biochemistry-e6-翻译-第13章--膜通道和泵.doc

第十三章 膜通道和泵 经过单一膜通道的离子流动（在左边的示意图中用红色表示通道）可以用全自动膜片钳测定。这种技术能够记录通道开放和关闭状态的电流。生物膜的脂质双层结构本身是离子和极性分子的通透障碍。但是要维持正常的细胞功能，生物膜必须允许一些离子和极性分子通过。两类膜蛋白，即泵和通道，使生物膜具有这样的功能。泵的能量来自能源分子如ATP的水解，或者是光能。泵能利用这些能源驱动离子或分子作热力学的逆向运输（主动运输）。相反，通道不用能量，只是允许离子或分子作热力学顺向运输（被动运输）。泵是一种能量传导装置，能够将一种形式的自由能转化成另一种形式的自由能。ATP驱动的泵油两种，P-型ATP酶和和含有ATP结合盒（ABC）的运输器（transporter）。这两种泵与ATP结合、水解ATP导致泵分子构型转化，使泵结合的离子被跨膜运输。另一种机制利用离子梯度驱动其它物质跨膜运输。大肠杆菌乳糖运输器是这类次级运输器的一个例子。乳糖运输器负责细菌从环境摄取特定糖分子。细胞膜有很多这类运输器。这些运输器的表达决定了细胞所摄取物质的种类。因此调节运输器的表达是控制细胞代谢的主要手段。泵能够建立特定离子持久的跨膜梯度。特定的离子通道允许这些离子迅速跨膜运输到浓度低的一面（被动运输）。由于这些离子通道允许一些离子跨膜流过，而另一些离子（甚至是那些与可跨膜流过离子密切相关的离子）不能通过，因此这些通道成为生物化学最迷人的分子。这些门控离子通道在执行神经系统功能方面起中心作用。神经系统充当导线，允许精细切换神经信号的快速流动。最后，我们讨论另一种种通道，即细胞与细胞之间的通道（或缝隙连接，gap-junction）。这种通道允许离子或代谢物质在细胞之间进行运输。例如分析连接的细胞间物质运输负责心脏跳动时肌肉细胞同步收缩。运输器的表达在很大程度上确定了特定细胞的代谢活性各种细胞表达一套独有的细胞质膜运输器。由于这些运输器在很大程度上确定了细胞从环境摄取离子和代谢物的模式，因此细胞表达的运输器组合非常重要。有些情况下，一个细胞所表达的运输器组合就决定了这个细胞的性质，因为这个细胞只能摄取特定底物从而只能执行特定的生物化学反应。葡萄糖代谢能用来解释这种观点。如同我们在第16章葡萄糖代谢部分将详细讨论的，组织之间的差异在于他们利用不同分子充当能源的能力。哪个组织能够利用葡萄糖主要取决于它们表达葡萄糖运输器的情况。这些葡萄糖运输器包括GLUT1, GLUT2, GLUT3, GLUT4, 和GLUT5。例如GLUT3只在神经元和集中其它类型的细胞表达。在葡萄糖浓度相对较低时，GLUT3与葡萄糖结合相对较紧。在控制和整合活体代谢方面，这些运输器的表达非常关键。葡萄糖运输器只是众多此类情况的第一批实例。13.1 物质的跨膜运输可能主动，也可能被动我们首先考察膜运输的一些通用原则。有两个因素决定一个分子是否跨膜运输：（1）该物质跨过脂质双层膜的通透性，和（2）有无能源可供利用。很多分子的运输需要跨膜的蛋白质运输器如同第12章所述，由于分子自身能溶于脂质双层膜，这些分子能够跨膜运输。这类分子称为亲脂分子(lipophilic molecules)。甾体激素就是一个例子。这些胆固醇类化合物能跨过生物膜，但什么决定这些分子的运输方向呢？它们将沿着浓度梯度方向进行跨膜运输，即简单扩散（simple diffusion）。与热力学第二定律一致，分子从浓度高的区域自动向浓度低的区域移动。如果分子是极性的，情况就复杂多了。如细胞外的钠离子浓度通常是143 mM, 而细胞内只有14 mM，但是钠离子不能跨膜自由移动（因为带电离子不能跨过膜内部的疏水区域）。在有些情况下，如神经信号传递过程中），钠离子必须进入细胞内。那么，细胞如何执行这些作用？膜蛋白质在脂质双层膜构建出钠离子能够通过的特定通道共钠离子的跨膜运输。这种运输方式叫协助扩散(facilitated diffusion), 其离子或分子的扩散运输受膜通道协助。这种运输也是被动运输（因为运输系统没有提供能量，运输的能源来自被运物质自身的浓度梯度）。同酶分子一样，通道有底物特异性。通道能协助有些离子的跨膜扩散，但不能协助另一些离子的扩散（即使它们与底物离子非常接近）。先前钠离子梯度是如何建立的？这就需要泵将钠离子从胞内逆浓度梯度泵出。由于离子是从浓度低的地方输送到浓度高的地方，导致熵值降低，因此执行这一过程需要输入自由能。膜上的蛋白质运输器利用能量将离子或分子沿浓度梯度的反方向运输。利用其他能源将物质逆浓度梯度进行的跨膜运输称为主动运输(active transport)。 图13.1 自由能和运输。（A）不带电的溶质从浓度为c1的区室向浓度为c2的区室运输产生的自由能改变。（B）带电离子跨膜运输到有相同电荷的另一边产生的自由能改变。注意跨膜电位差为59 mV的自由能改变相当于25该离子的跨膜浓度比值大10倍。浓度梯度储存的自由能可以定量分子的不均匀分布含有能量（因为所有区域浓度均一的自由能最低）。因此要获得这种浓度不均一分布（即浓度梯度）需要输入自由能。我们能否确定需要输入自由能才能产生这种浓度梯度（图13.1）？考察一个不带电的溶质分子。这个分子从第1边（其浓度是c1）运输到第2边（其浓度是c2）时自由能的变化是 G = RT ln (c2/c1) = 2.303 RT lg(c2/c1)其中R是气体常数3.315 x 10-3 kJ/mol, 或 1.987 x 10-3 kcal / mol, T是绝对温度，单位是kelvins。对于带电离子跨膜不均匀分布还要考虑跨膜的电势差。浓度差和电势差的总和称为膜电化学势能或膜势能。其自由能是G = RT ln (c2/c1) + ZF V = 2.303 RT lg(c2/c1) + ZF V其中 Z是被运离子的电荷，V是跨膜电势差，F是法拉利常数（96.5 kJ/V.mol, 或 23.1 kcal /V.mol）。如果G是正值，运输是主动的。如果G是负值，运输时被动的。例如，不带电物质从c1 = 10-3M 运输到 c2 = 10-1M, G = 2.303 RT lg (10-1/10-3) = + 11.4 kJ/mol (若温度是298k)。这个数值表明，这种运输需要能量，是主动运输。13.2 有两类膜蛋白利用ATP水解将离子或分子泵过膜动物细胞的胞外液体的盐浓度与海水相似。但是细胞必须控制细胞内离子浓度，防止离子达到有害的高浓度状态，有利于一些生化反应的进行。例如，与胞外溶液相比，大多数动物细胞内含有高浓度的钾离子，但钠离子浓度较低。这些离子浓度梯度是特定的运输系统造成的。这个运输系统是Na+ - K+ 泵或Na+ - K+ ATPase。这个泵对ATP的水解产生了Na+ 主动运出细胞和 K+主动运入细胞所需要的能量，产生离子梯度。只有Na+ 和 K+都存在时，这个泵才能水解ATP，所以称为Na+ - K+ ATPase。与其它ATPase一样，该酶需要Mg2+.Na+和K+运输伴随着自由能的变化可以计算。假定胞外钠离子浓度是 143 mM，胞内是 14 mM，而胞外钾离子浓度是4 mM, 胞内是157 mM, 跨膜电位是-50 mV，温度是 37，那么运输 3 mole Na+到胞外，运输2 mole K+到胞内需要 3 x 5.99 + 2 x 9.46 = + 36.9 kJ/mol。ATP水解能提供 50 kJ/mol来驱动离子的主动运输。Na+和K+主动运输有重大的生理意义。实际上没有运动的细胞内超过1/3的ATP用来驱动这些离子泵的运转。动物细胞的Na+和K+浓度梯度控制细胞体积，使神经元和肌肉细胞能被电激活，驱动糖和氨基酸的主动运输。随后纯化的其它离子泵表明离子泵蛋白质存在于从细菌、古生菌、到所有真核生物，是一个蛋白大家族。这些离子泵能够主动运输特定离子。其中两个泵有特殊意义。Ca2+ ATPase能够将Ca2+运出细胞质，运入肌细胞内质网；胃H+ -K+ ATPase将质子泵入胃，使之pH值低于1.0。这些酶和众多已知的同源物，包括Na+ - K+ ATPase，称为P-类ATPase，因为它们能形成关键的磷酸化中间产物。在形成该中间产物的过程中，ATP提供的磷酸基团与ATPase的一个保守的天冬氨酸残基的侧链形成共价连接。P-类ATPase将磷酸化和泵构象转换偶联，实现钙离子的跨膜运输膜泵作用原理简单，但是作用细节很复杂。基本上，每个膜泵蛋白质有两种功能状态，即朝向生物膜一侧开放的离子结合状态和朝向生物膜另一侧开放的离子结合状态（图13.2）。为了在单一方向跨膜运输离子，自由能的利用必须与泵蛋白构象转换偶联。图13.2 泵作用。用膜泵将一个分子跨膜运输的示意图。泵在两种构型之间相互转换，每种构型都有一个离子结合位点，但是泵的开口分别处于生物膜的不同侧面。我们以肌肉细胞内质网膜的Ca2+ ATPase为例，来介绍P-类ATPase结构域特征。依靠5种不同状态泵的晶体结构，已经确定了这类ATPase成员的详细特性。肌肉细胞内质网膜的Ca2+ ATPase站内质网膜蛋白量的80%在肌肉收缩方面起重要作用。细胞质Ca2+浓度迅速提升导致肌肉收缩。而细胞质Ca2+迅速运入内质网导致细胞质Ca2+浓度迅速降低使肌肉松弛。度迅速提升导致肌肉收缩。肌细胞内质网是储存Ca2+的特定场所。将细胞质Ca2+运入肌细胞内质网的是SERCA。这种泵使细胞质Ca2+浓度维持在0.1 mM，而内质网的Ca2+浓度处于1.5 mM水平。阐明的第一例SERCA有Ca2+结合，但没有核苷酸（图13.3）。SERCA只有一条多肽链，大小是110 kD，有一个含有10个a螺旋的跨膜区。这个跨膜区有两个Ca2+结合位点。每个Ca2+能够与7个氧原子形成配位键。这7个氧原子来自多肽链的谷氨酸、天冬氨酸、苏氨酸、天冬酰胺侧链基团，多肽链骨架的羰基，和水分子。面向细胞质的头部大，相当于整个蛋白质质量的一半，由三个不同的结构域构成。这三个结构域有不同的功能。一个结构域（称为N）与ATP结合，另一个结构域（称为P）的保守天冬氨酸接受磷酸，第三个结构域(A)充当调解器(actuator)，将蛋白质N和P结构域的变化与这个蛋白的跨膜区域联系起来。图13.3 Ca2+泵结构。P-类ATPase成员SERCA的结构。注意两个钙离子（绿色）处于跨膜结构域的中心。保守的天冬氨酸残基(Asp351)与磷酸基团结合，位于P结构域。bb表示多肽骨架链的羰基。SERCA在结构上明显处于动态。图13.4是没有与Ca2+结合，但是P结构域有磷酰天冬氨酸类似物的SERCA结构。N和P结构域处于磷酰天冬氨酸类似物附近，A结构域发生明显的旋转（与已经结合Ca2+的SERCA蛋白相比）。而且，酶的跨膜部分也发生了重排，Ca2+结合位点的结构被破坏，Ca2+可以从另一面（处于N, P, 和A结构域反面）与蛋白质结合。图13.4 泵Ca2+有关的SERCA的结构变化。P结构域有磷脂酰天冬氨酸，但没有结合Ca2+的SERCA结构。该结构与图13.3的SERCA（已经与Ca2+结合）的结构不同，其跨膜区(黄色)和A, P, 和N结构域发生你的重排。图13.5 泵Ca2+过程。Ca2+ATPase通过下列机制运输Ca2+：（1）蛋白质与胞质面的Ca2+结合，（2）ATP结合，（3）ATP裂解，将磷酸基团转移给酶Asp351，（4）释放ADP，酶蛋白翻转，在膜的另一面释放Ca2+，（5）磷酸天冬氨酸水解，（6）酶翻转成可以接受细胞质Ca2+的结构状态。综合考虑这些结构数据和其它研究结果，人们构建出SERCA Ca2+泵的详细机制（图13.5）。1. 催化周期起始是酶结合了两个Ca2+离子，但没有磷酸化。反应前没有结合Ca2+的酶称为E1，结合了Ca2+的结构称为E1-(Ca2+)2。这种构型的SERCA酶能够交换Ca2+，但是只局限于膜的细胞质这一面。2. E1结构的酶蛋白与ATP结合。由于N，P，和A结构域处于结合ATP位点附近，这些结构域发生结构重排。但是酶蛋白的跨膜结构域没有结构变化。Ca2+被俘获于酶蛋白分子内。3. 磷酰基从ATP转移到Asp351.4. 释放ADP，酶蛋白的结构（包括跨膜结构域）又发生变化。新的构型称为E2或E2-P（如果是磷酸化状态）。E1和 E2之间的结构转换有时称为构型翻转(eversion)。E2-P构型的酶蛋白，其Ca2+离子结合位点遭到破坏，Ca2+离子被释放到膜的另一面，达到了运输Ca2+离子的目的。其构型见图13.4。5. 磷酰天冬氨酸发生水解，释放无机磷酸。6. 随着无机磷酸的释放，E2构型中各种结构域之间的相互作用也不能维持，酶蛋白质又发生翻转，恢复E1结构。在细胞质面结合两个Ca2+离子，完成了SERCA运输Ca2+离子的一个周期。这种运输机制适用于其它P-类ATPase。例如，Na+ - K+ ATPase是a2b2四聚体，其a亚基与SERCA同源，含有域Asp351类似的同源天冬氨酸。B亚基不直接参与离子运输。离子的运输机制与图13.5描述的机制相似。E1构型结合胞内3个Na+离子，E2构型结合细胞外2个K+。洋地黄（digitalis）阻止Na+ - K+ 泵脱磷酸化，特异抑制Na+ - K+ 泵活性植物来源的一些甾体化合物是很强的Na+ - K+ 泵抑制剂（Ki 10 nM）。毛地黄毒苷(digitoxigenin)和哇巴因（ouabain）属于这类抑制剂。这些化合物对心脏影响强烈，称为强心类固醇（图13.6）。在膜的胞外面使用这些化合物，它们能抑制E2-P型的Na+ - K+ 泵脱磷酸。洋地黄是从植物的干叶子中获取的强心胆固醇类混合物。这种化合物能增强心肌的收缩力，是治疗充血性心力衰竭（congestive heart failure）的选择药物。洋地黄抑制Na+ - K+ 泵使细胞内Na+ 浓度较高。Na+浓度梯度降低使Na+ - Ca2+ 交换器外排Ca2+ 速度降低。结果细胞内Ca2+ 浓度增加，促进心肌收缩。有趣的是，在人们发现洋地黄抑制Na+ - K+泵之前，人们已经有很长时间都在有效地利用洋地黄。1785年，英国医生William Withering听说一位Shropshire的老妇人用植物干叶子抽提液治疗“积水”疾病（就是今天的充血性心力衰竭）。Withering首次对植物干叶子抽提液治疗充血性心力衰竭进行科学研究，证实其治疗效果。毛地黄是获取洋地黄的原料。洋地黄是使用最广泛的药物之一。 图13.6 毛地黄毒苷。强心类固醇如毛地黄毒苷阻止E2-P脱磷酸，从而抑制Na+ - K+ 泵。P-类ATP进化保守、能执行很多功能酵母全基因组序列指出有16个蛋白质属于P-类ATPase家族。更详细的序列分析提示，其中两个蛋白质运输H+，两个蛋白质运输Ca2+，三个蛋白质运输Na+，两个运输金属离子（如Cu 2+ ）。还有5个蛋白质参与头部带有氨基的磷脂运输。这种运输能够将磷脂酰丝氨酸类磷脂从生物膜的内半面运输到外版面，维持生物膜的不对称性。这5种蛋白质称为翻转酶（flippase）。令人印象更深刻的是，人基因组编码70种P-类ATPase。该蛋白家族的所有成员所采用的机制基本相同。ATP水解提供的能量导致膜蛋白构型转化、驱动生物膜运输。这种构型转化是由于各种蛋白质特定的天冬氨酸发生磷酸化和去磷酸化诱导产生的。多重药物抗性显示具有ATP结合域的膜泵家族蛋白的重要性对人类疾病的研究揭示另一个重要的运输蛋白家族，其蛋白质结构和运输机理与P-ATPase家族明显不同。培养的肿瘤细胞能够耐受那些起初对细胞毒性很大的药物。这种细胞有耐药性后，对其他药物也有一定程度的抗性。这种现象叫多重药物抗性。后来发现分子质量为170 kD的膜蛋白质表达及其活性水平与多重药物耐受性密切相关。这种蛋白质是依赖于ATP的分子泵，能够从细胞内泵出各种大小的小分子。这个膜蛋白称为多重药物抗性蛋白（MDR）或P-糖蛋白。因此，将这种细胞暴露于药物环境中，细胞膜上的MDR泵能够将细胞内还没有发挥作用的药物泵出细胞。MDR及其同源蛋白的氨基酸序列分析显示这些蛋白有共同的结构特征（图13.7）。每个蛋白质有四个结构域：两个结构域跨膜，两个ATP-结合cassettes（ABC）与细菌和古生菌运输蛋白相应的结构域相似。含有这些结构域的运输蛋白称为ABC运输子。从大肠杆菌基因组鉴定出ABC运输子有79个成员，属于最大的单一家族。人类基因组含有150多种ABC运输子基因。图13.7 ABC运输子。多重药物抗性蛋白(MRD)是含有两个跨膜域和两个ATP结合域（即ATP结合盒蛋白ABCs）大家族的代表。ABC蛋白属于P-loop NTPase超家族的成员。现在已经确定了几个ABC运输子家族成员的三维结构。其中一个是霍乱弧菌（Vibrio cholerae）脂质运输子，见图13.8。这个蛋白质是62-kD多肽链形成的二聚体。每个蛋白质的N-端半分子是跨膜区，C-端半分子是ATP结合盒。与真核MDR蛋白质不同，有些ABC蛋白（尤其是原核生物的ABC蛋白）是多亚基蛋白。有些是二聚体，有些是两种ATP结合盒亚基与另外两种跨膜蛋白亚基形成异源四聚体。而真核生物的一个多肽链就包含了原核生物几种多肽链的酶活性。两种ATP结合盒相互接触，但是不结合ATP时两者的相互作用力不强。在结构研究和其他研究结果的基础上，人们提出了这些蛋白运输的机制（图13.9）。图13.8 ABC运输子结构。霍乱弧菌的脂质运输子是ABC运输子的代表，其结构含有两个ATP结合盒（蓝色）与P-loop NTPase有关。这个蛋白质与P-loop NTPase 一样含有P-loop(绿色)。周围的b-链和a-螺旋用紫色表示。图13.9 ABC运输子的作用机制。该机制包括下列步骤：（1）通道口朝向细胞内；（2）底物结合后，ATP结合盒构型变化；（3）ATP结合导致蛋白质构象进一步改变；（4）两个跨膜结合域分离，底物释放到膜的另一侧；（5）ATP水解恢复运输子的起始状态。1 运输子的起始状态既没有结合底物，也没有结合ATP。运输子结合位点可以开放也可以关闭。2 胞内底物进入开放形式运输子中央洞穴。底物的结合导致ATP结合盒构象变化，使之与ATP的亲和力增加。3 ATP与ATP结合盒结合，使蛋白质构象发生变化，使两个ATP结合盒之间相互作用力加强。4 这种加强又影响了蛋白质两个跨膜域之间的相互作用，导致底物释放到细胞外。5 ATP水解，释放ADP和无机磷酸，又将蛋白质结构恢复到起始状态。真核生物ABC运输系统将胞内物质运输到细胞外，而原核生物的ABC运输系统常常将胞外物质运输到细胞内。细菌有一个特殊的结合蛋白与ABC运输子联合作用，将底物供给ABC运输子并刺激细胞内ATP水解。这些结合蛋白存在于细菌细胞的膜间隙（periplasm, 就是细菌的两层细胞膜之间的区室）。因此，ABC运输系统的运输机制与P-类ATPase不同之处在于水解ATP与蛋白质构象变化偶联。然而，这两种作用机制的净结果是相同的：即从膜一面结合底物的构型转化成另一面释放底物的构型。13.3 乳糖透过酶（lactose permease）是次级运输子的原型，利用另一物质的浓度梯度来驱动这些次级运输子。很多运输过程不是直接利用ATP水解产生的能量驱动的。这些运输子逆浓度梯度运送某一离子或分子与另一离子或分子沿浓度梯度流动相偶联。这种运输子叫次级运输子或耦合运输子(cotransporter)。将这些运输蛋白归类为反向运输者(antiporter)或共运送体(symporter)。反向运输体将一种物质跨膜的逆浓度梯度运输与另一种物质跨膜的顺浓度梯度运输偶联，而且两种物质跨膜运输的方向相反。共运送体将一种物质跨膜的逆浓度梯度运输与另一种物质跨膜的顺浓度梯度运输偶联，但两种物质跨膜运输的方向相同。还有一类与此相关的蛋白叫单一传递体（uniporter），与离子通道一样，能够将特定物质沿着膜两面的浓度差进行双向运输（图13.10）。图13.10 反向运输体、共运送体、和单一传递体。次级运输子能够将两种物质跨膜反向运输（反向运输体，antiporter）、同向运输（共运送体， symporter），或将单一物质跨膜双输送(单一传递体，uniporter)。次级运输子是一种古老的分子机器，普遍存在于今天的细菌、古生菌和真核生物。例如大肠杆菌基因组编码160个左右的次级运输子蛋白质。序列比对和亲水作图分析提示这个最大家族的成员有12个跨膜螺旋，来自一种具有六个跨膜螺旋蛋白的基因重复和融合。大肠杆菌乳酸透过酶属于这一家族的成员。这个运输子利用H+浓度梯度驱动细菌摄取乳糖和其它糖类物质。细胞氧化燃料分子产生的能量驱动细胞将胞内H+运输到细胞外，因此胞外H+浓度高。糖分子自胞外向胞内运输时，乳酸透过酶也将胞外H+运入胞内（属于同向运输）。H+自胞外向胞内顺浓度梯度跨膜运输，能够释放自由能。后者能够驱动糖逆浓度梯度跨膜运输。这个运输蛋白被研究了几十年，可以拿来作为这类蛋白的原型。图13.11 与乳糖类似物结合的乳糖透过酶结构。蛋白质的N-端半分子（蓝色）和C-端半分子（红色）的侧视图（A）和分子底部视图（从胞内朝外看）。这个蛋白结构的两个半分子之间有一段多肽链连接，糖分子底物周围是蛋白质的两个半分子。乳糖透过酶的空间结构已经确定（图13.11）。如同序列分析所预测的，这个蛋白质分为两个半分子，每个半分子有六个跨膜a-螺旋。有些螺旋不够规则。两个半分子之间用一段多肽链连接。在这个蛋白的结构中，糖分子处于蛋白中心的口袋内。这个口袋有一个通道到达细胞内。基于这些结构研究和大量的其它实验，人们提出了共运送体的作用机制（图13.12）。这种运输机制与P-类ATPase和ABC运输子的运输机制很相似。1. 开始状态是两个半分子构成的底物结合口袋开口朝向细胞外，其构型与至今解析出来的底物结合状态不同。细胞外质子与透过酶的一个残基（很可能是Glu 269）结合。2. 在质子化状态，透过酶能够结合细胞外的乳糖。3. 结构发生反转，成为我们所观测到的蛋白晶体结构（图13.11）。4. 透过酶将乳糖释放到细胞内。5. 透过酶将质子释放到细胞内。6. 透过酶反转恢复起始状态的构型。在这个运输过程中，质子化位点可能发生了变化。这种翻转机制可能适用于所有的次级运输蛋白，这些蛋白的结构与乳糖透过酶相似。13.12 乳糖透过酶作用机制。起始状态的透过酶开口朝外，与细胞外质子结合（1）后，与底物结合（2）。透过酶反转（3），向细胞内释放底物（4）和质子（5），再一次翻转（6）完成一个周期的物质运输。13.4 特殊通道让离子迅速跨膜运输泵能够在一秒钟内运输几千个离子。其它被动运输系统的膜蛋白成为离子通道(ion channels)运输速度超过1000倍。离子通道运输离子的速度接近于水相离子自由扩散的速度。然而离子通道并不简单地就是生物膜上离子可以自由通过的管道。离子通道具有精细结构和作用机制，蛋白构型的精确调节能应答环境理化变化。离子通道作用的最重要用途之一是神经脉冲。神经脉冲是神经系统进行通讯的主要手段。神经脉冲是神经元跨细胞膜流动离子产生的电信号。神经元内部与其他细胞相似，含有高浓度的K+和低浓度的Na+。这些离子的跨膜梯度是细胞膜Na+ - K+ ATPase作用所致。细胞膜内外离子浓度的比例确定了细胞膜的跨膜电势差。在休息状态细胞膜典型的电势差是-60 mV。当膜去极化到一定阈值（如从- 60 mV到- 40mV）就产生了一个神经冲动，或称为膜电位作用。在膜电位恢复起始数据之前，在极短的时间（毫秒）内膜电位达到+30 mV。这种放大的去极化沿着神经传递到神经元终端（图13.13）。图13.13 动作电位。细胞膜的短暂去极化和恢复极化沿神经元传递信号。Alan Hodgkin和Andrew Huxley的明智实验指出，动作电位来自轴突膜对Na+和K+离子通透性变化，这种变化幅度大，时间短。首先膜对Na+通透性发生变化。膜去极化达到一定阈值导致膜对Na+通透性突然增加。由于细胞膜两侧存在电位差，Na+进入细胞内。钠离子的进入导致细胞膜去极化，使膜的通透性进一步增加。这种正反馈导致膜电位迅速、大幅度变化，在毫秒内从-60mV上升到+30mV。膜自动转变成对钠离子通透性降低，而对钾离子通透性大。结果钾离子向细胞外流动，膜电位重新恢复负值。随着钾离子的外流，几毫秒内静息膜电位恢复至-60 mV。沿着神经细胞，去极化后接着就是重新极化，速度极快。在几毫秒内，你的大脑就能感觉到你脚趾的接触（刺激）。动作电位的作用模式假定膜上有特定的Na+和K+离子通道。这些通道应答膜电位变化时必须开放，开放一定时间后有必须关闭。在直接检测和鉴定工具出现之前，这个模型就预测出细胞膜上有具有特定性质的分子。膜片钳电流测定显示单一通道的活性1976年Erwin Nehr和Bert Sakmann建立膜片钳技术。利用这一技术直接证实细胞膜有这些通道（图13.14）。该技术能够测定一小片细胞膜的离子电导。值得注意的是，这种技术观测到膜电导逐步改变，相应于膜通道的开放与关闭。用这种技术，直径为1 mm的透明枪头压在一个完整细胞上形成密封（图13.15）。轻轻吸取使膜与枪头贴附更紧，溶液的电阻达到千兆欧姆(gigaohm, = 109ohm)。因此，千兆欧姆的封闭（gigaohm seal）保证枪头的电流与枪头所接触的细胞膜电流一致。因此可以用这种装置检测微秒时间内经过单个通道的离子流动和膜通道的开放与关闭。而且，天然膜环境（甚至是完整细胞）中一个通道的活性也可以用膜片钳技术直接观测。膜片钳技术首次能够观测一个生物分子的作用。随后发明了研究一个分子作用的其它研究方法，给生物化学开辟了新的研究领域。 图13.15 膜片钳模式。膜片钳技术检测通道活性很有用。枪头与小片细胞膜紧密接触形成高电阻密封（gigaseal）。这种装置叫细胞接触模式（cell attached mode）。增加吸力导致细胞膜破裂，结果是细胞内容物和枪头之间的电阻值降低。通道的活性可以用whole cell mode（全细胞模式测定）。为了将膜制备成切片钳模式(excised-patch mode)，将枪头拉离细胞，其细胞质面面向介质的一片细胞膜可以用膜片钳枪头检测。图13.14 用膜片钳技术检测单个离子通道，结果显示单个通道自进行开放-关闭的转换。钾离子通道的结构是很多离子通道结构的原型膜片钳技术证实膜有离子通道，人们就开始寻找构成这种离子通道的分子。首先从电鳗的发电器官纯化出Na+通道，这种器官有很多形成Na+通道的蛋白质。基于这种通道蛋白能够与特定的神经毒素（tetrodotoxin）结合，纯化Na+通道。Tetrodotoxin从河豚鱼中分离，与Na+通道结合力很强(Ki 1 nM)。成人的致命剂量是10 ng。分离的Na+通道蛋白是一条260 kD多肽链。随后克隆并测定了Na+通道的cDNA。有趣的是，通道蛋白含有四个内部重复，每个重复含有相似的氨基酸序列，提示这个通道蛋白在进化过程中发生了基因重复和差异化。亲水性作图显示每个重复含有5个疏水区（S1, S2, S3，S5和S6）。每个重复还含有一个富含正电荷的S4区域，其中带正电荷的精氨酸或赖氨酸约占该区域的1/3。有人提出S1至S6构成蛋白质跨膜的a-螺旋。带正电荷的S4区域充当通道的电位传感器。K+通道蛋白的纯化难度就大多了。这个蛋白质含量低，也没有相应的高亲和配体可供使用。在研究果蝇突变体时获得一个突变体，用乙醚麻醉剧烈颤抖。基因定位并克隆了这个基因，取名为shaker基因。这种缺陷揭示氨基酸序列编码基因是K+通道蛋白。Shaker cDNA编码的蛋白质有70 kD，有4个亚基。值得注意的是，每个多肽链都含有Na+通道一个重复所含有的S1 S6序列，因此K+通道亚基与Na+通道的一个重复同源。与这种假定一致，四个K+通道蛋白亚基结合在一起形成有功能的通道。最近发现细菌K+通道只含有两个跨膜区域，相当于S5和S6片段。这些结果和其它信息提示S5和S6，包括这两个片段之间的区域，实际上形成了K+通道。S1至S4区域含有开启通道孔的装置。图13.16总结了这些离子通道之间的序列关系。图13.16 离子通道的序列关系。颜色标出了Na+通道，Ca2+通道，和K+通道序列相近的区域。无论是单一多肽链蛋白，如Na+通道，Ca2+通道，还是四聚体蛋白K+通道，每个通道蛋白有相似的四重对称。1998年，Roderick MacKinnon等测定了细菌K+通道（来自于Streptomyces lividans）的x-射线晶体结构。该通道蛋白只含有S5和S6区域形成的孔道。如同所料，K+通道是四聚体，每个亚基有两个跨膜的a-螺旋（图13.17）。这四个亚基结合在一起形成一个孔道，中央呈圆锥形。图13.17 K+通道蛋白的结构。K+通道有四个完全相同的亚基，四聚体成圆锥形朝细胞内开口大些（中间图）。左图是从细胞内向细胞外观测，显示各个亚基之间的相互关系。右边的图显示单一亚基的结构。孔道形成区用灰色表示。K+通道结构揭示离子特异性的结构基础图13.17 显示的结构是K+通道处于封闭状态的情况。提示这个通道如何排除其它离子，但不排除K+。通道在胞内的口径是10A，然后收缩成直径为8A的孔洞。在通道的入口和孔道中央都充满水分子。没有脱去外层结合水分子的K+离子适于这一通道孔径。这个孔径的长度约占整个通道的2/3。余下的1/3变得更窄，只有3A。如果要通过这一段，K+必须脱去结合的水分子，只与蛋白质分子的相关基团相互作用。通道结构使离子跨膜的路径从34A变成12A。溶剂化离子先进入通道前面的区间，然后与通道蛋白直接相互作用（图13.18）。图13.18 膜通道的路径。在K+通道内与水结合的K+（蓝色）能够向膜内运行22A（孔径为8A），然后必需脱去结合的水分子，与孔道蛋白氨基酸残基的羰基（红色）相作用，穿过余下的路径（直径只有3A的孔道，即黄色区域）。要K+去水，就需要其他极性相互作用替代那些K+水分子的相互作用。孔道的限制性成分是每个蛋白亚基的两个跨膜a-螺旋，尤其是这个区域的一段五氨基酸残基区作为该通道的过滤器，使之具有针对K+的选择性（图13.19）。这段氨基酸序列是Thr-Val-Gly-Tyr-Gly (TVGYG)。该序列几乎在所有的K+通道保守，是鉴定K+通道的标志序列。这段保守序列区域呈伸展状态，位置定位是肽键的羰基朝向通道，有利于它们与K+相作用。图13.19 K+通道的选择性过滤装置。K+与选择性滤器序列TVGYG肽键的羰基相互作用。该滤器处于通道孔径只有3A区域。图中只显示四亚基通道蛋白的两个亚基。K+通道对K+的通透性是Na+的100倍。如何达到这样高度的选择性？离子半径超过1.5A的离子不能通过这个狭窄直径只有3A的通道。但是，Na+的半径比K+还小，通过这个狭窄通道应该没有问题。为什么钠离子也不能通过呢。关键在于离子脱水造成的自由能变化。Na+去水，自由能改变是72 kcal mol-1, K+去水，自由能变化是55 kcal mol-1。K+去水所需要的能量因K+在通道内与两侧的羰基氧原子相互作用获得补偿。但是Na+半径太小，无法语通道两侧的羰基氧原子相互作用（图13.20）。由此，钠离子脱水的成本太高。钾离子通道能够阻止相近的钠离子通过的原因在于，钠离子处于水合状态，不能通过该通道。 图13.20 离子选择性的能量基础。K+离子脱水所耗费的能量因K+离子与过滤器特异性作用获得补偿。由于Na+离子太小，与这种滤器不能建立这种特异的相互作用而不能补偿离子脱水所耗费的能量，因此Na+离子无法通过离子通道。蛋白质结构决定这种通道只针对钾离子。这方面的知识为我们了解钠离子和钙离子通道蛋白结构与功能提供了良好的基础。序列比较和突变研究的结果显示钙离子通道蛋白S5和S6中间的区域与通道蛋白的钙离子选择性有关。钙通道蛋白有四个亚基，每个亚基的钙离子选择区有一个谷氨酸残基是离子选择性的关键。相应于钙离子通道蛋白钙离子选择区的谷氨酸残基处，Na+离子通道蛋白相应位置分别是天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、和丙氨酸（即DEKA）。这样一来，Na+离子通道蛋白就不是四重对称蛋白。实际上，Na+离子通道蛋白是一条多肽链（其他离子通道是四个同一亚基构成的蛋白复合物）。Na+离子通道蛋白选择Na+而不是K+，依靠的是离子半径。由这些氨基酸残基和其它残基构建的膜孔只适于Na+或Li+离子通过，而较大的离子如K+则不能通过这个通道。钾离子通道的结构说明它能迅速运输离子选择要求离子与通道蛋白结合紧密，这样会降低运输速度。但是通道在运输离子时速度要快。如何解决这个矛盾？K+离子通道高分辨率结构分析结果似乎能解释这个现象。K+离子通道四个与K+离子结合的位点对K+离子快速通过这个狭窄区域非常关键。离子跨膜是从细胞内起始的（图13.21）。高度水合的K+进入通道，通过较为宽松的区域。随后，K+离子脱去结合的水分子，选择性结合于通道过滤区。K+离子可以在选择过滤器的四个位点移动（因为这些位置与离子的亲和性相当）。随着后续的K+离子进入选择过滤区，其正电荷之间相互排斥，导致前面的离子向前移动。因此狭窄通道每结合一个K+离子，则促进先前进入通道的K+离子从另一侧释放。多重结合机制解决了离子高度选择性和离子快速移动之间的矛盾。图13.21 K+离子运输模型。选择性滤器有4个结合位点。高度水合的K+离子脱去结合水分子后，能进入这些位点。当两个K+离子占据相邻的结合位点，静电排斥力驱使它们分离。因此离子从一侧进入通道，则驱使离子从另一侧离去。图13.22 电压控制的K+离子通道结构。（A）从上向下看膜孔。（B）从侧面看膜孔。注意携带正电荷的S4区域（红色）位于孔底部结构外面。电压控制的离子通道需要蛋白构型发生变化有些膜Na+离子和K+离子通道由膜电位控制。在跨膜电位差发生变化时发生构象变化。我们已经知道，电压控制的离子通道除了S5和S6区域形成的孔道外，还有S1 S4区域。用X-光晶体衍射已经确定了Aeropyrum pernix电压控制的K+通道的结构（图13.22）。S1 S4区域形成的结构域称为paddles（划桨），从膜孔核心向外凸出。这些划桨包括S4片段形成的a-螺旋（带正电荷氨基酸残基）。与预期不同，S1 S4区域不在蛋白质区域内，而是躺在膜上。基于该蛋白的机构和其他一些研究的成果，Roderick MacKinnon及其同事提出了电压控制的离子通道作用模式（图13.3）。在关闭状态，划桨躺在“下面”的位置。当膜去极化后，划桨被拉“起”。在拉起位置，它们将孔道四侧向外拉，提高了滤器的选择性，并开放离子通道。图12.23 电压控制离子通道作用模型。电压传感器（即划桨）处于关闭通道下部，呈“躺下”状态（左边）。膜去极化将这些划桨经过膜“拉起”，将孔道基部拉开，开启离子通道(右）。阻塞孔道：球-链模型Na+离子和K+离子通道开放几毫秒后就得关闭（图13.24）。用胰蛋白酶处理Na+离子和K+离子通道的细胞质侧，膜通道细胞质侧发生水解。当生物膜去极化导致Na+离子和K+离子通道开放后，这种通道就持续开放（不关闭）。而且，缺乏接近于N-端的42氨基酸的Shaker通道突变体，在膜去极化后开放，不能关闭。加入一段合成肽（天然蛋白N-端的20肽相同）又能封闭该通道。图13.24 K+离子通道的失活。N-端区域对K+离子通道关闭尤为重要。（A）野生的Shaker K+离子通道开放后迅速关闭。（B）缺乏6 46位氨基酸的K+离子通道突变体不能关闭通道。（C）加入100 mM 合成肽（就是野生蛋白1 20位氨基酸序列），能够关闭突变型K+离子通道。这些试验强烈支持多年前提出的通道失活的球-链模型（图13.25）。根据这个模型，K+离子通道前面的20氨基酸形成一个存在于细胞质的结构单位，即球。通过一个可变区域（即链）将球与蛋白质连接起来。当通道关闭时，球在水溶液中自由旋转。当通道开放时，球能迅速找到互补位点并加以堵塞。因此通道开放的时间很短，然后被球塞住。将链的长度缩短能加快球堵塞通道的速度，因为球能够迅速找到目标。相反，增加链的长度会降低孔道关闭的速度。因此改变链的柔软性和长度就能够控制孔道开放状态所持续的时间。我们可以理解为，带有正电荷的“球”结构域是用链条连接的阳离子，能够被拉入开放的孔道，结果造成孔道堵塞。图13.25 通道失活的球和链模型。球（灰色）用柔软的“链条”连接。在孔道关闭状态，球处于细胞质中。去极化导致膜通道开放，也形成了孔道口阳离子球的结合位点。球移入这个位点导致通道堵塞。乙酰胆碱受体是配体-门控离子通道神经脉冲是神经递质（一种小的可扩散分子）跨过突触的通讯。乙酰胆碱是一种神经递质。突触前细胞膜与突触后细胞膜之间有宽度达50 nm的间隙，成为突触间隙(synaptic cleft)。轴突末端的神经脉冲导致末端内部约300个含有乙酰胆碱的小泡同时外排到突触间隙（图13.26）。乙酰胆碱与突触后细胞膜受体结合，显著改变突触后细胞膜的离子通透性，启动动作电位。乙酰胆碱与乙酰胆碱受体（即乙酰胆碱-门控离子通道）的结合，导致离子通道的开放，而该通道开放后对Na+和K+的通透性几乎相同。 图13.26 乙酰胆碱和突触示意图。乙酰胆碱受体是研究得最深入的受体-门控通道。这类通道不受膜电位控制，而受相应的配体控制。乙酰胆碱与通道蛋白结合后，通道短暂开放。Torpedo marmorata的电器官是进行乙酰胆碱受体研究的良好资源。这种器官产生电压的细胞膜上有非常丰富的突触后细胞膜应答这些神经递质。膜上乙酰胆碱受体的密度达到 20000 mm-2的水平。加入非离子型去污剂将膜蛋白溶解，然后用共价交联了cobratoxin（从蛇分离的、与乙酰胆碱受体亲和力很高的小蛋白质）的柱子进行亲和层析，纯化乙酰胆碱受体。经分析鉴定，证实乙酰胆碱受体是五聚体，分别是a2, b, g和d。蛋白质分子质量是268 kD。这四种亚基跨膜亚基排列成环，构成跨膜通道。Torpedo marmorata (也称为electric ray)有一种电器官富含乙酰胆碱受体，在1秒钟内可以提供高达200 V的电压。随后人们克隆这四种亚基（50 58 kD）的cDNAs并测定了它们的核苷酸序列，结果显示这些亚基有明显的序列相似性。这四个亚基a,b, g和d来自同一祖先基因，经过基因重复和差异化形成的。每个亚基有一个很大的胞外结构域。胞外结构域的C-端是跨过脂质双层膜的疏水区域。乙酰胆碱结合于a-g和a-d的界面。用电子显微镜观测纯化的乙酰胆碱受体，结果显示该蛋白约呈五重对称。这种结构与这种蛋白质的五个组成亚基均相似的情况一致（图13.27）。图13.27 乙酰胆碱受体的结构。高分辨电子显微镜研究推测的乙酰胆碱受体的结构模型显示，每个亚基都有一个大的胞外结构域（该结构域主要是b-链），四个跨膜a-螺旋，最后的一个a-螺旋处于细胞内。（A）从侧面观测五聚体蛋白，用不同的颜色表示不同的结构域。其中的一个a亚基单独列出(左边）。（B）从胞外向模孔观测的结构图。通道开放的基础是什么？直接比较封闭和开放状态下通道的结构就能回答这个问题。但是没法获得相应的结构进行这种比较。冷冻电子显微图谱（cryoelectron micrographs)显示乙酰胆碱与胞外结构域结合导致蛋白结构改变，这种改变启动排列在膜上的a-螺旋发生旋转。跨膜a-螺旋的氨基酸序列显示，螺旋中有小的极性或中性（丝、苏、甘）和大的非极性（亮、异亮、苯丙）氨基酸构成交替的脊（ridges)。在封闭状态，大的氨基酸残基占据通道，形成一种压得很紧的疏水环（图13.28）。实际上，每个亚基在关键位置有一个亮氨酸残基。乙酰胆碱与受体蛋白结合，可能导致膜蛋白别构旋转跨膜螺旋的排列，使小氨基酸残基的侧链排列在孔道内。此时孔道较大、极性更大，适于Na+和K+通过。图13.28 乙酰胆碱受体的开放。电子显微重构的乙酰胆碱受体结构截面图。左边是封闭型，右边是开放型（与图13.27的结构一致）。M1, M2, M3, 和M4表示每个亚基的四个跨膜a-螺旋。与乙酰胆碱受体结合后冰冻20ms观测通道蛋白开放的结构（截面图）。注意开放状态通道变大。孔道变大的原因是M2螺旋沿着亚基的长轴旋转了15度。动作电位将几种离子通道活性整合配体-门控通道与离子门控通道如何联合作用产生一种精细的生理应答？回忆一下本节开头介绍的电势-门控通道，我们要引入一个概念，即平衡电位（equilibrium potential)。假定膜将两种溶液分开，而这两种溶液含有不同浓度的阳离子X+ (图12.29）。假定X+in是胞内X+的浓度，而X+out是胞外X+的浓度。设想离子通道开放允许X+跨膜移动，那会怎么样？很明显，X+会从浓度高的一侧（A）向浓度低的一侧转移（B）。如果有其它电荷的一种静电作用力阻止这种浓度差异驱动的离子移动存在，在某一时刻达到平衡状态。在平衡状态，可以用能斯特（Nernst equation)方程表述膜电位：Veq = -(RT/zF)ln(Xin/Xout) = -(2.303) (RT/zF)log10(Xin/Xout)其中R是气体常数，F是法拉利常数，z是离子X所带的电荷（如+1表示X+)。处于平衡状态的膜电位称为在特定的跨膜浓度比值时某一离子的平衡电位。例如，Na+胞内 = 14mM, Na+胞外 = 143mM, 在37的平衡电位是+62 mV。类似地，K+胞内 = 157 mM, K+胞外 = 4 mM, 平衡电位是 - 98 mV。没有刺激，神经元静止状态的膜电位是 - 60 mV。这个数值接近于K+的平衡电位，因为少量的K+离子通道处于开放状态。图13.29 平衡电位。当离子浓度梯度驱动离子移动的力与电荷形成的反作用力相等时，膜电位达到平衡。现在考虑产生动作电位时会出现什么情况（图13.30）。起先，相邻细胞释放神经递质如乙酰胆碱。这些乙酰胆碱与乙酰胆碱受体结合，离子通道开放时间不超过1毫秒。乙酰胆碱受体构成的离子通道对阳离子没有特异性