满液体不要打开前门LED灯 5000小时 PEG 1000分析例 质谱检测器 强大的定性和选择性能力 多组份样品的准确定性未充分分离组份峰的鉴别消除杂质干扰 可作为便捷的定性分析 用于合成和衍生反应的研究作NMR预分析的质谱鉴定 人造色素质谱图 x1 000 000 8 0 7 0 6 0 1 23 4 5 6 8 9 7 10 11 12 5 0 4 0 3 0 2 0 1 0 0 00 0 TIC m z467m z537m z421m z407m z451m z763m z747m z557m z784 5m z834 5m z972 5 0 5 1 0 1 5 2 0 2 5 3 0 3 5 4 0 4 5 5 0 min 色谱柱 流动相 时间程序 流速 进样体积 柱温 Shim packXR ODS 50mmLx2 0mmI D Particlesize 2 2 m A 20mmol LNH4Ac pH4 7 B 20mmol LNH4Ac pH4 7 ACN 1 110 B 0min 100 B 5 0min 0 5mL min5 L40 C 扫描范围m z200 1200 1 tartrazine2 amaranth3 indigocarmine 4 newcoccine5 sunsetyellowFCF6 alluraredAC 7 fastgreenFCF8 brilliantblueFCF9 acidred10 phloxineB11 erythrosine12 rosebengal 第三部分 定量基础知识 定性方法 色谱峰的定性鉴别 通过保留值 通常是保留时间 进行定性 需要指定保留时间误差范围 时间窗 时间带 在相同的分析条件下 保留时间相同并不肯定是同样的组份 保留时间不同肯定不是同样的组份 定性确证 仅仅通过保留时间并不能完全确证该物质 通过加入标准物确认 通过改变色谱条件确认 光谱和质谱信息也可以作为进一步确证手段 其他仪器方法确证 定量分析的基本要求 需要有纯物质作标准 被定量组分峰要与其它峰达到基线分离 符合定性参数要求 选择合适的定量方法 定量分析基本公式 在某些条件限定下 被测组分的浓度与检测器的响应值成正比的关系 蒸发光散射检测器浓度与峰面积不成线性 分别取对数后成线性 Ci fiAiCi fiHi Ci fi Ai Hi 组分浓度响应因子 与组分的物理化学性质和检测器的性质有关组分响应面积组分响应高度 实际修饰公式 Y aX b 常用定量方法 面积归一化 外标法 内标法 标准加入法 面积归一化法 不能作为准确定量的方法 仅在特定情况下使用 公式 特点 AiCi 100 Ai 1 无需做校正 简便 快速 2 进样量不严格要求 3 要求所有组分都流出并且被检测到 4 要求所有组分的响应因子相当 外标法 浓度 C1 A2 C2 面积 A1 A4 A3 A2 A1 A4 C4 C1 C2 C3浓度 C4 峰面积 标准曲线 A3 C3 外标法 Ci fiAi fi i组分工作曲线的斜率 实验室最常用的定量方法 定量结果准确 特点 1 不需所有峰都流出或被检测到 只对目标组分作校正 2 需要标准样品 3 进样量必须准确 4 仪器必须有良好的稳定性 单点校正法 当被测试样中各组分浓度变化范围不大时 可不必绘制多点的标准曲线 而用单点校正法 比较法 配制一个和被测组分含量接近的标准溶液 定量进样 根据被测组分和外标组分峰面积比或峰高比计算被测组分的含量 wiAi wsAs 当方法存在较大的系统误差 单点校正法的误差较大 内标法 浓度 目标内标 C1 CIS A2AIS C2 CIS A3AIS C3 CIS A4AIS C4 CIS C1 CISC2 CISC3 CISC4 CIS 浓度比 目标 内标 面积 A1AIS A4 AIS A3 AIS A2 AIS A1 AIS 面积比 目标 内标 标准曲线 内标法 试样配制 准确称取一定量的试样Wi 加入一定量内标物WS 计算公式 wi fiAi ws fsAs fiAiAiwi ws fi wsfsAsAs fi 为待测组分 i 对内标物 s 的质量相对校正因子 内标法特点 多用在国际标准和规定比较严格的方法中 特点 1 进样量不严格要求 2 只对所测组分作校正 3 必须在样品中加一内标组分 4 操作较为繁琐 5 选择内标物比较困难 选择内标物应注意 1 理化性质与待测物相近 2 在样品中不存在且不与样品中组分发生化学反应 3 内标物与待测物响应相近 4 与待测物有良好的分离 但又不能相距太远 5 与待测物的峰面积比为0 7 1 3最好 因此要根据待测物的浓度确定内标物的添加量 标准加入法 当难以选择合适的内标物或无空白样品时 以欲测组分的纯物质为内标物加入到待测样品中 然后在相同的色谱条件下 测定加入欲测组分前后的峰面积 从而计算待测组分的含量 wi fiAi wi wi fi Ai wi wiAi wiAi fi fi wiwi Ai 1Ai 标准加入法特点 1 不需另外选择内标物 2 进样量不必十分准确 操作简单 3 两次色谱条件完全相同以保证校正因 子完全相等 定量计算常用术语 Integrationparameters 积分参数 规定计算出峰面积的方法 Identification 定性参数 保留时间及允许误差 Quantificationmethod 定量方法 选择定量方法 外标法 内标法等 CurvefitType Compoundtable 曲线拟合类型 包括线性 二次方程等 化合物表 定义要进行定量计算的组分 其中 包括定性和定量参数 1 Type 组分类型 指组分的分析类别Target 要计算的目标组分ISTD 指该组分为添加的内标组分Reference 指该组分为参比组分 用来对目标组分进行确认ISTD Ref 指该组分既是内标组分 又是参比组分2 Conc 浓度 指目标组分的计算结果 定量计算常用术语 SampleType 样品类型 规定该数据的计算类别 Standard 标样 浓度已知的标准品 用来制作标准曲线 Unknown 未知样 浓度待测的目标组分 SampleAmt 样品量 待测样品的原始称样量 在计算结果中会除以该数值 Dil Factor 稀释因子 待测样品的稀释倍数 在计算结果中会乘以该数值 ISTDAmt 内标量 内标组分的添加量 Level 样品浓度水平 规定数据的浓度级别 Unknown为0 Standard为整数 浓度由低到高依次为1 2 3 4 5 PeakTable 峰表 所有积分结果的列表 数据处理参数 积分参数 Width Slope Drift T DBL等 定性参数 保留时间及允许误差 时间窗 时间带 定量参数 1 定量方法 外标法 内标法 面积归一法等 2 曲线点数 一点或多点 3 曲线拟合 线性 折线 曲线 积分参数 积分参数 基本积分参数 Channel 通道 指定检测器检测信号的通道 Width 半峰宽 峰的半高宽 排除峰宽小于最小峰宽的峰 Slope 斜率 用来判断出峰起点 终点以及滤除低平噪声 Drift 漂移 判断相邻峰的积分方式 设定值为0时 积分仪将自动判断 如Drift与基线至峰谷连线较接近时 积分面积值可能变化较 大 T DBL 时间变参 根据时间自动改变峰宽和斜率 Minimumarea 最小峰面积 排除面积小于该值的峰 Slope的设定 Slope Slope Slope 峰斜率 作为峰计算 Slope Slope 峰斜率 作为噪声滤除 Slope Slope 峰斜率 积分不稳定 须手动设定 Drift值的设定 手动校正 Drift Drift Drift Drift Drift Drift 注 1 设定值为0时 积分仪将自动判断2 如Drift与基线至峰谷连线较接近时 积分面积值可能变化较大 Drift值的设定 自动校正 谷宽 半峰高宽度T2 T1 谷宽 半峰高宽度T2 T1 DBL的设定 T DBL 时间变参 根据时间自动改变峰宽和斜率 等度洗脱时 出峰时间越长 峰越宽设定值为0时 根据宽度自动判断默认值为1000 此时该参数不起作用 在实际使用中 一般使用默认设定 积分锁定 IntegrationOfftoOn 锁定某一时间范围的峰 使之不计算积分 mAU x10 2 5202nm4nm 1 00 2 0 1 5 1 0 0 5 0 0 0 0 0 5 1 0 1 5 2 0 2 5 3 0 3 5 4 0 4 5 min IntegrationOfftoOn 定性参数 定性参数 绝对保留时间 相对保留时间 保留时间允许误差 时间窗 相对允差 一般设为5 时间带 绝对允差 一般设为0 05 0 25min 定量参数 定量参数 定量方法 面积归一法 外标法 内标法等 工作曲线的制作 曲线点数 一点 两点及多点曲线计算 线性 折线 二次曲线 三次曲线 影响定量结果的因素 保留时间的重现性 对GPC影响很大 样品问题 杂质 溶剂 稳定性 配制 进样问题 准确度和精密度 检测器的性能 影响线性 检出限 灵敏度 方法的可靠性 积分参数的设定 第四部分 维护基础知识 日常维护 目的 维持仪器处于正常运作状态 有效的降低仪器发生故障的频率 延长仪器的使用寿命 准备工作 使用 维护日志设备的耗材和备件维护工具盒试剂 甲醇 异丙醇 稀硝酸等 超声波清洗机 液相系统维护流程图 线路过滤器 单向阀 色谱柱 柱塞密封圈 进样器 检测器 吸滤头 输液系统日常维护部件 排液阀 清洗流路密封圈 柱塞 保险丝 柱塞密封圈 吸滤头 主进口单向阀线路过滤器 辅助进口单向阀 管线选择 材料不锈钢特氟隆 Teflon 聚醚醚酮 PEEK 尺寸 不锈钢材质管路 0 1mmI D x1 6mmO D 0 3mmI D x1 6mmO D 0 5mmI D x1 6mmO D 0 8mmI D x1 6mmO D 0 13mmI D x1 6mmO D 0 25mmI D x1 6mmO D PEEK材质管路 管线材料 不锈钢 可用于所有连接 能承受几百MPa压力酸性或高浓度盐环境中易腐蚀 尤其在pH小于2时 PEEK 可用于所有连接 能承受高达25MPa压力可在整个pH范围 pH1 14 内使用 不适用高溶解性溶剂如三氯甲烷 四氢呋喃等Teflon 用于柱后阻尼管 反应管和排液管 化学惰性大仅能承受0 5MPa压力 管线材料 使用高溶解性溶剂如氯仿 THF等 当ID 0 25mm或0 13mm 氯仿 THF25 以下 10MPa以下的使用 条件时 在实际应用中一般没有问题 特氟隆材质管路 作为废液管的时候 请勿随意增长或缩短其长度 增长管路 会提高 背压 有损坏检测器的危险 缩短管路 容易使得检测器内产生气泡 接头 不锈钢接头 垫圈 主要用于输液泵 进样器的管路连接 能承受40MPa以上的压力 一旦固定 垫圈不可再动 垫圈 不锈钢接头 PEEK接头 主要用于色谱柱 检测器的管路连接 易于安装能承受25MPa的压力 容易产生死体积 PEEK接头 死体积 产生原因 由于管路连接不好产生的额外体积 死体积可能会引起分离度下降和重现性变差等问题 色谱柱 公螺母 死体积 管线 好的连接 差的连接 吸滤头 材料 不锈钢烧结 或陶瓷 孔径10 m 功能 防止较大固体不溶物进入液相色谱 系统 日常维护 定期使用异丙醇 或5 稀硝酸 清洗 故障 吸滤头堵塞 现象 管路中不断有气泡生成 措施 用异丙醇 或5 稀硝酸 浸泡并进行超声波浴清洗 再用蒸 馏水清洗至中性 LC 20AT 选配件支架 压力传感器 泵头固定座泵头 辅助进口单向阀 主进口单向阀 LC 20AT LC 20AD 选配件支架 出口单向阀 压力传感器 泵头 泵头固定座 进口单向阀 进液口 LC 20AD 单向阀结构 注意 请不要分解阀心A和阀心B 重新组装后性能不被保证 输液可能不稳定 单向阀故障处理 故障 宝石球或球座受污导致密封不好 表现 系统压力波动大 措施 1 打开排液阀 用泵输送或用注射针打入异丙醇进行清洗 2 拆下单向阀 放入异丙醇中 超声波浴清洗 注意 超声波清洗时开口端向上放置 单向阀故障处理 故障 宝石球粘附于垫片 表现 泵无法吸液或排液 流路不通 措施 1 用针筒抽出口单向阀 利用产生的负压使宝石球 与垫片分开 2 拆下单向阀 放入异丙醇或水中 用超声波浴清洗 柱塞密封圈 柱塞密封圈 LC 20ADLC 20ABLC 10ADvp 部件号228 35146 取下和安装柱塞密封圈工具 柱塞密封圈 LC 20ATLC 10ATvp 部件号 228 35145 柱塞密封圈故障处理 密封圈 故障 密封圈磨损导致密封不良 现象 系统压力波动大或漏液 措施 更换密封圈 注意 拆卸泵头前 必须将柱塞杆复位 仪器面板上的P SET界面 柱塞杆 泵头清洗管路 流动相 线路过滤器 排液阀 压力传感器 故障 堵塞 现象 系统压力偏高 判断依据 关闭排液阀 断开出口管路 设定流速1mL min 如压力 0 3MPa 可以判定为线路过滤器堵塞 措施 以异丙醇 或5 稀硝酸 为清洗剂 超声波浴清洗 再用水洗至中性 线路过滤器 流动相 过滤器的更换 如果清洗无法解决故障 需要更换线路过滤器 旧过滤器的取出 新过滤器的安装 新型号线路过滤器 部件号 228 35871 99 混合器 混合器不同体积的连接方法 混合器故障处理 常见故障 堵塞混合器堵塞往往是由于混合 器过滤组件堵塞引起的 处理方法 按图中结构卸下过滤组件 5 稀硝酸或其他溶剂超声波浴清洗或更换新的组件 标准或半微量混合器用部件号 228 18872 93 LC 20AT各部件定期检查和维护清单 检查 维护项目 更换柱塞密封圈 清洗并检查 更换 柱塞 更换清洗流路密封圈 检查 更换 辅助进口单向阀并做超声波浴清洗 检查 更换 主进口单向阀并做超声波浴清洗 检查 更换 并清洗线路过滤器 检查 更换 并清洗吸滤头 更换排液阀 6个月 1年 2年 3年 备注 LC 20AD各部件定期检查和维护清单 检查 维护项目 更换柱塞密封圈 清洗并检查 更换 柱塞 检查 更换 膜片 检查 更换 出口单向阀并做超声波浴清洗 检查 更换 进口单向阀并做超声波浴清洗 检查 更换 并清洗线路过滤器 检查 更换 并清洗吸滤头 更换排液阀 泵组件润滑 请咨询岛津各办事处维修部 6个月 1年 更换柱塞时同时更换 2年 3年 备注 手动进样器 手动进样器操作注意事项 针头密封垫 1 进样请使用液相色谱专用平头进样针 2 进样时 进样针应插入针导管到底 3 清洗请使用专用进样口清洗器 不锈钢套4 样品溶液pH小于10 常用密封垫的Vespel材质弹簧 适用pH 10 否则换Tefzel或PEEK材质的转子密封垫 pH0 14 定子 5 不使用手动进样器时将针头留在进样器内 手动进样器维护要点 1 将附件进样口清洗器装在注射器上 2 用注射器吸入清洗液 试样溶液或者不含盐的流动相等 3 在进样 INJECT 状态下 将进样口清洗器压接在针导管上 注入清洗液约1mL 4 使用缓冲溶液后 用纯化水清洗流路和针导管 5 不能使用微型注射器清洗手动进样器 6 请缓慢推压注射器 以免引起清洗液反喷 进样口清洗器 手柄组件 针导管 针管 自动进样器 自动进样器各部件定期检查和维护清单 检查 维护项目 更换针管密封圈 更换柱塞密封圈 更换计量泵柱塞 更换低压阀转子 更换低压阀定子 更换高压阀转子 更换高压阀定子 更换定量环 清洗并检查 更换 溶剂过滤器 针管更换 保险丝更换 面板更换 仅适用于SIL 20AC 润滑油 如果样品冷却器存在过的冷凝则更换 请咨询岛津各办事处维修部 在大约40000次进样后更换 在大约40000次进样后更换 在大约100000次进样后更换 1年 2年 在大约60000次进样后更换 3年 6年 备注在大约40000次进样后更换 思考题 现象 在分析样品过程中 系统压力不断升高 问题 如何确认压力升高的原因 故障根源的确认 分段排除法 如果确认是由色谱柱引起的压力升高 应如何处理 在实验过程中 如何避免这种情况出现 色谱柱常见故障分类 柱压过高 不同色谱柱有差异 不同系统有差异 不同色谱条件有差异 柱效低 重复性差 回收率低甚至不出峰 柱压过高 原因 微粒堵塞 不可逆吸附 日常使用注意点 细菌生长 1 过滤流动相和样品 2 恰当的样品前处理方法 3 使用保护柱 4 注意冲洗系统 解决方法1 正向冲洗色谱柱2 反向冲洗色谱柱3 超声清洗色谱柱筛板 柱效低 解决方法1 正向冲洗色谱柱2 反向冲洗色谱柱3 超声清洗色谱柱筛板4 柱内死体积增加 需更换新柱 日常使用注意点 柱内死体积增加 1 定期冲洗色谱柱 2 防止机械震动和柱压急剧变 化 3 关注色谱柱柱效变化 原因 色谱柱被污染 筛板堵塞 例子 溶解样品的溶剂选择不当 假设 标准品溶剂为甲醇 样品溶剂为乙醇 建议使用流动相溶解样品 不要选择高溶解性的试剂 乙醇作为溶剂甲醇作为溶剂 20uL Caffeine 20uL Caffeine 乙醇作为溶剂 10uL Caffeine 注意 方法开发阶段 请选择合适的进样量 色谱柱的使用注意点 购买新柱后请务必仔细阅读说明书 确认柱的使用条件以及清洗再生步骤 按照说明书条件测试色谱柱柱效 保留所得色谱图 记录使用压力 定期检测柱压和柱效 不同流动相之间转换时应注意溶剂的互溶性 确认样品在流动相中有好的溶解度 进样前请使用0 45 m或0 2 m的一 次性滤膜过滤样品 或者进行其他前处理 为了延长色谱柱使用寿命 请使用保护柱 定期用合适的溶剂 说明书推荐的溶剂 清洗或再生色谱柱 长期不用色谱柱时 应在彻底清洗后使用说明书中指明的溶剂保存柱子 然后从仪器上卸下色谱柱 用堵头密封保存 定期用合适的流动相清洗保存的柱子 避免干涸 紫外检测器 紫外检测器 样品池 硅光电池板 光线 参比池 检测器基线异常 基线噪音异常大输液泵或检测器内存在气泡检测器污染灯老化 出现漂移或波动系统污染 如色谱柱 管路 检测器和流动相等等室温变化 如空调出风口直吹检测器 紫外检测器故障判断 性能判断 SMP