粉葛的组织培养和成苗和快繁研究.doc

11粉葛的组织培养和成苗技术研究摘要：目的 以粉葛顶芽和带芽茎段为材料，进行无菌系的建立，成苗，生根等试验，探讨粉葛组培成苗技术。结果 表明：1）以MS + NAA 0.1mg /L + 6-BA 0.3mg /L为培养基，获得的无菌苗生长健壮，枝叶繁茂，是成苗培养的最适培养基。2）最佳不定根诱导培养基为MS + NAA 0.3mg/L + IBA 0.3 mg /L，生根率达100%，低浓度的NAA能有效促进不定根数量的增多，主根增粗，增长，增多等作用。结论 为粉葛的快速繁殖和脱毒研究和中草药产业技术提供重要的后期研究基础。关键词：粉葛; 组织培养; 成苗; 生根Study on the seedling technology and tissueculture of Radix PuerariaeAbstract: Objective This study is that making a test about survival and rooting by use the material of the terminal bud and stem segments with buds, establishing The aseptic Department, exploring the Pueraria thomsonii tissue culture seedling Result show that:1)take MS + NAA 0.1mg /L + 6-BA 0.3mg /L as medium, to get No-vaccine robust growth, lush foliage,which is optimal medium for seedling cultivation. 2)The Best adventitious root induction medium for MS + NAA 0.3mg/L + IBA 0.3 mg /L, Rooting rate of 100%, The low concentration of NAA is effective in promoting adventitious root number increased, the role of Taproot thickening, growth, and increasing. Conclusion This study would provide important post-research base for the rapid propagation of Pueraria thomsonii and virus free studies and Chinese herbal medicine industrial technology.Keywords: Pueraria thomsonii; Tissue culture；Into seedlings；Rooting目录1前言11.1粉葛的概况11.2粉葛成苗的研究进展和意义22材料与方法22.1实验材料22.2培养方法22.3外植体的消毒22.4无菌苗的获得22.5成苗培养32.6生根培养33结果与分析43.1不同植物生长调节剂对成苗的影响43.2不同植物生长调节剂对粉葛试管苗生根的影响64讨论与结论84.1植物生长调节剂对成苗培养的影响84.2植物生长调节剂对诱导生根的作用84.3结论9参考文献10致谢11粉葛的组织培养和成苗技术研究1前言1.1粉葛的概况粉葛是豆科（Leguminosae）葛属（PuerariaDC.）植物甘葛藤（Pueraria thomsonii Benth.）的干燥根1。葛始载于神农本草经,列为中品,历代医药著作均有记载,而神农本草目2对葛的记载更为详细:“葛有野生,有家种.其蔓延长其根外紫内白,长者七、八尺。其叶有二尖，如枫叶而长，面清背淡。其花成穗，叠叠相缀，红紫色。其荚如小黄豆荚，亦有毛，其子绿色，扁如盐梅子核，生嚼腥气，八九月采之。”肖培根等（2002）报道，葛属植物的块根含黄豆苷元（大豆苷元，Daidein）、黄豆苷（Daidzin）、葛根素（Puerarin）、黄豆苷元8-O-芹菜糖（16）葡萄糖苷及黄豆苷元-4,7-二葡萄糖葛根素等，前三种成分是葛根的主要有效成分3。近年来科研资料陆续报道，还有3-羟基葛根素、3-甲氧基葛根素、芒柄花素（Formonetin）、金雀异黄素（染料木素，Genistein）、葛根苷（Pueroside）A、B、C、槐花二醇（Sophoradio）、葛根皂苷元（Kudzusapogeno）A、B、C等。 粉葛（P.thomsonii Benth），又名葛藤、葛根（广东、广西）、葛麻藤（广西、云南）等，藤本，茎枝被黄褐色短毛或杂有长硬毛。根肥大，3出复叶，其长柄；托叶被针尖状长椭圆形，有毛;小叶片菱状卵圆形，有时3裂，长921cm,宽818cm，先端短渐尖，基部圆形。总状花序，小苞叶卵形；花萼钟状，长1.21.5cm,萼齿5，披针形，较萼齿长，被黄色硬毛；花冠紫色，长1.31.8cm。荚果长椭圆形，扁平；长1012cm,宽11.2cm，密被黄褐色硬毛。花期69月，果期810月。种子肾形或圆形4、5。栽培或野生山野灌木和疏林中，有很长的栽培历史。分布于广东、广西、江西、云南，印度、克什米尔地区、越南也有分布。花可入药，称葛花，解酒、醒脾、止便血，用于酒醉，便血。根亦可食用。粉葛是一味常用中药，性甘、辛、味凉，具有解肌退热，生津透疹，升阳止泻的功用。用于外感发热头痛，口渴，消渴，麻疹不透，热痢，高血压劲项强痛1。总黄酮为粉葛主要活性成分，现代研究表明，粉葛总黄酮能改善冠脉，降低血压，使冠脉血流量明显增加，对血管平滑肌有明显的松弛作用，可降低外周阻力，对改善正常心肌和缺血梗塞心肌的代谢均有良好的作用，还具有提高学习、记忆、抗氧化，抗癌等作用3。 粉葛的肥大块根加工后成葛粉，含多种维生素、蛋白质、膳食纤维、多种微量元素及氨基酸，为优良淀粉原料和羹汤糊料。近年来，野生葛粉已成为人们青睐的保健食品。葛藤的纤维可以用于纺织地毯、壁毯、麻绢等产品，与蚕丝媲美，其色泽、牢固度、弹性、耐磨性和印染着色度均优。葛藤的嫩枝和叶、根都是高能量、高蛋白的多叶型饲料，牲口的适合性好6。1.2粉葛成苗的研究进展和意义目前，葛属的组织培养工作已有初步进展。于树红7、施和平8等已通过不同的外植体诱导野葛愈伤组织培育出野葛的再生植株，并得到愈伤组织和愈伤组织分化的最适配方。至今，粉葛已成为重要的药用植物，粉葛的产业化规模化进程也日益加快，对优质种苗的需求也迅速增加，而粉葛压藤繁殖和生产上挖大留小的传统无性繁育方式在着繁殖系数低、种苗携带病毒等问题并已经影响到我国粉葛产业的快速发展。离体培养具有繁殖速度快、脱出病毒等优点，是粉葛快速繁殖育苗的优选手段，因此研究粉葛快速繁殖育苗技术势在必行。2材料与方法2.1实验材料 采自韶关田间当年生、健壮的枝条上的顶芽或带芽茎段为外植体。2.2培养方法 培养基为MS基本培养基，3%蔗糖，用0.7%的琼脂固化，PH5.86.0,121湿热灭菌20min。2.3外植体的消毒取外植体用自来水加洗涤液浸泡30m in, 自来水冲洗30min。然后转入超净工作台内, 用75% 酒精消毒20 30 s,0.1% 升汞灭菌8 10 m in, 无菌水冲洗3 5 次。2.4无菌苗的获得 取已消毒的外植体接种于培养基M S + NAA0.1mg /L (单位下同)+ 6- BA0.2上,在光照培养室25的条件下进行无菌苗的培养， 30- 40d后获得无菌苗。2.5成苗培养将无菌苗切下茎长0.5cm带芽茎段，接种于下表的培养基中进行成苗培养，各处理接种10株无菌苗，设置三次重复。各处理方案如下表1：表1 成苗实验操作的各处理方案培养基植物生长调节剂（mg/L）NAA6BAMS0.10.30.50.70.90.10.10.10.30.10.50.30.10.30.30.30.50.50.10.50.30.50.510.12.6生根培养将成苗培养获得的幼苗切除愈伤组织后接入生根培养基中进行生根培养，基本培养基为MS，添加不同浓度水平的IBA，NAA进行试验，各处理均接种10株，设置3次重复。各处理方案如下表2：生根率=生根的无菌苗（根长超过0.5cm的幼苗）株数/原接种无菌苗株数生根条数=所有生根数/生根株数表2 生根实验操作的各处理方案培养基植物生长调节剂（mg/L）NAAIBAMS0000.5010.30.30.30.60.30.90.60.30.60.60.60.90.90.30.90.60.90.93结果与分析3.1不同植物生长调节剂对成苗的影响在只添加有梯度浓度的NAA的培养基处理中（实验处理编号15），低浓度的NAA（0.1）促进芽的萌发，可成苗，苗矮小健壮，枝叶短小，基部出现褐色愈伤，随着NAA浓度的升高，外植体芽没有萌发和明显的伸长现象，当NAA浓度到达0.5以上时出现生根，所以低浓度的NAA促进芽的萌发生长。分析NAA和6B-A组合的实验处理（实验编号615），低浓度的NAA（0.1）与低浓度的6-BA（0.1,0.3）组合能很好的促进芽的萌发，外植体的生长情况是：10d后，芽萌发成小叶，基部出现愈伤，20d后，小叶展开变宽，枝叶也都伸长，30d后，都能成苗，但在NAA/6-BA（0.1/0.3）的培养基中的苗明显增高，枝长叶宽，茎节增长（见图1），所以低浓度的NAA与6BA组合促进成苗。随着NAA和6-BA浓度升高，只见愈伤的增值，外植体并没有成苗。见实验处理15，高浓度的NAA和低浓度的6BA组合，高浓度的NAA并没有促进茎的增长的效果，只是更加促进愈伤组织的增值。在低浓度的NAA培养基中，随着6-BA浓度升高，0.5以上时，出现芽的增多现象，可见高浓度6-BA抑制了芽的萌发，促进芽的增生，所以低浓度的NAA和高浓度的6-BA组合表现为芽增多，芽的萌发受到抑制，也难以成苗。故在成苗培养中应使用低浓度的NAA和低浓度的6-BA搭配，但6-BA的浓度不易超过0.3和小于0.1，两者的组合效果好于单加NAA的培养效果。从实验结果看来，在MS+NAA0.1mg/L+6-BA0.3mg/培养基中做成苗培养，可以获得较高、枝叶茂盛，叶色正常的无菌苗，适合下一步生根培养。表3 不同植物生长调节剂对成苗培养的影响编号生长调节剂（mg/L）苗的长情况基部NAA6-BA苗高（cm）叶数叶宽（cm）状态根愈伤大小颜色状态10.100.960.6叶小枝短小褐结实20.300.500没有成苗小褐结实30.500.500没有成苗小褐结实40.700.500没有成苗小褐结实50.900.500没有成苗小褐结实60.10.10.860.5叶小枝短小褐绿结实70.10.32111.2枝繁叶茂中褐绿结实80.10.50.500芽增多大褐绿结实90.30.10.500没有成苗中褐绿结实100.30.30.500没有成苗中褐绿结实110.30.50.500没有成苗中褐绿结实120.50.10.500没有成苗大黄绿疏松130.50.30.500没有成苗较大黄绿疏松140.50.50.500没有成苗较大黄绿疏松1510.10.500没有成苗较大褐绿结实图1 试管苗3.2不同植物生长调节剂对粉葛试管苗生根影响在不添加任何植物生长调节剂的MS培养基中，无根的幼苗不能诱导生根，由此可见，在只有无机盐的MS培养基中粉葛幼苗并不能诱导出根。在加入了1mg/L IBA培养基中，10d后无菌苗开始萌动生根，30d后，根长到达2cm以上，从处理编号2、3实验看来，IBA的浓度由0.5跳到1时，随着IBA浓度提高，并没有出现较多的不定根，而低浓度的IBA，出现弱根现象。在含有NAA 0.3mg/L 的培养基中，710d基部出现白色的组织和小根尖，1316d后，根长均长1cm，20d后，根长均长1.5cm，并出现少量须根，30d后，根长达到3cm以上并出现较多的须根（见图2）。加入NAA后，把处理编号3与4、5、6实验比较，只要加入较低浓度的IBA就能提高生根率，而且根明显变粗，主根变长和数目也增多，须根也增多，但随着NAA浓度升高到0.6,0.9时，出现主根变邹，须根也减少现象，同时无菌苗的基部出现大量愈伤组织，而愈伤组织的出现也会大大降低无菌苗移栽后的成活率，原因是不定根着生在愈伤组织之上，而与茎部没有形成良好的疏导组织。分析处理编号4、5、6实验,加入低浓度的NAA后，随着IBA浓度的提高，同样出现弱根，皱根，基部愈伤的现象。故生根培养基中高浓度的NAA和IBA加入根的生长状况差，较低浓度的NAA促进不定根的生长主根增长，从表4可见，较低浓度的NAA与IBA组合NAA 0.3mg/L + IBA 0.3 mg /L是粉葛无菌苗诱导生根的最适培养基条件。表4 不同植物生长调节剂对试管苗生根影响编号生长调节剂（mg/L）根的生长情况愈伤植株的生长情况NAAIBA生根率（%） 根粗（cm）主根均长（cm）主根均数须根均数根色状态10000000无长势良好苗枝健壮200.550.1120白弱无长势良好301500.12.440白正常无长势良好40.30.31000.33.868褐白健壮无长势好枝叶伸长50.30.6800.2339褐白弱一点点长势一般60.30.9800.34813褐白皱少数球状长势一般70.60.3800.21.451褐白弱多数球状长势差80.60.6800.3273褐白皱多数球状长势差90.60.9800.3255褐白皱多数球状长势差100.90.3800.3285褐白皱多数球状长势差110.90.6800.33101褐白皱多数球状长势差120.90.9800.3492褐白皱多数球状长势差图2 生根4讨论与结论4.1植物生长调节剂对成苗培养的影响由于要成苗，首先要促进芽的萌发，接着是要长成叶，然后是促进枝叶的伸长，让苗的长势好，健壮生长。培养基激素的组合的选取是决定植物组织培养成败的关键因素。细胞分裂素有促进细胞的分裂和分化、延迟组织衰老、增强蛋白质组合、抑制顶端优势、促进侧芽生长及显著的改变其他激素作用的特点。生长素影响到茎和节间的伸长、向性、顶端优势、叶片脱落和生根等现象。其中两者浓度高都抑制了芽的萌发。所以，一般采用较低的生长素和细胞分裂素浓度比例，达到较好的组合效应，促进芽萌发，茎枝叶的伸长，旺盛生长。本实验发现：MS + NAA0.1mg/L+6-BA0.3mg/L是粉葛成苗的最好的培养基。借鉴本实验的生根配方，可以同时加入0.10.3mg/L的IBA，尝试成苗成根一步到位。4.2植物生长调节剂对无菌苗诱导生根的作用根的形成从形态上可分为两个阶段：根原基的生长和伸长和不定根原基的形成。在没有添加任何激素的培养基中并没有根生长，在加入生长素IBA的培养基中有主根的生长，在加入低浓度的NAA（0.3mg/L）和IBA（0.3mg/L）的培养基里，主根根长和根数增多，须根增多，明显增粗的生长现象，这充分说明生长素促进根原基的形成和增长。当生长素的浓度高于0.3mg/L时，根的生长受到抑制，表现为促进愈伤组织的生长，所以，过高的生长素浓度可能会促进愈伤组织形成，对粉葛而言，低浓度的NAA（0.3mg/L）和IBA（0.3mg/L）组合诱导不定根的效果强于单用IBA。以后可以