植物组织培养3894549634.doc

第0章一、植物组织培养概念是指用无菌方法使植物体的离体（in vitro）器官、组织和细胞在人为提供的条件下生长和发育的所有培养技术的总称，也称之为离体培养（In vitro culture）或试管培养。器官（organ)：根、茎、叶、花、果实、种子组织（tissue)：花药、胚珠、胚、胚乳、形成层等二、植物组织培养的理论基础1、细胞全能性（cell totipotency）：植物体的每一个具有完整细胞核的细胞都具有该物种全部遗传的物质，在一定条件下具有发育成完整植物体的潜在能力。原理：生物体的每一个细胞都包含有该物种所特有的全套遗传物质，都有发育成为完整个体所必需的全部基因，从理论上讲，生物体的每一个活细胞都应该具有全能性。差异：（1） 受精卵的全能性最高； （2） 受精卵分化后的细胞中，体细胞的全能性比生殖细胞的低。2、植物细胞全能性的表达一个细胞一旦沿着某一条特定的途径分化发育后，一般不会再回复到未分化状态，但在组织培养条件下，可能发生脱分化和再分化。脱分化（dedifferentiation)：将已分化的不分裂的静止细胞，放在培养基上培养后，细胞重新进入分裂状态。一个成熟的细胞转变为分生状态的过程叫脱分化。再分化（redifferentiation)：经脱分化的组织或细胞在一定的培养条件下可转变为各种不同的细胞类型，形成完整植株的过程。外植体（explant）：由活体植物体上切取下来的，用于组织培养的各种接种材料。包括各种器官、组织、细胞或原生质体等。愈伤组织（callus）：在人工培养基上由外植体上形成的一团无序生长状态的薄壁细胞。4、植物生长调节物质又称植物激素，对于植物组织的分化和决定具有关键性作用。 (生长素类 细胞分裂素类 赤霉素 脱落酸 乙烯)生长素类 主要用于愈伤组织的形成，体细胞胚的产生及试管苗的生根。常用的有2,4-D、NAA、IBA、IAA等。其作用强弱为2,4-DNAAIBAIAA。细胞分裂素类 促进细胞的分裂与分化，延迟组织的衰老，促进芽的产生等作用。常用的有KT、6-BA、ZT等作用强弱顺序为：KT6-BAZT。 赤霉素 促进已分化的芽伸长生长，打破种子休眠的作用。常用的为GA3 三、组织培养植株再生的途径1、体细胞胚胎发生途径（胚状体发生途径）是指在组织培养中起源于一个非合子细胞，经过胚胎发生和胚胎发育过程，形成具有双极性的胚状结构，而发育成再生植株的途径。双子叶植物胚胎发生：合子原胚球形胚心型胚鱼雷胚子叶胚单子叶植物胚胎发生：合子原胚球形胚盾型胚子叶胚体细胞胚胎发生与合子胚发生阶段类似，但体胚形成由体细胞（或小孢子等性细胞）形成。四、植物组织培养的类型1、按培养材料分为（Gamborg等）愈伤组织培养 最为常见的组织培养器官培养 胚、胚乳、珠心、子房、根、茎、叶、花和幼果的部分组织的培养细胞培养悬浮细胞培养 植株培养完整植株材料的培养，如幼苗 原生质体培养除去细胞壁的原生质体 愈伤组织培养 将外植体接种在人工培养基上，由于植物生长调节剂的存在，而其细胞脱分化形成愈伤组织，然后通过再分化形成再生植株。它是最为常见的。 器官培养 将植物的器官如胚、胚乳、珠心、子房、根、茎、叶、花和幼果的部分组织接种在无菌培养基上进行培养。细胞和原生质体培养细胞培养是将植物的单个细胞分离出来，并进行培养;原生质体培养是指将植物细胞的细胞壁通过机械、物理或化学的方法去除，然后再进行培养。2、根据培养器官的不同：叶培养、根培养、花药培养、胚珠培养、茎尖培养等3、根据培养方式不同固体培养：将培养物放在含有琼脂等固化剂的培养基表面进行培养。常用的方法。该方法简单易行，但养分分布不均，生长速度不均衡，并常有褐化中毒现象发生。液体培养法：将培养物放在未加固化剂的培养基内培养，一般需进行震荡，又称液体震荡培养。由于液体中氧气含量较少，常用振动培养的方法以确保氧气的供给。往复式摇床或旋转式摇床进行培养，既能使培养基均一，又能保证氧气的供给。4、根据培养过程初代培养（Primary culture）：指外植体的最初培养。继代培养（Subculture）：将初代培养得到的培养体移植于新鲜培养基中这种反复多次移植的培养，称为继代培养。5、 根据培养物量的多少 大量培养、微量培养。6、根据培养过程中是否需光： 光培养、暗培养7、根据培养方法的不同： 看护培养、微室培养、悬浮培养五、植物组织培养的特点 1、培养条件可以人为控制2、生长周期短，繁殖率高3、管理方便，利于工厂化生产和自动化控制组织培养技术在农业生产上的应用：快速繁殖优良苗木；获得脱毒苗；育种上应用；工厂化育苗。第一章 植物组织培养实验室的构建和操作技术 一、实验室组成组织培养实验室布局的总体要求：便于隔离 便于操作 便于灭菌 便于观察植物培养技术：灭菌、接种、培养和驯化四个环节。洗涤技术灭菌技术消毒:是指杀死、消除或充分抑制部分微生物，使之不再发生危害作用。灭菌:是指用物理或化学的方法，杀死物体表面和孔隙内的一切微生物或生物体，即把所有生命的物质全部杀死。物理方法：化学方法：熏蒸剂:甲醛和高锰酸钾。培养基(culture medium) ：是植物组织培养的重要基质。在离体培养条件下，不同种植物的组织对营养有不同的要求，甚至同一种植物不同部位的组织对营养的要求也不相同。没有一种培养基能够适合一切类型的植物组织或器官，在建立一项新的培养系统时，首先必须找到一合适的培养基，培养才有可能成功。（一）培养基的种类1、根据态相不同：固体培养基、液体培养基2、根据培养物培养过程：初代培养基、继代培养基3、根据作用不同：诱导培养基、增殖培养基、生根培养基4、根据营养水平：基本培养基、完全培养基、改良培养基。初代培养基：指用来第一次接种外植体的培养基。继代培养基：指用来接种继初代培养之后的培养物的培养基 。若只含有大量元素与微量元素和碳水化合物的培养基，称为基本培养基。在基本培养基的基础上，添加各种各样的生长调节物质和其他有机附加物的培养基叫完全培养基。（二）常用的培养基及特点1、MS培养基：它是1962年由Murashige和Skoog为培养烟草细胞而设计的。是目前应用最广泛的培养基。特点：无机盐和离子浓度较高，为较稳定的平衡溶液。其养分的数量和比例较合适，可满足植物的营养和生理需要。它的硝酸盐含量较其他培养基为高，广泛地用于植物的器官、花药、细胞和原生质体培养，效果良好。 2、White培养基：1943年由White为培养番茄根尖而设计的。1963年又作了改良，称作White改良培养基，提高了MgSO4：的浓度和增加了硼素。 特点：无机盐浓度较低，适于生根培养。3、N6培养基：1974年朱至清等为水稻等禾谷类作物花药培养而设计的。特点：是成分较简单，KNO3和（NH4）2SO4含量高，不含钼。在国内已广泛应用于小麦、水稻及其他植物的花粉和花药培养。4、B5培养基:是1968年由Galmborg等为培养大豆根细胞而设计的。从实践得知双子叶植物特别是木本植物在B5培养基上生长更适宜。特点：是含有较低的铵盐，较高的硝酸盐和盐酸硫胺素。5、KM8P培养基:它是1974年为原生质体培养而设计的。特点：是有机成分较复杂，它包括了所有的单糖和维生素。四、 培养基的配制 （一）、母液(stock solution)的配制和保存母液是欲配制液的浓缩液。意义:保证各物质成分的准确性配制时的快速移取便于低温保藏。一般母液配成比所需浓度高10-100倍。母液配制时可分别配成大量元素、微量元素、铁盐、有机物和激素类等。（一）母液的配制方法单配法：将培养基配方中的各种成分分别配成一定浓度的母液。一般用mg/ml 或mg/L表示。混配法：将几类营养成分按配方中的用量扩大一定倍数称量，分别溶解后再混合成母液。配制生长素类：可先用少量0.1N的NaOH或95%酒精助溶。浓度为：1-5mgml。配制细胞分裂素类：一般先用少量0.5-1N盐酸加热溶解。浓度为：1-5mgml。（一）接种无菌操作定义:把经表面灭菌处理后植物材料，切碎或分离出器官、组织、细胞，再经无菌操作转接到无菌培养基上，这一过程叫做接种。接种程序：植物材料表面的消毒；切割外植体；将外植体移人培养基。（二） 外植体培养外植体培养：指把培养材料放在培养室里，使之生长，分裂和分化形成愈伤组织或进一步分化成再生植株的过程。 外植体成苗途径：胚状体的产生途径：(1) 直接从器官上发生(2) 从愈伤组织发 (3) 从游离的单细胞发生 (4) 从小孢子发生诱导胚状体比诱导芽的优点：(1)数量多(2)速度快(3)结构完整第二章 愈伤组织培养愈伤组织培养(callus culture)定义: 是指将外植体接种到人工培养基上，在激素作用下，进行愈伤组织诱导、生长和分化的培养过程。第一节 愈伤组织的诱导和分化 一、 愈伤组织的诱导诱导愈伤组织的关键主要是培养条件，其中激素的成分和浓度是最重要的因素。理论基础：细胞具有全能性，每个细胞都具有全套的遗传信息，在特定环境下能进行表达，产生一个独立完整的个体。 特点：愈伤组织的诱导就是使已分化的植物细胞脱离原来的发育轨道，失去原有状态和功能，恢复到未分化的状态的过程。一般双子叶植物比单子叶植物及裸子植物组织容易形成愈伤组织。幼年组织细胞比成年组织容易，二倍体比单倍体容易。外植体可选用植物茎、根、叶、花、种子的切段。培养过程中植物生长调节剂是重要的成分，一般要在培养基中添加2，4-D、NAA、IAA、IBA、BA等。有些天然物也对愈伤的诱导和维持十分有益如椰子汁、酵母提取物、蕃茄汁等。二愈伤组织的分化从外植体脱分化形成典型的愈伤组织大致可分为三个时期：诱导期：细胞准备进行分裂的时期，是愈伤组织形成起点。诱导期细胞内发生的变化气体交换增加，如氧气的吸收增加RNA含量增加（增加到300%）蛋白质量增加（每个细胞的总增加量为200%）酶活性增强分裂期：指外植体细胞经诱导脱分化，不断分裂、增生子细胞的过程。分裂期细胞的主要表现1.细胞的数目迅速增加。2.每个细胞平均鲜重下降。3.细胞体积小，内无液泡。4.细胞的核和核仁增大到最大。5.细胞中RNA含量减少，而DNA含量保持不变。6.随着细胞不断分裂和生长，细胞总干重、蛋白质和核酸量大大增加，新细胞壁合成极快。分裂期愈伤组织的共同特征：细胞分裂快，结构疏松，缺少有组织的结构，维持其不分化的状态，颜色浅而透明。 来源于不同植物或同一种植物不同部位的愈伤组织，在颜色、结构和生长习性上都可能存在差异。但优良的愈伤组织必备以下4个特性中的2-3个。 1、高度的胚性或再分化能力，以便从这些愈伤组织得到再生植物。2、容易散碎，以便用这些愈伤组织建立优良的悬浮系，并且在需要时能从中分离出全能性的原生质体。3、旺盛的自我增殖能力，以便用这些愈伤组织建立大规模的愈伤组织无性系。4、经过长期继代保存而不丧失胚性，便有可能对它们进行各种遗传操作。分化期：指愈伤组织细胞停止分裂，细胞内发生一系列形态和生理上的变化，形成一些不同形态和功能的细胞的时期。分化期细胞特点：1.细胞分裂部位和方向发生改变：2.形成瘤状或片状的分生组织结节或维管组织结节。3.细胞的体积相对稳定，不再减少。4.出现了各种类型的细胞：如管胞、纤维细胞、薄壁细胞、分生细胞、色素细胞等。5.生长旺盛的愈伤组织呈乳白色、白色或浅绿色，老化的多转化为黄色或褐色。继代培养：第二节 愈伤组织的继代培养定义：培养物在培养基上生长一段时间以后，由于营养物质枯竭，水分散失，以及代谢产物的积累，必须转移到新鲜培养基上培养,这个过程叫做继代培养。一 愈伤组织培养的调控因素：外植体：基因型，年龄，器官和部位培养基：培养环境：光照（光强，光照时间，光质） 在愈伤组织诱导阶段，一般采用全暗、周期性光照、散射性光照三种方式。愈伤组织的诱导需弱光或不需光。继代培养一般需光。器官发生阶段，一般周期性光照比较好。此时光对器官的作用是一种诱导反应。 温度24-28， 多数植物在2428的恒温培养，可较好地形成芽和根。国内有关小麦、水稻花药培养温度试验的报道认为：在诱导花形成愈伤组织时，昼夜恒温较好，而在器官分化时，昼夜具有一定温差比较好，分化出的小植株比较健壮。生长素/细 高 利于根的形成胞分裂素 适中 利于愈伤组织的形成 低 利于芽的形成第三节 愈伤组织的形态发生形态建成：外植体细胞在适宜的培养条件下发生脱分化、再分化，产生芽和根，或者形成胚状体，发育成苗或完整植株。愈伤组织的形态发生方式：胚状体方式，不定芽方式一、不定芽方式（adventitious bud）愈伤组织的器官发生顺序有四种情况：1.愈伤组织仅有根或芽器官的分别形成，即无根的芽或无芽的根；2.先长芽，后长根，多数情况；3.先长根，再从根的基部长芽。这种情况较难诱导芽的形成，尤其对于单子叶植物；4.先在愈伤组织的邻近不同部位分别形成芽和根，然后两者结合起来形成一株植株。二、胚状体方式（somatic embryo）胚状体（embryoid）：指在组织培养中，由一个非合子细胞(体细胞)，经胚胎发生和胚胎发育过程（经过原胚、球形胚、心形胚、鱼雷胚和子叶胚5个时期），形成具有双极性的胚状结构。胚状体发生途径与器官发生途径形成植株的区别:1.胚状体具有两极性，即有茎端和根端。2.胚状体的维管组织与外植体的维管组织无解剖结构上的联系。3.胚状体维管组织的分布是独立的“Y”字形。胚状体方式比不定芽方式有更多的优点1.胚状体产生的数量比不定芽多；2.胚状体可以制成人工种子，便于运输和保存；3.胚状体的有性后代遗传性更接近母体植株。第四节 愈伤组织培养的应用1、加快了植物新品种和良种繁育速度；2、培育无病毒苗木；3、获得倍性不同的植株；4、克服远缘杂交困难；5、利于种质资源长期保存和远距离运输；6、提供育种中间材料；7、诱发和离体筛选突变体；8、制造人工种子。第三章 器官培养器官培养：指植物某一器官的全部或部分或器官原基的离体培养，包括根、茎、叶、花、果实、种子等培养目的：研究器官的功能、分化、形态建成；快速繁殖；获得脱毒苗；种质保藏等。第一节 根的培养根培养的意义:进行根系生理研究的最优良实验体系;研究器官分化、形态建成的良好体系；可建立快速生长的根无性系。一、离体根的培养方法：1、培养无菌苗2、切取1.0cm的根尖3、接种在White培养基或1/2MS培养基中暗培养4、一周后，取侧根扩大培养，可得到离体根的无性系二、影响离体根生长的因素：1.基因型2.培养基3.生长物质4.pH 5.环境条件第二节 茎尖的培养一、类型及意义1、类型茎尖分生组织培养：对长度0.1mm左右，含1-2个叶原基的茎尖进行培养，目的是获得无病毒植株普通茎尖培养：对几毫米至几十毫米长的茎尖、芽尖及侧芽的培养，目的是快速繁殖。2、茎尖培养的意义：无性系快速繁殖；培养无病毒苗，品种改良；理论基础研究。二、茎尖培养的一般方法1、制备外植体取1-2cm的枝条顶梢，去小叶-消毒-解剖镜下用解剖刀除去幼叶和叶原基，露出生长点，切下0.1-0.2mm长的茎尖(含1-2个叶原基)2、培养基：一般为MS3、培养方法：（1）固体培养法：试管培养（2）纸桥培养法：用酒杯状的滤纸代替琼脂，使杯底朝上塞入试管中，与液体培养基接触，将离体茎尖置于滤纸上方进行培养。优点：培养基是液体培养基，营养物质能通过滤纸均衡而持久地供给外植体，有利于外植体的健康成长 ；缺点：操作工艺复杂 。三、普通茎尖培养与繁殖技术概念：快速繁殖(微繁殖):用组织培养的方法，使植物的部分器官、组织迅速扩大培养，并移植到温室或农田繁殖出大量幼苗的繁殖方法。特点：繁殖速度快；使用材料少，生产效率高，省时省工；节约空间有利于植物的工厂化生产；在无菌条件下进行，不受病虫害侵害。四、茎尖微繁技术的过程：1、无菌培养体系的建立2、芽的增殖3、中间繁殖体的增殖4、诱导生根5、试管苗的移植（初代培养建立的无性繁殖系包括：茎梢、芽丛、胚状体和原球茎等。不定芽产生的途径：外植体上直接产生；由外植体诱导的愈伤组织上产生。壮苗目的：使增殖的嫩枝生根产生小植株，以便移栽。增加光强度，以提高小植株的光合能力）五、 影响茎尖培养微繁殖的因素：基因型；外植体的大小；供试植株的生理状态；芽在植株上的部位；供试植株的年龄；培养基；褐变；玻璃化第三节 叶的培养一、定义：离体叶的培养是指包括叶原基、叶柄、叶鞘、叶片、子叶等叶组织的无菌培养。叶培养的意义：1、是研究叶形态建成、光合作用、叶绿素形成的好方法2、通过叶组织的脱分化与再分化以证实叶细胞的全能性3、通过叶组织培养，探索离体叶组织培养的条件和影响因素4、建立体细胞快速无性繁殖体系5、叶细胞培养物经诱变筛选突变体。二、叶组织培养的方法1、制备外植体： 幼嫩叶片-水洗-消毒- 无菌水洗。2、影响培养因素：1）6-BA和KT利于芽的形成；2,4-D利于愈伤组织形成。2）极性：叶片腹面向上放置利于芽的分化3）损伤：常从叶柄、叶脉的切口处形成愈伤组织和芽。三、离体叶组织中再生植株发生途径1、直接产生不定芽2、离体叶 愈伤组织 不定芽3、离体叶 愈伤组织 胚状体 不定芽4、离体叶 小鳞茎或球状体 愈伤组织 第四章 胚胎培养胚胎培养指将植物的胚胎与母体分离，培养在人工的培养基上形成幼苗的过程，包括幼胚培养、成熟胚培养、胚乳培养、胚珠培养以及子房培养。胚胎培养的意义：克服远缘杂种的不育性 使胚胎发育不完全的植株获得后代 缩短育种年限，提高育种效率。第一节 胚培养胚培养：采用人工的方法将胚从种子、子房或胚珠中分离出来，再放在无菌的条件下，让其进一步生长发育，以至形成幼苗的过程。一、两种培养类型1、幼胚培养幼胚完全是异养的，离体条件下培养要求培养基成分复杂，培养不易成功。过程：取子房;常规表面消毒;解剖镜下，取胚珠、去珠被、取出完整幼胚;固体培养幼胚的发育方式： 1）胚性发育，此种方式不能萌发成苗； 2）早熟发育，长成的苗十分瘦弱；3）产生愈伤组织，再由愈伤组织分化形成胚或 不定芽。幼胚培养注意:幼胚特别小及幼嫩，切取幼胚必须在解剖镜下进行，操作时要特别细心，尽量取出完整的胚。在幼胚培养中，常见有三种明显不同的生长方式：1、继续进行正常的胚胎发育，维持“胚性生长”；2、在培养后迅速萌发成幼苗，而不继续进行胚性生长，通常称为 “早熟萌发”；3、在很多情况下，胚在培养基中能发生细胞增殖形成愈伤组织，并由此再分化形成多个胚状体或芽原基。特别是进行生长调节时，就更为如此。 2、 成熟胚培养成熟胚是自养的，培养基需要简单。主要目的:研究胚发育过程的形态建成;生长调节物质的作用;胚与胚乳相互关系和营养要求(幼胚培养适于液体培养，成熟胚适于固体培养)幼胚需要较高的蔗糖浓度，以提供较高的渗透压，但由于幼胚在自然条件下赖以生存的是无定形的液体胚乳，并具有较高的渗透压，所以人工培养基中要创造高渗透压的条件，使它可以调节胚的生长，阻止可能渗透压的影响，并能抑制中早熟萌发中的细胞延长，以及抑制胚的萌发，避免把细胞的伸长状态转化为分裂状态。 IAA可使胚的长度增加，加入BA可提高胚的生存机会。对于大多数植物的胚来说，在2530为宜；光照可以促进某些植物胚的转绿，利于胚芽生长，而黑暗则利于胚根生长。因此以光暗交替培养较为有利。 三、胚培养的应用1、克服杂种胚的败育，获得稀有杂种2、获得单倍体和多倍体植株3、打破种子休眠，促进胚萌发第二节 胚乳培养胚乳培养:指将胚乳从母体上分离出来，在无菌的环境条件下培养，使其生长发育形成幼苗的过程。胚乳是由两个单倍的极核和一个单倍的精子结合而成的三倍体组织。由它可获得无子结实的三倍体植株，进而可将它加倍成六倍体植株。不同胚乳发育类型及发育时期直接影响外植体取材时期以及胚乳细胞产生愈伤组织频率。胚乳培养的后代，常发生细胞染色体数目变化，形成多倍体、非整倍体等。一、胚乳的发育类型 1、核型胚乳被子植物中普遍的胚乳发育形式初生胚乳核的第一次分裂和以后的多次分裂，都不伴随壁的形成各个胚乳核呈游离状态分布在胚囊中发育到一定阶段后，常在胚囊外围的胚乳核之间出现细胞壁为单子叶植物和具有离瓣花的双子叶植物中普遍存在，如小麦、水稻、玉米、棉花、油菜、苹果等 2、细胞型胚乳特点：初生胚乳核的分裂开始，即产生细胞壁，形成胚乳细胞;无游离核时期大多数双子叶合瓣花植物是这样的胚乳，如番茄、烟草、芝麻等。3、沼生目型胚乳核型胚乳与细胞型胚乳的中间类型初生胚乳核的第一次分裂将胚囊分隔为两室，其中珠孔端室比合点端室宽大核进行分裂形成状态的游离核，最后形成细胞 二、胚乳培养的关键1、胚乳发育时期的影响发育早期胚乳：操作不便，诱导率低游离核期或刚转入细胞期的核型胚乳：难得callus旺盛生长期胚乳：易诱导产生callus旺盛期胚乳特征：胚已分化完成;胚乳已形成细胞组织;充分生长，达到成熟大小;外观为半透明的固体状;富有弹性一般情况下：接近成熟或完全成熟的胚乳callus诱导率很低，甚至无callus木本植物，如：桑寄生科、檀香科植物，其成熟胚乳和诱导产生callus2、培养基和激素的影响培养基：MS、B5、MT、White、LS等,水解酪蛋白、酵母提取物也很必要激素：大麦胚乳只有在添加2，4-D的培养基上才能生长；猕猴桃胚乳培养中，玉米素最好；枣的胚乳培养中，激素似乎无特殊要求3、其他因素的影响蔗糖浓度：3% 5%温度：25pH值：如玉米 6.1 7.0 ；苹果 6.0 6.2等三、胚乳培养过程四、胚乳再生植株的染色体倍数稳定型：三倍体畸变型：除少数是三倍体，多数是由多种倍性细胞组成的嵌合体五、胚乳培养的应用1、胚乳培养可得到三倍体植株，产生无籽果实。或加倍形成六倍体植株进行育种。2、胚乳培养可得到倍性不同的愈伤组织，可分离和筛选各种类型的非整倍体植株。第三节 胚珠和子房培养一、胚珠培养定义：是指将胚珠从母体上分离出来，在无菌的人工环境条件下培养，使其生长发育形成幼苗的过程。1、胚珠类型：直生胚珠，横生胚珠，弯生胚珠，倒生胚珠2、胚珠的发育：A 受精胚珠：一是形成种子；二是形成愈伤B 未受精胚珠：形成单倍体植株。二、胚珠培养方法:1、材料的选择和灭菌：未授粉胚珠：开花前1-6天，授粉胚珠：授粉后1-120天不等，较晚时期有利于胚的发育。灭菌：先对子房或外表组织消毒灭菌后，后取出胚珠培养。2、培养基的影响：植物激素：细胞分裂素对授粉胚珠发育常有促进作用。有机物：添加有机附加物可以促进授粉胚珠的发育。蔗糖浓度：3-12%，通常5%，高浓度利于孤雌生殖。3、胎座和子房对胚珠培养的影响：带有胎座或子房组织的胚珠相对较易培养。4、胚发育时期的影响：一般来说，合子或早期原胚期的胚珠较难剖取和培养，对培养基的成分要求也较严格。胚珠培养的意义：有利于合子和早期原胚的培养；胚分化不全的种子的胚培养；获得杂交后代和优良品种；离体授粉的需要；获得无病毒苗三、子房培养定义：子房培养是指将子房从母体上分离出来，在无菌的人工环境条件下培养，使其生长发育形成幼苗的过程。类型：授粉子房的培养 形成成熟果实和种子；未授粉子房的培养 形成小的无籽果实。1、子房培养的培养过程（1）制备外植体：在开花前后适宜时期取子房或幼花，消毒（2）子房培养：固体或液体培养均可2、培养基: N6,MS3、培养子房的发育：性细胞（卵细胞、助细胞、极核、反足细胞）-胚状体或愈伤组织-单倍体植株；体细胞（珠被、子房壁）-胚状体或愈伤组织-二倍体植株；4、子房培养的意义：有效地挽救杂种胚的败育；单倍体植株的培育；离体授粉的需要；离体条件形成果实；花被功能研究四、胚珠和子房培养的应用胚珠培养的应用1、受精胚珠培养目的：一是打破种子的休眠；二是挽救胚的发育，以获得杂交种。2、未受精胚珠培养目的：获得单倍体植株。子房培养的应用1、授粉子房培养目的：挽救杂种胚2、未授粉子房培养目的：获得单倍体植株。第四节 植物离体受精试管受精（test-tube fertilization）将胚珠或子房在离体培养的条件下进行授粉和受精的方法。（60年代）离体受精（in vitro fertilization IVF）指在离体环境中完成被子植物的精、卵融合而且利用受精所产生的“离体合子”培养再生植株，做到整个受精与胚胎发育过程完全在离体条件下完成。（90年代）一、离体授粉类型:1、离体柱头授粉2、离体子房授粉3、离体胚珠授粉二、离体受精及植株再生过程1、试验材料的选择：以子房较大胚珠较多的植物较易成功。2、离体授粉的程序：（1）确定开花、花药开裂及授粉时间（2）去雄后将花蕾套袋隔离（3）制备无菌子房或胚珠（4）制备无菌花粉（5）胚珠或子房的试管内授粉三、离体受精的细胞学研究现状1. 配子识别判别糖蛋白的作用 利用分离的雌、雄配子对其细胞膜特征直接进行分析，这可以帮助判断糖蛋白在被子植物中是否和在动物及低等植物中一样是配子识别必不可少的； 2. 膜融合多精入卵问题的探讨 膜融合的方式，在不同的离体受精系统中融合是不同的，一种是精细胞质很快进入卵细胞，精细胞膜作为其中的一部分参与了受精卵细胞膜的重组。另一种是精细胞整体进入卵细胞，精细胞膜并不参与融合产物细胞膜的形成。3. 胞质融合精细胞质全部进入卵细胞 体内自然受精过程中，至少部分被子植物的精细胞质未能进入卵细胞；而在离体受精时，精细胞质则全部进入卵细胞。4. 核融合融合过程中的信号问题 核融合一般在精卵融合后35-90min出现 。烟草卵细胞有明显的极性即液泡端和胞质端，但无论精子在卵细胞哪一端融合，卵细胞质都可很快地移向精核处将其纳入并包被。 四、离体受精的研究意义1. 为受精生物学的重要理论问题的探索与解决开辟了新的途径；2.用于遗传育种中可以克服自交不亲和性，特别是离体子房授粉和离体胚珠授粉，能消除柱头和花柱所造成的受精前障碍。 第五章 花药和花粉培养第一节 花药和花粉培养技术一、基本概念花粉和花药的培养(pollen and anther culture)是指花粉在培养基上改变其正常发育和机能，不经受精而发生细胞分裂，由单个花粉粒发育成完整单倍体植株的技术。单倍体植物(haplobiont)用离体培养花药的方法使花粉发育成一个完整的植株。花药培养是将花粉发育至一定阶段的花药接种到人工培养基上进行培养，以形成花粉胚或愈伤组织进而分化成植株的技术。花粉培养：是将花粉从花药中分离出来进行离体培养的过程。两者的共同点是利用花粉（小孢子）染色体数目的单倍性，培育单倍体植株，这是花药和花粉培养技术被广泛应用于植物遗传育种的主要原因。单倍体植物3个明显特点： 1、体细胞染色体数减半 2、生长发育弱，体形小 3、雌雄配子严重不育。二、花药培养1、外植体的选择外植体的遗传背景、生理状态和花粉发育时期。选择花粉发育适宜时期（一般是单核中晚期到双核早期）的花蕾。 镜检花粉发育时期，并根据发育时期与花蕾大小、外观形态和颜色等的相关性，选择适宜的花蕾。花粉发育时期的检测：外部形态观察：在水稻中，一般叶枕距为5-15cm，颖片淡黄绿色、雄蕊长度接近颖片长度的1/2时，可能为单核靠边期的花粉。压片染色法：是检测花粉发育时期的简便有效方法，常用染色剂为醋酸洋红。2、材料预处理取花粉发育适宜的花蕾进行预处理，低温处理一般在3-5处理3-10d，高温处理一般在35处理1-3d。 为避免花蕾失水，可将花蕾置于内装有浸湿的滤纸的培养皿中进行处理。3、材料消毒 消毒方法与其它组织消毒4、接种 尽可能地避免花药受到损伤；接种速度尽量快；注意接种密度。5、培养（1）基本培养基因植物不同所用基本培养基不同，MS、N6、B5等。（2）蔗糖浓度培养基中蔗糖浓度比其它组织培养高，尤其早期培养，一般5%10%。原因是花粉母细胞的渗透压比花丝等体细胞高，即高浓度的蔗糖不利于药壁、花丝等体细胞的生长，而利于花粉的生长。 （3）激素 激素种类和浓度对花药和花粉培养很重要。花药壁分化程度高，重新分裂需要较高的激素浓度才能启动。因此，花药培养基的激素水平要相对较低才能抑制二倍体细胞的分裂。确定适宜的激素浓度，以促使花粉细胞分裂的同时又抑制花药二倍体细胞分裂是成功获得单倍体的关键。（4）培养方式 固体培养，液体培养，双层培养花药培养的目的是花药内花粉的植株再生，即单倍体再生。因此可将花药培养数日后，取出其中花粉再培养。6、植株再生花药和花粉培养中，花粉有5种去向：再生植株途径有2种：1、经由成愈伤组织再生植株2、经由胚状体再生植株花药培养不经愈伤组织直接产生胚状体是最理想的方式，这样可免去愈伤组织和生根阶段。但多数情况是产生愈伤组织，这时要用提高细胞分裂素，降低生长素甚至不用生长素的分化培养基诱导分化产生芽。7、单倍体确定及染色体加倍单倍体确定方法，可以镜检根尖染色体数，或根据气孔周围保卫细胞的大小来确定。染色体加倍，用秋水仙素处理：培养阶段：培养基中加入50-250mg/L秋水仙素。移栽后：用0.2%秋水仙素浸泡生长点1-3d，或每日傍晚点滴生长点数滴，进行5-6d。 水稻花药培养过程三、花粉培养习惯上，把处于四分体到单核早期的花粉称小孢子。 进入单核以后则称为花粉。适宜时期：单核期，尤其是单核中、晚期(单核靠边期)一般而言，单核期（第一次有丝分裂前）对诱导反应最敏感，为最佳培养期。形成双核后，在合适的条件，主要由营养细胞分裂产生胚状体。不同物种诱导胚胎发生的最佳小孢子发育时期发育时期物种减数分裂期草莓、番茄四分孢子期葡萄单核早中期石刁柏、油菜、大麦、天仙子、马铃薯单核晚期荔枝、茄子、青椒、小麦单核早期至晚期烟草单核早期至双核期梨、水稻、甘蓝四分孢子期至双核期玉米花粉分离收集： 由于花粉包于花药内，必须将它们从花药中分离、收集才能进行培养。方法： 1）花粉漂浮自然释放法:将花药接种于液体培养中，使花粉自然释放。 2）人工挤压法:用玻璃棒捣碎花药使花粉释放。 3）机械法:用磁力搅拌器打碎花药释放花粉。 释放的花粉粒 尼龙网（孔径2060um）过滤，除去药壁等组织 500-1000转/分离心1-5分钟，收集花粉。2、培养方式：一般以液体培养（花粉密度调至104-105/ml），形成愈伤组织或胚状体后转入固体培养基。直接培养：直接取新鲜花药的花粉粒进行培养的方法（培养基中可添加花药提取液）。预培养：将花药先悬浮培养2-4天（50个花药/5 ml），再挤出花粉，经离心洗涤纯化后悬浮培养。哺育培养：将在合适培养基上培养裂开的花药作为哺育组织，将预培养的花粉接种在其中的方法。看护培养：将花药水平放于固体培养基上，在其上覆盖小圆形滤纸，在滤纸滴加0.5ml含10个花粉粒的悬浮液滴的培养方法。微室培养：将一滴花粉悬液滴在盖玻片上，在翻过来放在凹穴载玻片上，盖玻片四周用石蜡密封。双层培养：固相和液相双层培养。3、培养基（1）基本培养基：MS和H培养基：适合双子叶植物花药培养；B5培养基：适合豆科和十字花科花药培养；N6培养基：适合禾谷类作物的花药培养。（2）激素种类和浓度细胞分裂素可促进胚状体形成；生长素可诱导愈伤组织形成。细胞分裂素与生长素比值高时可诱导愈伤组织分化苗（3）蔗糖浓度较高浓度蔗糖可诱导花粉形成愈伤组织；较低浓度蔗糖可使愈伤组织分化成苗。四、花粉培养成苗途径与花药培养比较:相同点：胚状体成苗途径、愈伤组织再分化成苗途径不同点：花粉培养：1、需进行花粉的分离，特殊的花粉诱导培养2、培养方式五、花粉培养与花药培养中最易出现的问题（一）白化苗产生的影响因素及机理1、内因供体植株基因型（如籼稻比粳稻白苗率高）、花粉发育时期。2、外因预处理、培养基成分、激素水平与种类、培养条件和方法、愈伤组织转分化时间等。3、机理核基因起关键作用，导致质体DNA缺失，产生白苗。另外地、无性系变异也可能是原因之一。（二）白化苗的控制 通过对花粉发育时期、预处理、培养基成分等因素进行调控。六、单倍体植株染色体加倍的方法（一）单倍体植物天然发生的途径：（二）单倍体植株染色体加倍的方法1、自然加倍2、人工加倍：用秋水仙素溶液浸苗、处理愈伤组织和用含0.4%秋水仙素的羊毛脂涂抹单倍体植株的顶芽、腋芽，可得到能结实的二倍体植株。3、愈伤组织反复继代培养，可得到二倍体植株。第二节 花药和花粉培养的应用 -单倍体植株育种1、诱导形成单倍体，快速获得纯系，缩短育种周期；2、有利于筛选隐性突变体，提高选择效率;3、有利于隐性基因控制性状的选择4、快速获得自交系的超雄株5、遗传工程受体6、获得染色体异附加系和代换系7、突变体选育1、作物育种（1）缩短育种周期：常规育种需4-6年获得纯系，而小孢子培养仅需一年。（2）提高了目标基因型的选择效率（3）提高了目标基因型的选择效率（4）诱变育种中的作用植株不受显隐性的影响，在诱变育种中能在当代及时获得突变个体，加倍后成为稳定的纯系。2、物种进化研究 可探索亲本染色体组的构成。分析单倍体植物减数分裂时，形成二价体的数目和形状，能确定染色体组内是否存在同源染色体。 3、遗传分析 单倍体植株中基因不受显隐性的影响，每一个基因的作用均能表现出来。能用来研究基因的性质及其作用。还可用于基因的剂量效应分析。4、构建连锁图谱 双单倍体（DH）群体是永久性群体，能有效地用于遗传图谱的构建5、用于遗传转化 能直接表达外源基因，不受显隐性影第六章 细胞培养第一节 单细胞培养植物细胞培养（plant cell culture）：指对植物器官或愈伤组织上分离出来的单细胞(或小细胞团)进行培养，形成单细胞无性系或再生植株的技术。一 植物单细胞培养的意义1 有利于观察细胞个体的分裂、分化、生长和繁殖情况；2 有利于获得纯系细胞；3 有利于进行细胞特性、细胞生长规律、细胞代谢过程和及其调节控制规律方面的研究；4 人工诱发单细胞突变；5 有利于基因的转化；6 有利于进行天然化合物的生产。二 单细胞培养的程序1.建立细胞株2.高产细胞株的选择3.分化培养或扩大培养4.鉴定和提取三 单细胞的分离从外植体直接分离愈伤组织或悬浮培养物(常见)利用原生质体再生法获得单细胞2.1 从外植体直接分离单细胞方法：进行简单的切割、捣碎或酶解，经一定孔径的不锈钢网过滤，即可得到细胞悬浮液。缺点：悬浮液中所含的完整细胞数量较少。优点：细胞的分散性好。2.2 由组织器官经愈伤组织分离单细胞步骤：1）诱导产生愈伤组织；2）愈伤组织反复继代，使组织不断增殖，提高愈伤组织松散性；3）将愈伤组织在液体培养基中培养，建立悬浮培养物优点：细胞团成小细胞团或单细胞；在培养基中均匀分布；有空气交流。2.3 利用原生质体再生法获得单细胞外植体、愈伤组织或细胞团经过纤维素酶和果胶酶等作用，除去细胞壁而获得原生质体。四、单细胞培养方法（Single cell culture）1.看护培养法2微室培养法3.固体平板培养法4.双层滤纸培养法（一）看护培养法（Nurse culture）1、看护培养的含义及用途用一块活跃生长的愈伤组织来看护单个细胞，并使其生长和增殖。这个愈伤组织块称为看护愈伤组织。诱导形成单细胞系。2、看护培养基本技术（1）在一个培养瓶中加入一定量厚的固体培养基，灭菌后备用。（2）在无菌条件下，将一小块（1cm3）活跃生长的愈伤组织接种到培养基上，再在愈伤组织块上放一片（1cm）已灭菌的滤纸，放置一晚上。（3）将分离的单细胞接种到培养基的滤纸上。（4）恒温培养。3、看护培养特点优点：1简便易行。2效果好，易于成功。缺点：不能在显微镜下直接观察细胞的生长过程。（二）微室培养法（Microculture）用途：主要用来观察细胞生长、分裂、形成细胞团的过程。2、微室培养特点1微室内不能有气泡。2最好微室的厚度不要超过20微米，盖玻片的厚度要在0.170.18毫米左右。3观察时要保持温度和培养时的一致。优点：在培养过程中，可以连续进行显微观察一个细胞的生长、分裂和形成细胞团的全部过程缺点：培养时间较短（三）平板培养法（Plante Culture）1、含义及用途：含义:方法是将经机械破碎过筛或酶(纤维素酶及果胶酶等)消化分散纯化的细胞，经计数及稀释，接种到加热熔化而刚冷却至35左右的固体培养基中充分混匀，倾入培养皿中，密封，于25培养，约20天后细胞即可生长成团。统计生长情况。用途: 分离单细胞无性系，研究其生理、生化、遗传上的差异而设计的一种单细胞培养技术。广泛应用于细胞、原生质体及融合产物的培养。2、特点优点：可以定点观察；分离单细胞系容易；缺点：培养细胞气体交换不畅。3、平板培养的基本技术（1）悬浮细胞密度的调制平板培养要求最初细胞密度（即初始植板密度）为110 -10010 个/ml 。初始植板密度：单细胞固体平板培养时，细胞悬浮液接种到琼脂培养基上最初细胞密度（2）培养基配制1.4%琼脂基本培养基+等量细胞培养液=0.7 % 琼脂条件培养基。条件培养基：曾悬浮培养过一段时间组织或细胞的液体培养基。(3)制平板:细胞悬浮液与融化状态（35）条件培养基按一定比例均匀混合，倒成平板。(4)培养:26置暗处培养21天。低倍显微镜观察，记数单细胞或小细胞团，计算置板效率（也称植板率）。植板效率（或植板率）：已形成细胞团的百分数（即每100个铺在平板上的细胞中有多少个能长出细胞团）。（四）双层滤纸培养 三、影响单细胞培养的因子1、条件培养基：条件培养基可有利于单细胞的生长与分裂。 2、细胞密度(临界密度)临界密度：单细胞培养时，初始植板密度低于某值培养细胞就不能进行分裂和发育成细胞团，则该值就是临界密度。初始植板密度应根据培养基的营养状况而改变，培养基越复杂则植板细胞的临界密度越低，反之则相反。一般要求每毫升在1000个细胞以上。 3、生长激素 生长激素加1种细胞分裂素和几种氨基酸。临界密度只需25-30细胞/毫升。 4、pH5、CO2第二节 细胞悬浮培养Suspension culture1、含义：将离体的植物细胞悬浮在液体培养基中进行的无菌培养2、特点 1）细胞可不断增殖，形成高密度的细胞群体，适于大规模培养； 2）能够提供大量较为均匀的细胞，为研究细胞的生长、分化创造方法和条件。一、悬浮培养类型（一）成批培养/分批培养（Batch culture）含义：将愈伤组织培养在一定容积的密闭容器中进行培养。它是进行细胞生长和细胞分裂的生理生化研究常用的培养方法。1、成批培养特点（1）培养基体积固定；（2）必须适当搅拌；（3）培养过程中，细胞生长，其数目不断发生变化，呈S增长；（4）主要营养物质耗尽时，细胞的分裂和生长即停止；（5）要进行下一批培养，则生长一定时间后，需要继代转移。 2、成批培养的方法(1)旋转培养(2)往返震荡培养(3)旋转震荡培养(4)搅动培养 为了使分批培养的细胞能不断增殖，必须进行继代，方法是取出培养瓶中一小部分悬浮液，转移到成分相同的新鲜培养基中（大约稀释5倍）。 滞后期的长短主要取决于在继代时原种培养细胞所处的生长期和转入细胞数量的多少。当转入的细胞数量较少时，不但滞后期较长，而且在一个培养周期中细胞增殖的数量也少。如果转入的细胞密度很低，则在加入培养单细胞或小群体细胞所必需的营养物质之前，细胞将不能生长。 另外，如果缩短两次继代的时间间隔，例如，每23d即继代一次，则可使悬浮培养的细胞一直保持对数生长。据报道，加入条件培养基（即在其中曾培养过一段时间植物组织的培养基）可以显著缩短滞后期的长度。 如果使处在静止期的细胞悬浮液保存时间太长，则会引起细胞的大量死亡和解体。因此，当细胞悬浮液达到最大干重产量之后，即在刚进入静止期的时候，须尽快进行继代。提高细胞分散程度的方法1. 尽可能使用易散碎的愈伤组织愈伤组织的结构是受遗传因子控制的，因而有时无论采用什么办法也难于使细胞充分分散。不过，一般来说，如果培养基的成分和继代方法选用得当，总有可能提高细胞的分散程度。如果把愈伤组织在半固体培养基上保存2-3个继代周期，其松散性常会增加。2.加入特殊物质（较少细胞之间的联系、减慢细胞分裂的速度）已知加入2, 4-D，少量水解酶（如纤维素酶和果胶酶），或加入酵母浸出液一类的物质，都能促进细胞的分散。3.加新鲜培养基如果每隔1d加一次新鲜培养基，使生物量与培养基容积之比保持为2，这样，悬浮培养细胞