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分子生物学进展主要授课内容及思考题专题一: 细胞周期及其调控问答题:Cyclin,CDK及CKI在细胞周期进程中是如何发挥作用的?专题二: 细胞凋亡问答题:试述细胞凋亡的分子机制专题三: 癌及抗癌问答题:试述原癌基因活化机制及抗癌基因的作用参考书:来茂德主编,医学分子生物学，人民卫生出版社1999（卫生部规划教材，研究生教材）专题四糖生物学一 概述：研究历史 研究内容及发展 与医学的关系二 复合糖类：1 蛋白聚糖： 组成与结构生理功能病理时的变化 2糖蛋白： 组成糖链与蛋白的连接方式糖化过程及特点生物功能研究寡糖链的常用方法与疾病的联系糖生物学 (Glycobiology)糖复合物glycoconjugate糖类与蛋白或脂类形成共价结合物。一 研究历史5060年代以前，其研究仅限于（寡多）糖的化学组成和一般结构测定，基本属于有机化学范畴。70年代后，研究逐渐活跃，至80年代中、后期到90年代初，飞速发展，发现糖类在生物体中不仅是能源及结构成份，而且担负极为重要的生物学功能。现认为，糖复合物中的糖链是生命科学中肽链、核苷酸链之外具有重大生物意义的第三链，其研究已成为继蛋白、核酸之后探索生命奥秘的第三里程碑。具有相同残基数的寡糖与肽和寡核苷酸相比更为复杂，包含有更多信息（例如：4肽有数十种异构体，4糖基理论上有三万种异构体）。越多的事实证明，糖复合物中的寡糖是体内重要的信息分子，在分子识别中起举足轻重的作用， 形成一新兴学科。二 研究内容1 结构：无模板合成使研究进展落后，近年来，测定技术飞速发展，HPLC、荧光标记、CE等，提高分辨率、灵敏度。2 酶：内、外切糖苷酶，糖基转移酶可研究各糖基功能。改造，“糖工程学”应运而生，糖蛋白药物。3 代谢：糖复合物合成步骤基本弄清，各种酶在细胞内定位也大致了解。目前，糖基转移酶的调控研究正在兴起。4 凝集素：一类能识别糖链结构的蛋白（非酶及Ab），为工具，在研究上各学科相互渗透：物理、化学、生化、药理、分子生物学 三 与医学关系1 “细胞颜面 ”，糖被、植被，传递信息、受体，每个红细胞表面50万个糖蛋白、表面唾液酸（负电），避免在血管内粘付。2 （1900，Landsteiner发现血型，世界大战抢救伤员，获1901年诺贝尔奖） 各型的抗原决定簇差异为糖链非还原末端糖基，AN-乙酰氨基半乳糖，B半乳糖，O无此末端糖基。3 糖链改变，可产生自身抗体， 自身免疫性疾病。85年发现类风湿病人IgG糖链半乳糖少于正常。4 恶性肿瘤的恶性行为（侵袭、转移等）与其细胞表面糖复合物的组成、结构密切相关。5 病原微生物的感染有种属与组织专一性，取决于微生物表面的凝集素对细胞表面不同糖链的识别。6 神经系统富含脂类，糖脂为重要成分，如Alzheimer病脑灰质或白质中神经节苷脂明显减少。四 研究进展糖生物学是生物化学与生物医学交叉点的前沿。美国：86年，能源部成立复合糖类研究中心。糖工程会议2年。日本：89年，创立杂志糖科学与糖工程动态；91年，投资百亿日元实施“糖工程前沿计划”。欧洲：94-98年，有“欧洲糖类研究开发网络计划”。我国此方面研究起步较晚，但发展迅速，队伍日益扩大，国防交流不断加强。复 合 糖 类复合糖类：（1） 蛋白多糖：含糖多 （2） 糖蛋白：含蛋白多 （3） 糖脂蛋白聚糖 (proteoglycan，PG)以糖为主，糖可占90-98%。糖胺多糖（glycosaminoglycan, GAG，以前也称粘多糖）为二糖单位，重复连接组成的无分支多糖链，二糖中必有一种为氨基糖（氨基葡萄糖或氨基半乳糖：乙酰化），另一种为糖醛酸（葡萄糖醛酸或艾杜糖醛酸）。糖胺多糖多含有硫酸。已知有六种糖胺多糖：透明质酸(hyaluronic acid,HA)硫酸软骨素(chontroitin sulfate,CS)硫酸皮肤素(dermatin sulfate,DS)硫酸角质素(keratan sulfate,KS)硫酸乙酰肝素(heparan sulfate,HS)肝素(heparan,Hep)（一） 蛋白聚糖的结构1. GAG：（1）HA：葡萄糖醛酸+乙酰氨基葡萄糖(GlcUA-GlcNAc) 结构最简单的 GAG，|13| -1，4 不含硫酸，HA分子量大，可达1000万（2万5千个重复二糖）。生理溶液中，为多聚阴离子，(-COOH),分子相当刚硬，呈无规扭曲团状。分子间可交织形成网络。一些蛋白可以特异地非共价作用与HA结合。（2）CS及DS：CS：葡萄糖醛酸+乙酰氨基半乳糖(GlcUA-GalNA) DS：艾杜糖醛酸+乙酰氨基半乳糖(idoUA- GalNA)CS单个糖链分子量小于10万（250个重复二糖），DS实际上是CS的一种修饰形式。（由酶催化使D-葡萄糖醛酸转变为L-艾杜糖醛酸）（3）KS: 半乳糖+乙酰氨基葡萄糖(Gal- GlcNAc)单个KS很少大于4万（80个重复二糖），无糖醛酸。（4）HS及Hep: 2. 核心蛋白：与GAG共价结合的蛋白。a,丝甘蛋白聚糖：核心蛋白最小的GAG，存于造血细胞及肥大细胞。b.饰胶蛋白聚糖：可修饰胶原蛋白，MW=3.6万的核心蛋白，调节结缔组织形成。c.粘结蛋白聚糖：3.2万的核心蛋白，其细胞外结构域可连接GAG链。d.可聚蛋白聚糖：核心蛋白22.5万25万，为软骨中主要结构大分子。除HA外，所有GAG均是以共价连接在核心蛋白上，寡糖分布在核心蛋白的不同区域，形状似“瓶刷”。（二）蛋白聚糖的生理功能蛋白聚糖主要为结构成分，分布于软骨、结缔组织、角膜等基质内，其密集的负电荷可以吸入大量水分子，构成凝胶，起机械保护作用，“筛子”阻止细菌。其次为关节的润滑液、眼的玻璃体和粘液，起润滑作用，故以前称为粘蛋白。正常动脉壁含丰富的透明质酸、硫酸软骨素、肝素，以蛋白多糖的形式覆盖于内皮及平滑肌细胞表面，填充间质，维持血管结构通透性、弹性。硫酸肝素可嵌入细胞质膜的核心蛋白，连于膜表面，在细胞生长、细胞通讯、细胞与环境的识别中起作用。 (1) HA(2) 可聚蛋白聚糖(3) 多能蛋白聚糖(4)饰胶蛋白聚糖(5) 纤调蛋白聚糖和光蛋白聚糖(6) 基底膜蛋白聚糖(7) 细胞表面蛋白聚糖： 粘连蛋白聚糖1.3.4. 糖基磷脂酰肌醇蛋白聚糖(8)细胞内蛋白聚糖（丝甘蛋白聚糖）(9)肝素分布于肺、等血管壁的肥大细胞内，是体内天然抗凝物质，其带负电的硫酸基与抗凝血酶结合 构象改变 容易与活化的凝血因子结合因子失活。（三）病理情况下蛋白聚糖的变化1. HA2. CSPG与疾病3. KSPG与疾病4. 基底膜HSPG与疾病（肾病、组织血管淀粉样变性）糖蛋白 ( Glycoprotein )（一） 组成：短链寡糖+蛋白的复合物单糖： 葡萄糖 Glc 半乳糖 Gal 甘露糖 Man 岩藻糖 Fuc N-乙酰氨基半乳糖 GalNAC N-乙酰氨基葡萄糖 GlcNAC N-乙酰神经氨酸 NeuAC唾液酸：（sialic acid） 分布广泛，可组成糖脂/糖蛋白，为一总称，代表20多种神经氨酸，是一类含9个碳的具吡喃型结构的酸性氨基糖.糖链数目差异很大，4-30个不等。（二） 糖链与蛋白连接方式 O-连接：糖基1位C上-OH与肽链上丝、苏羟基相连。 N-连接：糖基1位C上-OH与肽链上Asn的酰氨基相连。糖分支犹如天线状，称二、三、四、五天线结构，不均匀结合蛋白表面。（三） 糖化过程及特点 糖基供体、糖基接受体、糖基转移酶。（四） 糖蛋白生物功能 1 糖链具有不同程度的抗蛋白水解酶作用，血浆蛋白糖链可以延长半寿期。 2 定向作用：糖蛋白激素在内分泌腺合成后，能定向正确转移到高尔基体和溶酶体，与糖链有关。 3 识别作用：膜上糖链包含的多种生物信息可以起识别作用。红细胞血型物质 受体 激素 HCG 红细胞生成素卵子表面O-连接糖起精子受体作用 Ag-Ab 4 肿瘤细胞恶变时，膜上糖蛋白异常。 5 病原体侵袭（病毒、细菌、寄生虫）糖蛋白功能广泛，但在体内仅分布于少数部位：细胞膜、溶酶体和细胞外液中。（五）研究糖蛋白寡糖链的常用方法1 比较不同糖链的同种糖蛋白的生物活性（不同组织，不同病理）2 应用内切和外切糖苷酶3 应用糖链加工抑制剂4 应用基因DNA定点突变技术5 应用糖基转移酶的基因工程技术6 利用糖化过程不同步骤异常细胞株（六）糖蛋白与疾病 寡糖链代谢酶改变糖链结构改变糖蛋白异常细胞功能失常 恶性表型免疫系统识别产生自身抗体自身免疫病1恶性肿瘤：改变类型 (N-连接改变O-连接改变) 用凝集素(lectin)检测N-糖链改变 （1）凝集素:刀豆凝集素/伴刀豆球蛋白 ConA（常用）bis-GlcNAc 麦胚 WGA 要求含NeuAc 桔果粉孢 AAL 对核心Fuc专一 小扁豆/兵豆 LCA 同上 E/L型红腰豆 E-PHA/L-PHA 梦陀罗 DSA(常用) 美洲商陆促红细胞分裂素 PML 天冬豆凝集素 LTA（2）测定方法： a. 凝集素亲和电泳b. Ab凝集素酶免疫测定 (ALEIA)c. 凝集素亲和层析（3） 应用： a. HCC ( AFP ALP) b.肾细胞癌 (-GT) c. 滋养层细胞恶性肿瘤 d. 大肠癌 (O-连接)2免疫性疾病： （1）IgG的糖链结构 （2）类风湿性关节炎与IgG糖链改变 （3）其他免疫疾病与IgG糖链糖生物学习题1 简述蛋白多糖与糖蛋白的异同点。2 简述蛋白多糖与糖蛋白各自的生物学功能。3 举例说明蛋白多糖与糖蛋白在病理情况下的变化。4 常用的检测糖蛋白的寡糖链的方法有哪些？ 糖生物学参考资料1生物化学，第四版，吴梧桐主编2 生命化学1998，糖生物学专辑3糖复合物的结构与功能上海医科大学出版社，陈惠黎主编专题五：活体实时研究肿瘤方法的简介主要参考文献：1Ray P, Wu AM, Gambhir SSOptical bioluminescence and positron emission tomography imaging of a novel fusion reporter gene in tumor xenografts of living mice.Cancer Res. 2003 Mar 15;63(6):1160-5.2 Scheffold C, Kornacker M, Scheffold YC, Contag CH, Negrin RS.Visualization of effective tumor targeting by CD8+ natural killer T cells redirected with bispecific antibody F(ab)(2)HER2xCD3.Cancer Res. 2002 Oct 15;62(20):5785-91.3Vooijs M, Jonkers J, Lyons S, Berns A.Noninvasive imaging of spontaneous retinoblastoma pathway-dependent tumors in mice.Cancer Res. 2002 Mar 15;62(6):1862-7.4Hansen-Algenstaedt N, Stoll BR, Padera TP, Dolmans DE, Hicklin DJ, Fukumura D, Jain RK.Tumor oxygenation in hormone-dependent tumors during vascular endothelial growth factor receptor-2 blockade, hormone ablation, and chemotherapy.Cancer Res. 2000 Aug 15;60(16):4556-60.5Walenta S, Wetterling M, Lehrke M, Schwickert G, Sundfor K, Rofstad EK, Mueller-Klieser W.High lactate levels predict likelihood of metastases, tumor recurrence, and restricted patient survival in human cervical cancers.Cancer Res. 2000 Feb 15;60(4):916-21.6Rosol TJ, Tannehill-Gregg SH, LeRoy BE, Mandl S, Contag CH. 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