实验三 电子光谱法研究二氯邻菲咯啉合铜与DNA相互作用研究.doc

实验三 电子光谱法研究二氯邻菲咯啉合铜与DNA相互作用研究 一实验目的 1.1 了解研究金属配合物与DNA相互作用的原理和意义 1.2 掌握研究金属配合物与DNA相互作用的光谱法实验技术 1.3. 掌握相关研究方法的实验数据的处理方法 1.4. 熟悉紫外-可见光谱仪的工作原理及基本操作 二 实验原理 2.1 DNA是生物体中重要的一类生物大分子,对于生命遗传密码的翻译、转录、复制起着非常重要的作用。为了进一步探索和认识DNA的性质、结构、行为、形态, 揭露生命之奥秘，人们研究了大量金属配合物与DNA 的反应。同时探测DNA 的结构和构象，探讨金属配合物与DNA作用的反应机理, 进而研究金属配合物的分子结构和与DNA反应机理的关系, 也可以为筛选出新的生物学研究工具, 设计合成出具有应用前景的低毒、高效、抗菌、抗肿瘤药物提供一定的科学研究基础及理论根据2.2小分子与DNA相互作用能改变的结构和性质，改变细胞的代谢方式和生长速度，有时甚至终止细胞生长，因此，与DNA相互作用的小分子可作为DNA的结构探针和化疗试剂。DNA结合试剂主要以两种方式与其靶分子相互作用：(1)结合在的大、小沟中，静电疏水、相互作用及氢键能稳定这种结合方式，如Cu(phen)22+、阳离子金属卟啉及有机抗癌药物等以这种方式和DNA结合；(2)插(嵌)入到DNA的碱基对之间，如EB及抗癌药物顺铂等。无论那一种方式均可能导致DNA结构畸变、解链，甚至断裂。各种光谱方法和分子生物学方法可用于表征小分子与DNA相互作用，如紫外-可见光谱学方法、荧光光谱法测定Cu(phen)22+与DNA的相互作用 2.3紫外-可见吸收光谱法是研究药物与DNA相互作用机理最为常用、方便的方法。DNA的碱基具有光学活性，在260 nm处具有最大吸收峰，同时许多药物小分子也具有光学活性，当它们与DNA结合后，对DNA或药物小分子的吸收谱都会引起变化，如吸收谱带变宽、红移(蓝移)效应和减色(或增色)效应。通过这些变化可以判断两者的作用方式。配合物的MLCT(中心离子与配体之间的电荷跃迁)吸收峰的强度在有DNA存在时有一定减少，这通常被认为是插入作用的特征之一。通过对配合物Q (Q=10-5mol/L)与不同浓度DNA混合后的紫外光谱研究可以发现，DNA对配合物特征吸收峰有减色效应(MLCT)。由不同摩尔比的配合物与DNA作用后在190nm500nm区间内的紫外吸收光谱图可见，配合物与DNA作用后吸收光谱发生减色，吸收峰有轻微的红移，说明配合物与DNA发生了作用，且为插入式键合 配合物与DNA的结合常数Kb可以通过下列方程求出： DNA /( f -a) = DNA/(f b)+ 1/Kb (f b) （1） 式中DNA表示DNA 的浓度, a, f, b 分别代表配合物Q的表观摩尔消光系数Aobsd/Q，自由配合物的摩尔吸光系数和完全结合后的配合物的摩尔吸光系数(=267nm)。以DNA/( f a)对DNA作图，斜率与Y轴的截距的比值即为结合常数Kb。结合常数Kb越大，说明配合物Q与DNA的相互作用越强三、实验仪器与药品 3.1. 仪器 紫外-可见光谱仪、小烧杯、容量瓶、样品袋、10mL比色管1套、冰箱、电子天平3.2. 试剂 3.2.1 NaCl、Tris、盐酸、小牛胸腺 DNA、二次蒸馏水 3.2.2缓冲溶液：5mmolL-1 Tris-HCl溶液( 内含50mmolL-1 NaCl , pH 7.4) ：称取5 mmol（0.6055g）的Tris和50 mmol的NaCl（2.922g）固体溶解于1L水中，再用1 molL-1的盐酸溶液将上述溶液pH调至7.4备用；配合物、DNA均用该缓冲液配制溶液 四实验步骤 4.1DNA溶液配制 （1学时） 称取适量的小牛胸腺 DNA 溶于缓冲溶液中，抽滤，滤液按需要稀释至一定浓度，测量260 nm 和280 nm 处吸光值，若A260/A280 = 1.8 1.9，说明基本上不含蛋白质，不需要进一步处理。DNA 浓度以碱基对的摩尔浓度计，测量DNA在260 nm处的吸光度，然后根据260 nm处的摩尔吸光系数6600 Lmol-1cm-1 计算DNA 的浓度。测量DNA 吸光度时，如DNA浓度过高，可导致测量不准，一般应稀释到A在0.5 1.0 之间较为合适。配制好的DNA溶液应置于冰箱中保存备用。 DNA=KA260/6600 (molL-1) 其中K为稀释倍数。为了保证实验的可靠性，配制的DNA溶液在一周内使用4.2用紫外-可见吸收光谱(UV-vis)测定Cu(phen)2Cl2与DNA相互作用 （本实验采用方法一） 4.2.1 方法一：采用缓冲体系为50mmol/LNaCl，5mmol/LTris-HCl的溶液，pH为7.2配合物(C配合物=10-5 molL-1)与不同浓度DNA（CDNA/C配合物 =0，1.0，2.0，4.0，6.0，8.0，10.0，12.0)混合，室温反应30min，然后以同浓度DNA溶液做参比，测定不同摩尔比的配合物与DNA作用后在190nm500nm区间内的紫外吸收光谱； 方法二：在紫外可见光谱仪中，参比池中放3.00 mL 缓冲液，样品池放置同样体积的1.010-5 molL-1的配合物溶液。用微量加样器每次往参比池和样品池中加入相同体积的DNA储备液（此处DNA储备液的浓度为1.010-2 molL-1），依次为0、3、6、12、18、24、30 、36、L，使DNA于配合物浓度比值不断增加，直至饱和，吸收峰不再减色每次加入溶液后混合均匀, 在室温下（记录室温）作用5min , 记录190nm500nm区间内的紫外吸收光谱；4.2.2 根据实验数据绘制图形，计算出配合物与DNA的结合常数Kb、并初步判断配合物与DNA的作用类型五数据处理5.1 二氯邻菲咯啉合铜与不同浓度的DNA相互作用紫外光谱图： 5.2 以DNA /(f -a) 对DNA作图得：线性拟合：Y = 3.68003X + 6.6237 10-4 R2= 0.7823结合常数 Kb = 3.68003 / 6.6237 10-4 = 5555.9六结果讨论与分析6.1通过对配合物Q (Q=10-5mol/L)与不同浓度DNA混合后的紫外光谱图可以发现，随着DNA浓度的不断增加，最大吸收波长处吸光度值不断减小，配合物特征吸收峰有减色效应，且吸收峰有轻微的红移，说明配合物与DNA发生了作用，且为插入式键合；6.2 DNA /(f -a) 对DNA作图拟合得曲线线性关系较差，可能的原因有：温室下反应时间超过了30min，发现反应时间太长会使得图谱峰变小；加入的溶液体积由移液管移取，不够精确；混合不均匀，影响了反应过程；七思考题1. 研究小分子与DNA的相互作用还有哪些方法？简单介绍这些方法的原理答：荧光光谱法：小分子与DNA作用后荧光偏振的变化情况是判断小分子是否与DNA发生嵌插作用的标准之一。通常当小分子嵌插到碱基中时，其转动受阻，荧光偏振度会随之变大，而非嵌插作用不会引起荧光偏振度的增大；圆二色谱法：在研究小分子与核酸相互作用时，一方面根据DNA在250 nm处的吸收提供有关结构信息，另一方面对一些本身没有CD信号，但与DNA结合后能产生诱导CD信号的分子，可获得一定的有关其结构的间接信息，特别是利用卟啉及卟啉配合物作CD探针，可以得到蛋白质、核酸等生物大分子空间结构的相关信息；红外光谱法：红外光谱可以提供有关物质结构的数据，反映出分子间相互作用的信息，因此，在小分子与生物大分子相互作用检测中也较为常见，但水的强烈吸收而限制了红外光谱法对生物组织水溶物质的研究；共振光散射技术和表面等离子共振：它是基于染料与生物大分子结合形成尺寸大、吸光系数大的聚集态，此聚集态的复合体系导致很强的染料共振光散射信号，并且共振光散射信号与生物大分子的浓度呈现线性关系。该技术的测定灵敏度很高，可达ng级水平，利用共振散射信号还可以推导出有机染料与生物大分子的结合数目，已成功地应用于蛋白质分析和核酸分析；电化学方法：利用电化学方法对分子间相互作用进行检测，可以研究形成非共价复合物的整个电子转移过程，可以指示分子间作用力的大小，揭示许多生物现象和药理作用；核磁共振分析法（NMR）：NMR技术能获得接近生理状态下生物大分子溶液的三维结构信息及其动力学行为，可以定量确定结合位点的化学变化，并且对长距离驰豫效应更为准确，其中杂核多维NMR方法提供的结构信息量最大，复杂程度也最高；2研究药物分子与DNA相互作用有何意义？答：DNA与其他能识别特定碱基序列的小分子(如各类金属离子、金属螯合物、小分子物质, 尤其是药物分子等)相互作用的研究, 有助于人们了解某些分