轮状病毒VP7 基因转化盐藻的研究.doc

轮状病毒VP7基因转化盐藻的研究 柴晓杰基金项目：辽宁省教育厅项目(2008T023)资助。*作者简介：柴晓杰（1963-），女，辽宁，教授，博士，研究方向：植物基因工程。TelE-mail： 王晓庆 张永攀 徐文琦 （大连海洋大学生命科学与技术学院，辽宁大连 116023）摘要：应用聚合酶链式反应技术（PCR）扩增了轮状病毒VP7基因，并将其克隆到pMD18-T vector载体上，对重组子进行PCR检测和限制性内切酶分析，并测定了DNA全序列。结果表明：克隆片段全长为981bp。将轮状病毒VP7基因克隆到植物表达载体pCAM2201启动子下游，构建了植物表达载体。并首次采用LiAc/PEG介导法将表达载体pCAMVP7导入盐藻细胞，获得了转基因盐藻。关键词：轮状病毒；PCR ；克隆；LiAc/PEG法；轮状病毒（rotavirus,RV）于1973年由澳大利亚学者R.F.Bishop发现，属呼肠孤病毒科，轮状病毒属。外衣壳由780个VP7和60个VP4二聚体构成的纤突(sprike) 组成，内衣壳由260个VP6 三聚体组成，里面芯髓由VP1、VP2 、VP3和11个双链RNA片段及与其结合的非结构蛋白（NSP1NSP6）组成1-3。外层衣壳VP7和VP4是其两种主要的中和性抗原，在诱导免疫保护中具有重要作用4。在动物模型中抗VP4和抗VP7抗体可分别独立地抵御轮状病毒感染。轮状病毒主要感染成熟的小肠绒毛上皮细胞，可引起新生儿发烧、呕吐和腹泻，严重的可导致脱水和体液紊乱。通常认为这种感染主要发生在小肠中，最近有资料显示，患儿也伴有抗原血症和病毒血症5，6。轮状病毒感染可引起多种幼龄畜禽及儿童腹泻,给社会带来了巨大损失，引起了人们的普遍关注和高度重视。目前世界上对轮状病毒感染没有有效治疗药物，使用疫苗进行预防成为唯一手段7。由于盐藻具有高度耐盐，可抗污染；无细胞壁，为天然原生质体，外源基因易导入；操作简便且其表达产物可完成翻译后加工；培养条件简单成本低；营养价值高且无毒无害等优点，盐藻是研究真核生物基因表达的理想生物和生产外源蛋白的高效生物反应器8,9。为此，我们克隆了轮状病毒VP7基因构建了植物表达载体，通过LiAc/PEG介导法成功地将外源基因导入盐藻细胞，为进一步利用盐藻作为生物反应器生产疫苗奠定了基础。1 材料与方法1.1 材料1.1.1藻种盐藻（Dunaliella salina）由本室保存。1.1.2 菌株和质粒菌株为E.coli DH5。pMD18-T vector购自TaKaRa公司，质粒pBI121VP7（作为PCR反应模板）、pCAMBIA2201由本室保存。1.1.3 酶及生化试剂Taq酶及限制性内切酶、溶菌酶、T4DNA连接酶、DNA MarkerDL-2000和DL-15000购自TaKaRa公司，其他试剂均为国产分析纯产品。1.1.4 引物PCR引物由TaKaRa公司合成。1.2 方法1.2.1 PCR扩增人工合成引物为：P1：5CGGCTCGAGATGTATGGTATTGAAT 3（XhoI 酶切位点）；P2：5CGGCTCGAGCTATACTCTATAATAAAACG 3（XhoI酶切位点）；在50L的反应体系中,dNTP 4.0 L,引物各50 pmol/L,模板DNA 0.1g, Taq酶0.5 L（2.5U）,10Buffer 5.0 L,MgCl2 4.0 L,以ddH2O补足50 L 。PCR扩增条件为：94预变性5 min；94变性30s，55复性30s，72延伸2 min，30个循环；72延伸10 min。1.2.2 PCR产物的克隆、鉴定及序列分析将PCR产物回收后，按3:1比例与克隆载体pMD18-T vector连接。将连接产物转入大肠杆菌DH5,并在附加100g/ml的氨苄青霉素的LB固体培养基上选择培养。挑取白斑用碱裂解法提取质粒DNA，用限制性内切酶酶切鉴定，得到重组克隆pMDTVP7，其中插入约1Kb的目的基因。序列测定由大连TaKaRa公司完成。1.2.3 表达载体pCAMVP7的构建将含有目的基因的重组质粒（pMDTVP7）和pCAMBIA2201经XhoI单酶切，回收VP7基因片段和载体大片段。载体大片段去磷酸化后与VP7基因片段用T4连接酶4连接过夜，得到重组质粒pCAMVP7。转化大肠杆菌DH5，在含100g/ml的卡那霉素的LB固体培养基上筛选重组子。提取阳性克隆的质粒，经PCR检测和酶切鉴定，得到重组克隆。1.2.4 目的基因的转化将构建的表达质粒转化E.coli DH5的感受态细胞中，采用改良的碱裂解法大量提取质粒，制备浓度为600g/mLDNA导入液。盐藻细胞采用105个/mL接种量（培养条件：25，1250lx光强，12h光照/12h黑暗交替静置培养）培养；取10mL对数生长早期的藻液4000rpm离心10min，将沉淀悬浮于TE缓冲液中，取悬浮液和LiAc混合再加入10 L质粒DNA在恒温水浴中保温30min；加入70% PEG4000 29保温1h；加1.5mL无菌海水 4000rpm离心10min；将沉淀悬浮于20mL培养液中于26中孵育48h。同时用无菌水按同样处理做对照。1.2.5 转基因盐藻的PCR检测取转基因盐藻，用改良的CTAB法提取DNA。按目的基因序列设计引物：P 3 ：5 gtattatccaactgaagcaagcactc3；P 4 ：5tccacttatttgattctcccgattg 3，设计的引物理论上可以扩增出305bp的条带。用标准的反应体系。扩增条件为：94 预变性10 min；94 变性1 min、53 退火30 s、72 延伸2min，共35个循环；最后72 延伸10 min。2 结果与分析2.1 PCR扩增产物的克隆及筛选 PCR扩增产物在1.0%琼脂糖凝胶上电泳，得到约1Kb，特异性强，单一的扩增带。（图1）结果与预期一致。扩增产物回收后与载体连接转化到大肠杆菌DH5中,筛选出10个阳性克隆，经PCR检测和酶切鉴定，得到一条约1Kb的插入片段，说明该目的基因插入在载体上，其片段大小与预期一致（图2）。 图1 PCR产物的电泳分析 图2 重组克隆的酶切鉴定Fig.1 Electrophoresis of PCR product Fig.2 Restriction enzyme analysisMDNA Marker DL-2000； of the recombinant clone1,2,3PCR products； MDNA Marker DL-2000；4Water control 1,2Digestion of plasmid pMDTVP7 by XhoI2.2 DNA序列分析经过DNA全自动测序仪，测定得到的序列为981bp的目的片段与已发表(Genbank: AF260949.1）的人源97SH19外壳蛋白基因序列的开放阅读框比对，有7个碱基的差异，同源性达到99.29 %（图3）。1 atgtatggta ttgaatatac cacaattcta atctttctga tatcaatcat tctactcaac tatatattaa aatcagtgac ccgaataatg 91 gactacatta tatatagatt tttgttgatt tctgtagcat tatttgcctt aactaaagct cagaactatg gacttaatat accaataaca 181ggatcaatgg atactgtata ttccaactct actcaagaag gagtatttct aacatccaca ttatgtttgt attatccaac 261tgaagcaagc actcaaatca gtgatggtga atggaaagac tcattatcac aaatgtttct tacaaaaggt tggccaacag 341gatcaatcta ttttaaagag tactcaaata ttgttgattt ttccgttgac ccacaattat attgtgatta cagcttagta ctaatgaagt 431atgatcaaaa tcttgaatta gatatgtcag aattagctg atttgatattg aatgaatggt tatgtaatcc aatggatata acattatatt 521attatcaaca atcgggagaa tcaaataagt ggatatcaat gggatcatca tgtactgtga aagtgtgtcc actgaataca 601caaacgttag gaataggttg tcaaacaacg aatgtagatt catttgaaac agttgctgag aatgaaaaat tagttatagt 681ggatgtcgtt gatgggataa atcataaaat aaatttgaca actacgacat gtactattcg aaattgtaag aagttaggtc 761caagagagaa tgtggctgta atacaagttg gtggctctaa tgtgttagac ataacagcgg atccaacgac taatccacaa 841attgagagaa tgatgagagt gaattggaaa agatggtggc aagtattcta tactatagta gattatatta atcagattgt 921acaggtaatg tccaaaagat caagatcatt aaattctgct gcgttttatt atagagtata g 图3 目的片段的核苷酸序列Fig.3 Nucleotide sequence of purpose gene2.3 表达载体pCAMVP7的构建由于载体片段比较大，造成连接效率比较低。并且正常的16连接无法获得重组菌，我们在4下连接筛选出3个重组克隆，结果仅有一个菌斑与预期相符。PCR扩增的目的片段与XhoI酶切片段均为981bp，而BamH I酶切片段为1871bp，证明连接方向正确（如图4）。 图4 阳性克隆酶切鉴定 图5转基因盐藻的PCR检测Fig.4 Enzyme analysis for the Fig.5 PCR analysis of transgenic cellsrecombinant clone 1,2. Transgenic cell M.DNA MarKer DL-15000 3. untransformed cell1. Products of PCR 4. Positive control 2. Digestion of plasmid pCAMVP7 by XhoI 3. Digestion of plasmid pCAMVP7 by BamH I2.4 转基因盐藻的检测采用用LiAc介导法在最佳转化条件下（对数生长早期的盐藻、转化温度29、质粒DNA的浓度600g/mL）将质粒pCAMVP7转入盐藻细胞，经氯霉素筛选10代后，取转基因盐藻提取基因组DNA,用特异引物进行PCR扩增，同时作阴阳对照。结果转基因盐藻得到约300bp的特异性扩增条带，而未转化的盐藻中无该片段的产生。扩增片段大小与阳性对照一致(图5)。说明目的基因可能已经整合到盐藻基因组中。3 讨论轮状病毒感染是一个全球性的公共问题，改变卫生条件对轮状病毒的预防并不十分有效，而且目前对轮状病毒感染尚无特效药，也无理想的疫苗。VP7作为轮状病毒一主要保护性抗原，在疫苗研究中具重要意义。本研究根据已发表的序列设计1对引物，采用优化的PCR体系扩增出轮状病毒VP7基因，序列测定结果表明，该基因片段全长981bp，与人源VP7基因序列同源性为99.29%。为了构建一个高效的表达载体，首先将植物表达载体pCAMBIA2201用XhoI单酶切，回收了约11Kb的大片段，为了防止其自连对其进行去磷酸化处理，然后与目的基因连接。一般情况下，目的基因和载体片段的摩尔比为310。但是经过多次连接并未成功，而摩尔比为20时连接成功。这可能是由于pCAMBIA2201载体片段比较大，且为单酶切，即使载体片段去磷酸化以后，连接体系中的目的片段也会发生自连，导致目的基因片段的有效浓度降低，因此适当加大目的基因的浓度对连接比较有利。另外，T4 DNA Ligase通常连接温度为16，而本实验获得成功的重组子是在4下完成的，可能较低的连接温度对大片段的连接比较有利。将构建的重组质粒转化盐藻目的是利用其作为生物反应器生产疫苗。目前，用于盐藻遗传转化的方法有基因枪法10、电击法11、玻璃珠法12等。基因枪法和电击法需要昂贵的仪器设备、操作繁琐、试验耗材成本高且转化率较低；玻璃珠法成本低、操作简便、有良好的转化率，但藻细胞的存活率较低。我们首次采用LiAc/PEG法（专利公开号：101717781A）将VP7基因成功地导入盐藻细胞，并对转化条件进行了优化。该转化方法的建立，为利用盐藻作为生物反应器生产药物蛋白和疫苗奠定了基础，同时也为藻类的遗传转化提供了一条新途径。参考文献1Pesavento JB，Billingsley AM，Roberts EJ，et alStructures of rotavirus reassortants demonstrate correlation of altered conformation of the VP4 spike and expression of unexpected VP4-assoeiated phenotypes.J Virol,2003,77(5)：329l32962Khamrin P, Maneekarn N, Peerakome S , et alNovel porcine rotavirus of genotype P27shares new phylogenetic lineage with G2 porcine rotavirus strain. 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