原核细胞表达纯化实验设计.doc

原核生物分离纯化实验设计将克隆化基因插入合适载体后导入大肠杆菌用于表达大量蛋白质的方法一般称为原核表达。这种方法在蛋白纯化、定位及功能分析等方面都有应用。大肠杆菌用于表达重组蛋白有以下特点：易于生长和控制；用于细菌培养的材料不及哺乳动物细胞系统的材料昂贵；有各种各样的大肠杆菌菌株及与之匹配的具各种特性的质粒可供选择。但是，在大肠杆菌中表达的蛋白由于缺少修饰和糖基化、磷酸化等翻译后加工，常形成包涵体而影响表达蛋白的生物学活性及构象。表达载体在基因工程中具有十分重要的作用，原核表达载体通常为质粒，典型的表达载体应具有以下几种元件：（1）选择标志的编码序列；（2）可控转录的启动子；（3）转录调控序列(转录终止子，核糖体结合位点)；（4）一个多限制酶切位点接头；（5）宿主体内自主复制的序列。原核表达一般程序如下：获得目的基因准备表达载体将目的基因插入表达载体中（测序验证）转化表达宿主菌诱导靶蛋白的表达表达蛋白的分析扩增、纯化、进一步检测操作步骤（一）获得目的基因1、通过PCR方法：以含目的基因的克隆质粒为模板，按基因序列设计一对引物（在上游和下游引物分别引入不同的酶切位点），PCR循环获得所需基因片段。2、通过RT-PCR方法：用TRIzol法从细胞或组织中提取总RNA，以mRNA为模板，逆转录形成cDNA第一链，以逆转录产物为模板进行PCR循环获得产物。（二）构建重组表达载体1、载体酶切：将表达质粒用限制性内切酶（同引物的酶切位点）进行双酶切，酶切产物行琼脂糖电泳后，用胶回收Kit或冻融法回收载体大片段。2、PCR产物双酶切后回收，在T4DNA连接酶作用下连接入载体。（三） 获得含重组表达质粒的表达菌种1、 将连接产物转化大肠杆菌BL21，根据重组载体的标志（抗Ampr）作筛选，挑取单克隆，碱裂解法小量抽提质粒，双酶切初步鉴定。2、 测序验证目的基因的插入方向及阅读框架均正确,进入下步操作。否则应筛选更多克隆，重复亚克隆或亚克隆至不同酶切位点。3、 以此重组质粒DNA转化表达宿主菌的感受态细胞。（四）诱导表达1、 挑取含重组质粒的菌体涂板，挑单克隆至5ml LB（含Amp50g/ml）中37过夜培养。2、按150比例稀释过夜菌，一般将1ml菌加入到含50mlLB培养基的300ml培养瓶中, 37震荡培养至OD6000.4-1.0（最好0.6，大约需3hr）。3、取部分液体作为未诱导的对照组,余下的加入IPTG诱导剂至终浓度0.4mM作为实验组,两组继续37震荡培养3hr。4、收菌，离心12000g30s收获沉淀，每毫升菌液按50ulPBS重悬，加入1%TritonX-100（v/v）,-巯基乙醇（v/v）。PMSF（终浓度1mM）； 一下步骤在冰上操作：5、 超声破碎菌体，15000g，10min离心取上清，在上清中加入适量GST-beads，轻轻晃动令其吸附蛋白1h。6、 2000g，3min离心弃上清；7、 加入至少10倍体积的PBS，轻摇至beads悬浮于溶液中，2000g，3min离心弃上清；8、 重复步骤7两次；9、 加入1mlGST Elution Buffer,轻摇10min；10、 2000g，3min离心，收集上清；重复步骤8-9至少两次；11、 SDS-PAGE电泳检测蛋白纯度注：SDS是一种已知的能够使蛋白质变性的去污剂。它用于确定蛋白分子量的聚丙烯酰胺凝胶电泳。它也可以用于核酸抽提操作中破坏细胞壁及裂解核酸：蛋白复合物。在较高温度下，破坏蛋白质与DNA的结合，使DNA释放出来。在乳液聚合反应中，可充当两相溶液的乳化剂。三 、注意事项1、选择表达载体时，要根据所表达蛋白的最终应用考虑。如为方便纯化，可选择融合表达；如为获得天然蛋白，可选择非融合表达。2、融合表达时在选择外源DNA同载体分子连接反应时，对转录和转译过程中密码结构的阅读不能发生干扰。-表达蛋白的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析一、原理细菌体中含有大量蛋白质，具有不同的电荷和分子量。强阴离子去污剂SDS与某一还原剂并用，通过加热使蛋白质解离，大量的SDS结合蛋白质，使其带相同密度的负电荷，在聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）上，不同蛋白质的迁移率仅取决于分子量。采用考马斯亮兰快速染色，可及时观察电泳分离效果。因而根据预计表达蛋白的分子量，可筛选阳性表达的重组体。二、试剂准备1、30%储备胶溶液：丙烯酰胺（Acr）29.0g，亚甲双丙烯酰胺（Bis）1.0g，混匀后加ddH2O，37溶解,定容至100ml, 棕色瓶存于室温。2、1.5M Tris-HCl(pH 8.0)：Tris 18.17g加ddH2O溶解, 浓盐酸调pH至8.0,定容至100ml。3、1M Tris-HCl(pH 6.8)：Tris 12.11 g加ddH2O溶解, 浓盐酸调pH至6.8,定容至100ml。4、10% SDS：电泳级SDS 10.0 g加ddH2O 68助溶,浓盐酸调至pH 7.2,定容至100ml。5、10电泳缓冲液(pH 8.3)：Tris 3.02 g，甘氨酸 18.8 g，10% SDS 10ml加ddH2O溶解, 定容至100ml。6、10%过硫酸铵（AP）： 1gAP加ddH2O至10ml。7、2SDS电泳上样缓冲液：1M Tris-HCl (pH 6.8)2.5ml，b-巯基乙醇1.0ml，SDS 0.6 g，甘油 2.0ml，0.1%溴酚兰 1.0ml，ddH2O 3.5ml。8、考马斯亮兰染色液：考马斯亮兰 0.25 g，甲醇225ml，冰醋酸 46ml，ddH2O 225ml。9、脱色液:甲醇、冰醋酸、ddH2O以316配制而成。二、操作步骤采用垂直式电泳槽装置（一）聚丙烯酰胺凝胶的配制1、 分离胶(10%)的配制:ddH2O 4.0ml30%储备胶 3.3ml1.5M Tris-HCl 2.5ml10% SDS 0.1ml10% AP 0.1ml取1ml上述混合液,加TEMED(N,N,N,N-四甲基乙二胺)10l封底,余加TEMED 4l ,混匀后灌入玻璃板间，以水封顶，注意使液面平。（凝胶完全聚合需30-60min）2、 积层胶（4%）的配制：ddH2O 1.4 ml30%储备胶 0.33 ml1M Tris-HCl 0.25 ml10%SDS 0.02 ml10%AP 0.02 mlTEMED 2 l将分离胶上的水倒去,加入上述混合液,立即将梳子插入玻璃板间，完全聚合需15-30min。（二）样品处理：将样品加入等量的2SDS上样缓冲液，100加热3-5min，离心12000g1min，取上清作SDS-PAGE分析，同时将SDS低分子量蛋白标准品作平行处理。（三）上样: 取10l诱导与未诱导的处理后的样品加入样品池中,并加入20l低分子量蛋白标准品作对照。（三） 电泳:在电泳槽中加入1电泳缓冲液，连接电源，负极在上，正极在下，电泳时，积层胶电压60V,分离胶电压100V,电泳至溴酚兰行至电泳槽下端停止（约需3hr）。（四） 染色:将胶从玻璃板中取出，考马斯亮兰染色液染色，室温4-6hr。（五） 脱色:将胶从染色液中取出,放入脱色液中,多次脱色至蛋白带清晰。（六） 凝胶摄像和保存：在图像处理系统下将脱色好