酶水解大豆多肽研究进展.doc

食品酶学课 程 论 文题目：酶水解大豆多肽的研究进展组员：指导教师：高向阳 副教授学 院 名 称：食品学院 专 业 名 称：食品科学与安全 二零一四年六月三酶水解大豆多肽研究进展摘要：大豆多肽是大豆蛋白经水解所得的低聚肽混合物,其生产方式多种多样,其中酶法生产大豆多肽以其特有的优势得到了广泛的关注.本文综述了水解大豆复合酶的分类、方法、研究进展及应用。关键词：大豆多肽 酶水解 三酶复合 双酶复合前 言关于酶法制备大豆多肽中酶的选择，在制备过程，正确选择和使用蛋白酶是关键。通常，可选用胰蛋白酶、胃蛋白酶等动物蛋白酶，也可使用菠萝和木瓜等植物蛋白酶，但目前应用较广主要是枯草杆菌1389、放线菌166、栖土曲霉3942、黑曲霉3350和地衣型芽孢杆菌2709等微生物蛋白酶。目前酶水解大豆多肽主要有三种方式，一是单酶水解，二是双酶复合水解，三是三酶水解。单酶水解本身存在一定的缺陷，水解大豆多肽的效果未必能达到最优，于是引入了双酶复合水解，解决水解效率问题的同时解决单酶水解可能产生副产品或气味不佳的问题。另外，三酶复合能更大程度地优化水解效率。1 蛋白酶1.1 动物蛋白酶来源于动物的蛋白酶一般是从动物的内脏中提取的，如胃蛋白酶主要采用联产工艺，将提取胃膜素留下的母液，经过一步处理提取出胃蛋白酶。可以说动物蛋白酶来源有限，加之提取工艺相对复杂，故价格一般比较高。例如，北京拜尔迪生技术有限公司销售的美国Sigma 公司生产的1 10 000的胃蛋白酶价格为16 元/g , 美国Amresco公司生产的Try psin 的胰蛋白酶( 2 500U/mg)的价格则高达375 元/g。如此高的价格无疑限制了动物蛋白酶在大豆多肽工业生产上的应用。1.2 植物蛋白酶植物蛋白酶的原料比较丰富，从一些植物的成熟果实中就可以提取植物蛋白酶，生产工艺相对简单，价格低，例如北京拜尔迪生物技术有限公司销售的美国Sigma 公司生产的papain 木瓜蛋白酶(2 U/mg)的价格为12 元/g；国产的就更便宜，如北京玉林迈得生物技术有限公司销售的国产木瓜蛋白酶(300 U/mg)售价仅为6 元/g。经过对酶的价格、酶解工艺条件及酶解产品特性的对比分析可发现，以微生物蛋白酶作为酶源是最为合适的。因为，以微生物蛋白酶作为酶源具有很多的优越性，如微生物种类繁多(自然界中存在的所有酶都可以在微生物中找到)、酶产量高(可通过人为改变微生物培养条件，加大目的酶的产量)、生长周期短(一般微生物的生长速度是农作物的500 倍，家畜的100 倍)、生产成本低(培养基原料大都比较廉价, 如麸皮、米糠、豆饼等)、生产易管理(目前多位自控发酵罐可根据需要随时改变培养条件),还可通过生物技术进行定向改造从而得到原本不能得到的酶或有特定效用的酶, 随着固定化酶技术的完善，微生物蛋白酶的应用成本必将得到进一步的降低，而水解效率则会得到大大的提升。2 单酶水解2.1单酶水解：Alcalase碱性蛋白酶工艺参数：为温度60、pH8.0、底物浓度8.38%、酶与底物浓度比4.5%、水解时间150 min 。根据孙旸、陈光、刘艳秋在Alcalase碱性蛋白酶水解大豆分离蛋白的研究一文中的讨论，试验研究了以Alcalase碱性蛋白酶水解大豆分离蛋白制备大豆肽的工艺,分析了温度、pH值、底物浓度、酶与底物浓度比和时间等单因素对酶水解的影响。继而选择底物浓度(X1)、酶与底物比(X2)、水解时间(X3)作为影响目标函数水解度(Y)的决策变量,进一步讨论它们对水解的影响、三者之间的关系和最佳组合。选择底物浓度为8%12%、酶用量为底物用量的2.5%4.5%、时间为90150 min,进行三因素十水平均匀试验。得到的结果为：底物浓度为8.38%,酶浓度为4.5%,反应时间为150 min,按照拟和方程优化参数后,预测水解度可达0.22313,按优化参数进行水解,试验水解度为0.220 221（22.02%）。2 双酶复合法2.1中性蛋白酶与菠萝蛋白酶中性蛋白酶与菠萝蛋白酶比例为31 、pH 7 .0、底物浓度4 .0 %、酶解时间9 h ;最佳脱色处理条件:粉末活性炭用量2 .0 %、温度50 、pH 3 .0、吸附时间3 h ;超滤分离条件:NF-1 纳滤膜、截留分子量2000 D、超滤压力1 .0 mPa。采用两种蛋白酶AS1 .398 和Alcalase 水解大豆分离蛋白制得水解度为10 % 24 %的大豆多肽.结果显示:在等电点沉淀分离多肽时, 相同水解度下,Alcalase 酶水解产物的水解得率比AS1 .398 酶水解产物的水解得率高20 %.采用DA201-C 大孔吸附树脂对水解液进行脱盐, 得到了优化的吸附和解吸的条件.该条件下大孔吸附树脂对水解液的吸附率为89 .71 %, 解吸率为72 .30 %。中性蛋白酶AS1 .398 是由枯草芽孢杆菌经深层发酵制得, 作用的肽键具有广泛的专一性, 碱性蛋白酶Alcalase 是由地衣芽孢杆菌生产而得, 该酶的主要有效成分是一种内切酶。2.2 Protamex酶与Flvaourzyme复合风味蛋白酶Portamxe酶能够有效的水解大豆蛋白,水解的最优条件pH值为6.5,温度40,水解时间1h，底物浓度14%，酶与底物比4.5%，水解度可达到DH39.79%。Portamex酶水解液清澈透明，仅有少量沉淀，但水解液较苦，不宜直接用于食品中。改进方法是加入Flvaourzyme复合风味蛋白酶，成为三酶复合法水解大豆多肽，能够有效地将疏水性氨基酸从大豆多肽端基切除，降低大豆多肽的苦味，水解过程中水解液pH变化很小，但氨基氮含量显著提高。本试验Flvaourzyme酶的水解条件为:pH7.0，温度50，时间5h，其用量为大豆分离蛋白的2%。采用上述双酶分步水解的方式生产的大豆多肽具有水解度高、澄清透明、低苦味、酸性条件下不沉淀的特点,在食品工业中将会有广阔的应用前景。3 三酶复合法中性蛋白酶、木瓜蛋白酶和菠萝蛋白酶的复合比例为1：2：2，工艺参数是底物浓度4 %，pH 7.0，酶解时间9 h为最佳。根据周利亘、陈新峰、王君虹、袁亚等人在大豆多肽复合酶解工艺条件研究一文中的研究，可知当中性蛋白酶、木瓜蛋白酶和菠萝蛋白酶三者的复合使用且比例为1:2:2，条件为底物浓度4 %，pH 7.0，酶解时间9 h时水解度DH达到84.40%。而其他双酶复配都没有达到更好的效果。（1）木瓜蛋白酶与菠萝蛋白酶两者复合使用且比例为1：1，条件为底物浓度4%，pH6.5，酶解时间9h时水解度DH达到47.16%,；（2）中性蛋白酶和木瓜蛋白酶两者复合使用且比例为3：1，条件为底物浓度4%，pH7.5，酶解时间9h时水解度DH达到43.49%；（3）中性蛋白酶和菠萝蛋白酶两者复合使用且比例为3：1，条件为底物浓度4%，pH7.0，酶解时间9h时水解度DH达到63.64%；对比以上数据可知，当中性蛋白酶、木瓜蛋白酶和菠萝蛋白酶三者复合使用时会有最大的水解度。4 复合蛋白酶对水解大豆蛋白的优势大豆肽的生理功能和理化性质与其分子质量有关，低分子质量寡肽具有更好的生理功能和理化特性，提高SPI的水解度可以获得分子质量较低的大豆寡肽。目前，用于生产大豆寡肽的酶很多，包括碱性蛋白酶、中性蛋白酶、酸性蛋白酶与风味蛋白酶等微生物来源的酶，木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶等植物蛋白酶和胰蛋白酶等动物蛋白酶；其中以碱性蛋白酶、风味蛋白酶、木瓜蛋白酶和中性蛋白酶应用最多。单独一种蛋白酶很难实现对SPI的深度水解，这是因为蛋白酶的酶切位点具有专一性，一种蛋白酶只能切断特定类型的几种肽键。同时或依次采用几种不同的蛋白酶对SPI进行复合水解，可提高水解度，降低大豆寡肽的分子质量，其中碱性蛋白酶与中性蛋白、碱性蛋白酶与木瓜蛋白酶、木瓜蛋白酶与碱性蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶与碱性蛋白酶等多酶组合均取得了较满意的水解效果。在梁秋丽等人的高水解度大豆寡肽专用复合酶的配方优化中，系统比较几种常用蛋白酶及其不同配伍对SPI的酶解能力，确定大豆寡肽专用复合酶的最佳酶组成。而刘静等人在蛋白酶联合水解大豆蛋白制备小分子肽的研究中，探究了双酶水解对大豆蛋白水解度的影响。分别为木瓜蛋白酶和中性蛋白酶。两种蛋白酶联合水解, 增加了蛋白质催化位点,有效地将大豆蛋白分解成相对分子质量低的小分子大豆肽，水解效果明显优于