天然生物防腐剂纳他霉素的研究进展.doc

天然生物防腐剂纳他霉素的研究进展天然生物防腐剂纳他霉素的研究进展摘要：目前，当今社会对于食品安全问题的关注热度逐年升高。防腐保鲜也成为了研究的热门项目之一。在这一领域中，添加食品防腐剂是最为重要的手段之一，食品防腐剂中的天然食品防腐剂以其抗菌性强、天然、水溶性好、安全无毒等诸多优点已成为世界防腐剂开发的主方向之一：纳他霉素作为一种天然食品防腐剂，能有效地抑制和杀死霉菌、酵母菌、丝状真菌，从而有效地降低强致病性真菌毒素对人类的侵害，同时可以延长食品货架期，减少浪费。但由于其目前发酵水平低，导致成本过高，所以探索提高纳他霉素产量新的途径具有重要的现实意义。本文着重阐述了纳他霉素的特性、作用机理、应用进展以及前景展望等几方面内容。关键词：纳他霉素；生物防腐剂；发酵1 纳他霉素的研究概况：1.1纳他霉素的简介食品当中所含有的致病菌如果超标或者不符合国家标准的话，则会对人身体造成不同程度上的危害。有一些甚至具有强烈的致癌、致畸、致震颤、致出血、致皮炎等致病性，特别是真菌毒素给人类健康造成极大的伤害1。因此食品原料的收获、存放以及食品的加工、保藏要特别注意真菌污染的防治，早在上个世纪八十年代初就引起了全世界的重视。纳他霉素也称匹马菌素、游链霉素，是一种二十六元环多烯大环内酯类抗真菌剂，主要由恰塔努加链霉菌、纳塔尔链霉菌和褐黄孢链霉菌等经发酵、提取、精制而成的一种次级代谢产物，其分子是一种具有活性的环状四烯化合物，含3个以上的结晶水，其外观白色（或奶油色），为无色、无味的结晶粉末，分子式C33H47NO13，微溶于水、甲醇，溶于稀酸、冰醋酸及二甲苯甲酰胺，难溶于大部分有机溶剂。它在食品中含量不高，也不会影响食品的味道。美国FDA于1982年将其批准为食品防腐剂,并列入GRAS(一般公认为安全的)产品之列,我国卫生部在1997年正式批准其为食品添加剂。它可以作为霉菌、酵母菌及真菌的抑制剂,故可用于抑制食品中的霉菌、酵母菌及真菌2、3。目前全世界有三十多个国家将纳他霉素用于乳制品、肉制品、果汁饮料、葡萄酒等的生产和保藏之中。纳他霉素具有一定的耐热性，在干燥状态下相对稳定，能耐受短暂高温（100）；但由于它具有环状化学结构，对紫外线较为敏感，故不宜与阳光接触。纳他霉素的稳定性受pH值、温度、光照强度和氧化剂及重金属的影响，所以产品应该避免与氧化物及硫氢化合物等接触。 纳他霉素的四烯发色团给分子一种高不饱和特性，可与含活性氧的化合物如高锰酸钾、高硫酸盐及过氧化物相互作用；另一方面，它以环氧族的形式保持弱氧化性，当纳他霉素在冰醋酸中用热的碘化物处理后会析出碘。纳他霉素通过酸水解作用可以释放出海藻糖胺，内酝可以通过碱水解作用皂化。恰塔努加链霉菌是生产纳他霉素的菌种之一，其孢子丝为螺旋形，偶尔柔曲；孢子呈球形或者椭圆形，在大部分的培养基内，基丝呈橙黄色或近深黄橙色，可溶色素和基丝色相同，在燕麦粉琼脂等培养基上产生孢子，基丝反面没有颜色，可溶色素为黄色，对pH不敏感。明胶液化快，能利用右旋光性葡萄糖，也可以利用果糖、蔗糖、棉子糖、肌醇、D-甘露醇，但不利用L-阿拉伯糖，D-木糖，L-鼠李糖。1.2 纳他霉素的研究历史1956年，Tresner曾测试过纳他霉素对500种霉菌的抗性，所有菌种都被1-10pmp的纳他霉素抑制；1959年，KliS比较了纳他霉素、山梨酸、放线菌酮、制霉菌素、龟裂霉素等的抑菌效果，发现纳他霉素对16种在肉汤和琼脂中培养的霉菌是最有效的抑制剂。绝大多数霉菌在0.5-6ppm的纳他霉素浓度下被抑制，极个别的菌种在10-25pmp的纳他霉素浓度被抑制；多数酵母在1.0-5.0ppm的纳他霉素浓度下被抑制。纳他霉素的研究历史表明纳他霉素无毒，并且不致突变、不致癌、不致畸、不致敏。纳他霉素很难被消化道吸收，由于其难溶于水和油脂，大部分摄入的纳他霉素会随粪便排出。1966年，Levinska S等研究纳他霉素的急性毒性和慢性毒性，证明纳他霉素对人体器官没有明显影响，也不产生伤害。1973年Hami1ton-Miller报道纳他霉素口服毒性最小，静脉注射毒性最大。1977年，Deb。er和st。Ik一HorsthuiS研究了真菌对纳他霉素形成抗性的可能性，他们在连续几年使用纳他霉素的食品仓库中，没有发现真菌形成抗性的证据;使用大MIC(最小抑菌浓度)的纳他霉素量，人为诱导也没发现真菌形成抗性的证据。1982年，Ray和Bullerman报道纳他霉素能减少黄曲霉中黄曲毒素、储曲霉中储曲毒素、圆弧青霉中青霉酸、展开青霉中展开青霉素的产生。因此，纳他霉素能减少真菌毒素给人类造成的危害。1.3 提高纳他霉素产量研究的目的和意义长期过量摄入化学防腐剂会对人的身体健康造成一定损害。儿童、孕妇等属于身体发育特别时期的特殊人群，在食品的摄取方面应该重点予以保护，建议不要给他们食用那些含有过多防腐剂的食品。纳他霉素与其他化学防腐剂相比，纳他霉素使用量仅有10-6数量级，且适用的pH值范围较广；延长产品货架期同时，不影响产品的风味和颜色，被誉为是一种高效、安全的生物防腐剂。瑞士、欧盟，还有东欧、中东等地区的大部分国家已经正式批准纳他霉素为食品防腐剂。1996年，我国食品添加剂标准化技术委员会正式批准纳他霉素可作为食品防腐剂。虽然纳他霉素有良好的应用前景，但目前世界上仅有国外的几家公司在生产和销售纳他霉素，而国内发展还处于起步阶段，主要依靠进口；而国内纳他霉素的发酵水平较低，又存在技术壁垒，导致成本太高，每公斤的纳他霉素售价约为1600元左右，多数的厂家和单位还很难接受此价格，故其应用受到了严重制约。因此，提高纳他霉素产量的研究，不仅具有重要的理论意义，也具有一定的实际和应用价值。1.4 影响纳他霉素活性的理化因素纳他霉素干粉在避光避潮下是稳定的化合物,室温下保存几年只有很小一部分失去活性。三水合物同样稳定，但无水形态不稳定，在室温封闭的瓶子中保存48h会失去15%的活性。中性的纳他霉素水溶液几乎和干粉一样稳定。纳他霉素的稳定性受pH值、温度、光照、氧化剂和重金属等条件的影响而变化3、6、7、8。1.4.1 pH值pH值对于纳他霉素的稳定性较明显的影响,但对纳他霉素的抗真菌活性没有明显的影响：纳他霉素在pH5.58.5的范围内纳他霉素有很好的稳定性,在极端pH值下纳他霉素迅速失活，形成各种各样的分解产物。在低pH值时其主要的裂解产物是海藻糖胺；在高pH值时,如pH12，由于内酯皂化可形成纳他霉酸,用强碱处理导致进一步的分子破裂，产生一系列的后醛醇反应。Gist-Brocades报道，纳他霉素于30储存三星期，在pH57的范围内，纳他霉素的活性仍保持100%，pH3.6时保持大约85%，pH9.0时仅剩大约75%，但在大部分食品的pH范围内，纳他霉素十分稳定。1.4.2 温度温度对纳他霉素的活性几乎没有影响(在中性水溶液中)。纳他霉素在室温条件下是稳定的，100短时间处理(60min以内)，对纳他霉素活性影响不大，但处理时间越长，其剩余含量越低。高温处理，对纳他霉素稳定性有较明显的不良影响；所以纳他霉素的应用应尽量避免长时间高温处理，不宜与氧化剂接触。1.4.3光照纳他霉素在紫外光下分解,失去四烯结构。辐射也能使纳他霉素分解。储存过程必须避光密闭，以免受到紫外线的破坏。1.4.4 氧化剂纳他霉素不宜与氧化剂如双氧水、漂白粉等接触，否则抑菌活性会明显下降。防止氧化的方法是使用抗氧化剂，如叶绿素、抗坏血酸、丁基轻基茵香醚、丁基甲苯等。1.4.5 重金属一些金属离子可以促进纳他霉素的氧化失活，尤其是铁、镍、铅、汞等重金属。因此，纳他霉素适宜存放在玻璃、塑料或不锈钢容器中，也可以添加EDTA或聚磷酸盐来防止失活。1.5 纳他霉素抑菌的作用机理及合成途径1.5.1纳他霉素抑菌的作用机理纳他霉素对真菌的抑菌作用极强。可以高效、广谱的抗霉菌、酵母菌、某些原生动物和某些藻类剂，能与凿醇化合物相互作用且具有高度的亲和性，对真菌有抑制活性，其抗菌机理在于它能与细胞膜上的固醇化合物反应，由此引发细胞膜结构改变而破裂，使细胞内容物的渗漏，导致细胞死亡。但它没有抗细菌活性，这是由于真菌的细胞膜含有麦角固醇，而细菌细胞膜中不含这种物质，多烯大环内酯类抗生素能有选择的和固醇结合，结合的程度与膜的固醇含量成正比,结合后形成多烯化合物，引起细胞膜结构的改变，导致细胞膜渗透性的改变,造成细胞内物质的泄漏。另外，纳他霉素对于抑制正在繁殖的活细胞效果很好，而对于破坏休眠细胞则需要较高的浓度，同时，对真菌孢子也有一定的抑制作用3、8、9。1.5.2 纳他霉素的合成途径纳他霉素是一种大环内酯类抗生素，其生物合成首先以乙酰 CoA 和丙二酸单酰 CoA 为前体，包括内酯环（多聚乙酰途径，和脂肪酸合成途径类似)以及氨基糖的形成。乙酰辅酶 A 是由糖酵解(EMP)过程的最后产物丙酮酸，在丙酮酸脱氢酶系的作用下氧化脱羧得到。而丙二酸单酰 CoA 的合成途径有两条：一条途径是磷酸烯醇丙酮酸在丙酮酸激酶作用下生成丙酮酸，丙酮酸生成乙酰CoA，再在乙酰 CoA 羧化酶催化下，生成丙二酸单酰 CoA；另一条途径是磷酸烯醇丙酮酸在磷酸烯醇丙酮酸羧化酶催化下生成草酰乙酸，在甲基丙二酰辅酶A、丙酮酸羧基转移酶作用下生成丙二酸单酰 CoA。纳他霉素内酯环的形成是合成产物的第二步，由多个乙酸单位及丙酸单位通过聚酮体(polykecide)途径缩合而成。由于脂肪酸的形成也是以乙酸和丙酸为前体的，聚合的机制也相同，因此当培养基中含有长链脂肪酸时就会对纳他霉素的合成产生反馈抑制作用20。纳他霉素结构中海藻糖胺(mycosamine)的合成是由活化的己酮糖与氨基作用而形成，这暗示铵盐离子对纳他霉素产量可能有一定的影响。因此，研究铵离子对纳他霉素合成作用的影响，也是寻求提高产物产量的一条途径。2 纳他霉素国内外的研究水平和生产状况2.1.1 国内的研究水平和生产情况 国内到2003年底只有北京市营养源研究所真菌工程高技术实验室与天津科技大学开展了纳他霉素的菌种选育、发酵条件、提取工艺、分析检测、应用实验方面的研究，2001年课题进展到完成实验室水平研究。目前瑞德公司是国内第一家纳他霉素的生产厂，尽管目前纳他霉素产业在我国尚处于起步阶段，其应用范围也十分有限，但近二十年来乳酸链球菌素的广泛应用及其产业的蓬勃发展已经有力地证明了生物防腐剂在食品、医药等领域的巨大发展潜力。随着人们对化学合成食品防腐剂安全性认识的提高，低毒、高效、广谱及经济实用的生物食品防腐剂的研究和开发，将愈来愈受到人们的关注。2.1.2 我国纳他霉素产业的发展概况1996 年，我国食品添加剂标准化技术委员会正式批准纳他霉素可作为食品防腐剂；1997 年，卫生部批准纳他霉素(美国 pfizer 公司的产品 Natamax)作为食品防腐剂可以在中国使用。我国对于纳他霉素的研究始于1995年，天津轻工业学院（现天津科技大学）的杜连祥以及北京市营养源研究所的李东等针对纳他霉素的菌种选育、发酵条件、提取工艺、分析检测以及应用实验等方面开展研究，并筛选到五株生产菌株；1997-2000 年，北京市营养源研究所的李东等继续对纳他霉素的菌种提纯、发酵工艺条件、提取工艺、检测方法以及中试进行研究；2001年9月，北京市营养源研究所和天津科技大学共同与北京市东方瑞德生物技术有限公司合作进行纳他霉素产品的工业化生产开发，于2002年12月获得成功，产品质量达到欧州标准，批量出口国外，该公司成为我国第一家纳他霉素的生产企业。经过十多年的发展，我国的纳他霉素产业在菌种选育、发酵工艺、分离提纯技术等方面不断进步，在食品中的应用研究也不断深入，相关的发明专利已经达到21项，已鉴定的科研技术成果达8项。国内纳他霉素产业的核心技术力量包括天津科技大学、北京市营养源研究所、广州市微生物研究所、上海医药工业研究院、北京东方瑞德生物技术有限公司、浙江银象生物科技有限公司等科研院所及主要生产企业。到2008 年，全国规模化的生产企业已达8家；2009年，我国纳他霉素产量已接近40t，其中出口占总产量的51%。目前，纳他霉素作为生物防腐剂在我国食品工业中的应用已经扩展到11个种类的产品，随着国内对于食品安全问题的日益关注以及对传统化学防腐剂使用的管制力度不断加大，其应用范围还将有更大的发展空间。2.2 国际上纳他霉素产业的发展情况目前，纳他霉素在国外已被用于医疗(外用治疗真菌引起的眼角膜炎等)、食品、饲料和粮储之中。1985年，Smith和Moss报道FAO/WHO给出了纳他霉素的ADI值（每日允许摄入量）为0.3 mg/kg 体重；1998年，美国GRAS专家组认定纳他霉素用于酸奶、奶油、干酪、酸性稀奶油和农家干酪非常安全；2005年6月27日，日本厚生省修改食品卫生法及食品和食品添加剂标准法规项下的强制性法规，批准纳他霉素作为食品添加剂，并制定该物质的标准和规范。纳他霉素已在欧盟、大部分北美和东欧国家以及一些中东国家被广泛使用。欧盟批准用于干酪和肉制品领域，荷兰、比利时、法国、西班牙、意大利、瑞典等国家允许纳他霉素用于酪和硬香肠的防腐，荷兰还批准纳他霉素用于苹果和梨的防腐；中国批准用于干酪、糕点、果蔬汁、发酵酒等食品的防腐。全球纳他霉素产量保持高速增长，2005年乳酸链球菌素总产量为95 t，同比增长12，2006年总产量达109t，同比增长14.7%，2007年总产量127 t，同比增长16.5，2008年总产量达到141 t，同比增长11，2009年总产量达到160 t，同比增长13.5，连续五年呈现高速增长态势3 纳他霉素在各个领域的应用3.1 在食品方面的应用 我国1996年食品添加剂委员会对纳他霉素进行评价并建议批准使用,现已列入食品添加剂使用标准，其商品名称为(natamaxin TM)克。纳他霉素对人体无害且无残留，所以是一种安全的食品防腐剂，加之其无臭无味的优良特性，也不会对产品的口味产生不良影响，因而在食品行业的诸多领域有具体的应用，范围较广，既有酸性食品，也有碱性食品：如调味品、焙烤食品、乳酪制品、果蔬汁原浆和易发霉食品等。纳他霉素使用，如浓缩果汁、焙烤食品以及一些其他食品。3.1.1在乳酪制品中的应用1998年, GRAS专家组认定纳他霉素用于酸奶、奶油、干酪、酸性稀奶油和农家干酪是安全的。目前，纳他霉素应用于奶酩生产的工艺已很成熟,纳他霉素用于干酪皮防止其表面发霉，它不会渗透到干酪内部，仅仅停留在酪皮外层，而这一部分一般不会被取食，干酪放置5-10周后，纳他霉素基本消失，此时酪皮变硬不易受到霉菌侵染。另外，把纳他霉素直接添加到酸奶等发酵制品中，抑制霉菌和酵母菌，而不杀死有益的细菌(双歧杆菌)，其它防腐剂尚不具备这一功能9。3.1.2在果蔬制品及调味品中的应用纳他霉素用于水果储存中，可有效防止真菌引起的有氧降解。我国也有关于纳他霉素应用于水果中的报道。将整个苹果浸泡在含有500g/mL纳他霉素的悬液中1-2min后，经过8个月的存放，能有效降低苹果变质的数目。用卵磷脂纳他霉素混合液浸洗苹果可有效防止水果出现的霉腐斑点10。在富含酵母的酒中加10mg/kg即可清除酵母。可以直接将其加入沙拉酱中，延长保质期不会改变其原味。纳他霉素还可以应用于果酱、橘汁防霉11。在酱油、食醋等调味品中，使用一定量的纳他霉素，可防止霉菌和酵母菌引起的变质。实验发现，在室温较高的夏季，向酱油中添加15mg/kg的纳他霉素，可有效地抑制酵母菌的生长和繁殖，防止白花的出现，且对酱油的口感和风味无任何影响12。此外，纳他霉素还可用于豆瓣酱，豆豉和黄油等产品的防腐9。3.1.3在肉类制品中的应用冷却肉保鲜方面：不同浓度的Nisin及纳他霉素处理冷却肉，可起到不同程度的保鲜效果；复配的最优水平组为Nisin(0.008%)+纳他霉素(0.012%)+乳酸(3%)14。鲜肉保鲜方面，可采用纳他霉素浸泡或喷涂肉类食品，来达到防止霉菌生长的目的。使用200mg/kg的纳他霉素混悬液对其进行浸泡或喷洒，可达到安全而有效的防霉水平。但由于产品性质、地区气候等的差异，可通过实验确定最佳效果和最经济的使用浓度。目前已经证实，将纳他霉素悬乳液浸泡或喷涂已添好馅料的香肠表面，就可有效的防止香肠表面长霉。纳他霉素可在以下数个步骤中添加：发酵前、肠衣浸泡、已灌料香肠的浸泡及已灌料香肠的表面喷洒。对于硬香肠来说，纳他霉素的推荐用量为肠衣浸渍液质量的0.05% -0.2%。3.1.4 在焙烤食品中的应用面包是一种价格低廉的大众化食品,比较纳他霉素、山梨酸钾、丙酸钙、富马酸、尼泊金甲酯对面包的防霉效果。实验显示，纳他霉素的抑菌效果较其它防腐剂要好,当使用浓度在750mg/kg、采用喷淋法对面包进行处理时，保质期可提高1倍以上。月饼在常温下，饼皮和馅都容易霉变。用纳他霉素可轻而易举地延长其成品的货架期。以蛋黄莲蓉月饼为例，将生咸蛋黄入炉烤至八成熟，取出冷却后，浸泡纳他霉素悬浮液中，约2min捞起，即可防止蛋黄入馅的霉变。月饼烘烤后冷却至常温时，将纳他霉素的悬浮液喷涂在月饼的表面四周及底部，即可完成外部防霉。其他焙烤食品如：蛋糕、馅饼等都可以用纳他霉素的悬浮液喷涂其表面，在不对产品产生任何影响的同时，可有效地防止霉变和延长货架期。3.1.5 在饮料上的应用纳他霉素加入果汁中，可消除果汁中的酵母菌、真菌和霉菌，有效防止果汁发酵变酸，延长果汁的保存期，且不会对果汁风味有任何影响。由于各种果汁中含糖量、有机酸的含量均较高，很适合酵母菌的生长繁殖，引起果汁的腐败变质。使用纳他霉素可以增加非酒精饮料的贮存稳定性。（1）葡萄汁：应用20ppm的纳他霉素即可防止因酵母的污染而导致的果汁发酵，添加100 ppm 可完全终止发酵活性。（2）橙汁：由于在自然条件下受到真菌的污染，橙汁一般放置一周便会变坏，加入纳他霉素后，即使其剂量低至1.25ppm，存放在24下，保质期可长达8周。纳他霉素的抑菌效果与存放温度有一定的关系，10存放的浓缩橙汁，10ppm即可抑制其中的酵母生长；存放在室温下，则需20ppm纳他霉素才有抑菌作用。（3）苹果汁：30ppm的纳他霉素，其防止苹果汁发酵的时间可长达6周之久，且果汁的原有风味绝无改变。（4）番茄汁：70 mg/kg浓度的纳他霉素对番茄汁有很好的防霉保鲜效果。3.1.6 在其他食品中的应用1999年, Ciriliano-MC等16人报道,纳他霉素用于茶饮料，也可以有效防止真菌腐败，并给予茶饮料更加可接受的感官特性。纳他霉素在年糕和馒头中使用，也可防止霉变，有效地延长货架期17。纳他霉素还可以应用在一下几种食品中：（1）沙拉酱：沙拉酱是一种高脂肪食品，每年入夏以后品常有霉变发生。文献报道沙拉酱中加入10ppm纳他霉素，试验期间未发现变质现象，微生物数量无显著变化。沙拉酱与乳酪相似，脂肪含量较高，试验说明纳他霉素对高脂肪食品抑菌效果确切。（2）酱油：在室温较高的夏季，在酱油中添加l5ppm的纳他霉素，可有效抑制酵母菌的生长与繁殖，防止白花的出现。将纳他霉素和乳酸链球菌素结合起来应用于酱油防霉，可以更有效的抑菌，并降低抑菌浓度。（3）蚝油：是一种风味独特且营养丰富的调味品，容易腐败，对它的口感要求也较高。通过实验检验纳他霉素对蚝油的防腐作用,结果表明，当使用浓度在15mg/kg时就能使蚝油保质期达4个星期以上,而且口感和风味均无变化13。（4）其他：在食醋等调味品中，使用的纳他霉素，可防止霉菌和酵母菌引起的变质。在啤酒、葡萄酒中，2.5mg/kg的纳他霉素可使保质期大大延长。在年糕和馒头中的使用，可防止霉变，有效地延长货架期。3.2 在农业与畜牧业中的应用纳他霉素除了用作食品防腐剂外，还可作为饲料添加剂及生物农药在畜牧业与农业中应用。如 2004年美国医药与食品管理局（FDA）批准，在青贮饲料中添加纳他霉素以防治家禽真菌病。3.3 在医疗领域的应用近年来，关于将纳他霉素用于医疗的相关研究逐渐增多，其临床应用范围也越发广泛。纳他霉素以悬浮剂、乳剂、软膏和鞘状药片等剂型被用于抗皮肤和黏液膜的真菌感染，既可以单独使用，又可以与新霉素、氢化可的松及其他类固醇药物共同使用。同时，由于纳他霉素的抗真菌作用同制霉菌素相似，因此，临床上也用于治疗肠道、口腔、阴道的念珠菌感染，呼吸系统、眼、皮肤、指甲真菌及阴道滴虫感染等。此外，纳他霉素还成功地用于真菌性角膜炎的治疗。Jani等18报道了综合用纳他霉素和崔西杆菌抗生素油膏治疗真菌性眼角膜溃疡的病例。Thomas19将纳他霉素溶液单独局部用于眼角膜，发现其对由丝状真菌引起的角膜炎也有明显的治疗效果，且最佳溶液使用浓度为5%。4 提高纳他霉素发酵产量方面的研究4.1提高产量的主要方法提高产量的方法主要有(1)菌种改良(2)培养基优化(3)发酵工艺优化(4)微生物共培养 (5)添加诱导子。4.2 诱导子的筛选：4.2.1真菌种类的选取以灰霉葡萄孢菌（Botrytiscinerea）、黑曲霉（Aspergillus niger）、番茄白粉病菌（Erysiphe polygoni DC）、黄绿青霉菌（Penicillium citreoviridin）、产黄青（Penicillium chrysogenum Thom）、酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）和米曲霉（Aspergillum oryzae）等作为诱导菌株，考察对纳他霉素的促进作用，筛选出具有正向调节作用的诱导子。4.2.2真菌诱导子的制备 4.2.2.1真菌菌体诱导子制备方式：将灰霉葡萄孢菌、黑曲霉、番茄白粉病菌、黄绿青霉菌、产黄青霉、米曲霉斜面孢子用无菌水洗至装有玻璃珠的三角瓶中打散、过滤制成孢子悬液，使孢子浓度达到108个/mL。孢子悬液按2%接种量接种于液体种子培养基中，酿酒酵母接一环于种子培养基，28、180r/min分别培养至对数期，所得相应制备物为真菌菌体诱导子制备物。4.2.2.2真菌细胞诱导子制备方式：将7种真菌分别接种于恰塔努加链霉菌种子培养基中，在28、摇床转速200r/min条件下培养至稳定期，待各菌丝体充分生长后，用6层纱布过滤得菌丝体，用重蒸水洗涤3次后匀浆，121灭菌20min，所得相应制备物为真菌细胞诱导子制备物。4.2.2.3真菌代谢产物诱导子制备方式：将制备方式二所得滤液，于12000r/min，离心20min后所得制备液于4冰箱内保存，使用前用0.22m微孔滤膜过滤除菌，所得相应制备物为真菌代谢产物诱导子制备物。4.3实验主要的技术路线：配置培养基菌株的活化种子培养发酵培养发酵12h时添加真菌诱导子提取检测4.4纳他霉素分析检测的研究进展目前，纳他霉素的分析方法主要有生物检测法、紫外分光光度计法、高效液相色谱法、比色分析法、元素分析法及滴定分析法等。4.4.1生物检测法纳他霉素效价的生物检测法主要采用管碟法。管碟法利用抗生素在琼脂培养基中的扩散渗透作用，将已知浓度的标准溶液和未知浓度的样品在含有敏感性实验菌的琼脂表面进行扩散渗透，由于对被试菌的抑制作用而产生抑菌圈，抑菌圈的大小和抗生素的浓度之间有一定的比例。这个方法利用抗生素抑制敏感菌的特点，符合临床使用的实际情况，而且灵敏度高，不需特殊设备，被国际公认22,23。4.4.2紫外分光光度法采用紫外分光光度测定法，在303nm处可以测定纳他霉素的含量，称为一点法，但该方法不能精确定量纳他霉素的生物活性。依据在303nm的最大吸收值，以及在29 nm和311nm的吸收值，可以测定纳他霉素的含量，该法称为基线法24。4.4.3高效液相色谱法高效液相色谱(HPLC)法由于其操作简便、精密度高，因此广泛地用于检测食品中残留纳他霉素的含量。高效液相色谱(HPLC)法检测纳他霉素广泛采用C柱、反相柱，纳他霉素在303nm处有最大吸收峰，所以检测器采用 UV 检测器25,26纳他霉素的分析干扰因素较多，其中分光光度计法、比色法和滴定法较为简单，但是结果不能排除干扰因素的影响，难以精确定量；微生物分析法较为直观，操作也不复杂，易于在实验室实现；高压液相色谱法测定的结果较为准确，一次性设备投资较大。5 纳他霉素未来发展前景的展望行业发展的前景分析：相比国外发展纳他霉素产业的条件而言，在我国生产纳他霉素的原料丰富、价格低廉，且人力资源与成本也较发达国家具有明显的优势，近年来国内企业在发酵工艺以及分离提取工艺方面也有了长足的进步，产量与回收率正在逐渐接近国际先进水平。再加上国家对于食品添加剂行业以及生物制造产业给予政策上的大力支持，为发展乳酸链球菌素和纳他霉素等生物源食品防腐剂提供了诸多有利条件15。近年来，以乳酸链球菌素、纳他霉素为代表的生物防腐剂因其高效、安全、无毒、无残留等特点正在受到全球市场的青睐，大有逐渐替代化学防腐剂的趋势。因此，有理由相信，随着今后纳他霉素应用范围与应用程度的不断拓展，国内生产企业在发酵工艺、提取工艺、质量管理、应用研究等方面不断提高技术水平，加之行业监督、管理制度的不断完善，该产业必将有着巨大的发展空间与市场前景。健康的特点而备受人们的关注。由于其优良的抗菌性能,在其他领域如医药、饲料作为等领域,也有着越来越多的研究。如在医药领域,现已有将纳他霉素制成霜剂或软膏用于临床治疗手足癣、股癣等皮肤真菌感染疾病、真菌性眼角膜溃疡等先例。相信随着研究的进一步深入,纳他霉素的应用范围还可以继续扩大,以使其发挥更大的作用。 6 结论随着科技的进步，人们对防腐剂的要求将趋于严格化，以纳他霉素为代表的高效的、安全的生物防腐剂必然在食品工业中占有越来越重要的地位。食品工业的研究者不断进行研究，力求在食品安全上达到让人们放心、满意的程度。研究促使纳他霉素产量提高，降低成本，可以推广其应用，具有十分重要的意义，在未来的市场中将占有广阔之地。参考文献：1冯丽莎 食品化学防腐剂与纳他霉素的协同抑菌作用分析 J.2012（1）2 Harry BrikH . 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