色谱峰,色谱柱及参数.doc

.死时间(dead time，t0)-不保留组分的保留时间。即流动相（溶剂）通过色谱柱的时间。在反相HPLC中可用苯磺酸钠来测定死时间。死体积(dead volume，V0)-由进样器进样口到检测器流动池未被固定相所占据的空间。它包括4部分：进样器至色谱柱管路体积、柱内固定相颗粒间隙（被流动相占据，Vm）、柱出口管路体积、检测器流动池体积。其中只有Vm参与色谱平衡过程，其它3部分只起峰扩展作用。为防止峰扩展，这3部分体积应尽量减小。V0Ft0（F为流速） 梯度方法的建立：Rs：分离度，表示两峰分离程度的物理量。k：容量因子，表示某溶质在固定相和流动相中物质的量的比，在等度洗脱中。一种物质的k值是恒定不变的。上面两试针对的是梯度洗脱，表示的平均容量因子。a：分离因子，两个溶质的容量因子的比。通常k大的作为分子。表示两物质分离能力的大小。N：理论塔板数，表示柱子的分离能力，也就是柱效。：梯度时间；F：流速；：死体积；：梯度变化范围。常见问题和维护：整个液相系统最值得关注的常数：压力除体系受到污染之外，几乎所有柱前的问题都能在压力变化上表现出来。压力来源：泵上的压力传感器最常见的问题：压力小（几乎为零）：说明没有流动相流过柱子。可能原因：柱前漏夜流速设为0了流动相干了吸滤头没有放流动相液面之下流路中有大段气泡处理方法：漏液：从泵的出口到柱子的前端接口（柱后漏液几乎不会影响压力值）顺次检查。泵上有自己的漏液传感器。检测到漏液。会停止工作并蜂鸣，变红。同时显示错误信息：ERROR：LEAK DETECTED。发现漏液点，先停泵，重新接好。将漏液擦干。 有的漏液不明显，这时压力的也不会太小，检查时要注意，可用手仔细摸各个接口，感觉是否湿冷。流路中有大段气泡：通过大流速（如5ml/min）冲洗可以去除泵体内气泡。也就是常说的PURGE。按下泵的面板上的purge键即可。每次PURGE的时间和流速可以在面板上设定。通常不改。初始值应该是5ml/min，3min。但有时候泵体内空气太多，purge都不可以，或者很难抽上流动相，这是可以在purge的同时，用注射器，在泵的废液出口处抽。直到没有气泡。关于偶尔出现的气泡，不用太过在意，因为：1. 有脱气机在。2. 在purge时，由于流速太大，难免会出现气泡。尤其是在purge阀开超过180度，废液出口处出现气泡就跟平常了。3. 只要气泡不在泵腔内堆积，就几乎不会影响到分析结果。只要出了泵口，在高压下会被压缩的很小。不影响流路的延续性。所以，只要观察压力变化，如果压力没有异常波动，就行。在泵体内有气泡堆积时，压力波动会变大。什么样的波动算正常，需要大家注意观察。根究经验，在以恒定流速，梯度不变时，面板上以MP为单位的显示值应该几乎不变。频繁出现的气泡会影响到流路的延续性，应该注意。吸滤头堵，管路脏（通常是水相）有可能带来频繁出现的气泡。可以先A，B的溶剂瓶调换一下。PURGE三五次。后换回来，再PURGE两次。清洗一下管路。压力过大：说明流路堵了逐段排查，先从柱（预柱）前接口（因为柱子最易堵）断开，以一定流速走：压力正常，说明是柱子及其后的某一段堵了（通常是柱子）。换柱子（或预柱）。压力还高：说明是柱前某段堵了。这时再将进样器出口（接柱子）的peek管接头拧下：压力正常：说明是这段peek管堵了。换peek管。压力还高：说明是进样器之前的部分堵了。通常是进样器六通阀堵了。反冲或清洗流通阀。其它部分依次类推。压力波动大：说明流路中的液流不平稳，这时色谱图通常保留时间不稳定，峰型也不好。得到的线性，重复性也不会好。可能原因：泵体内有气泡，泵头单向阀坏。先确认是哪一台泵有问题。先走100%A相。看是否压力还是波动大，还大则说明A泵有问题。压力正常则说明A泵正常。再走100%的B相，过程如上。确认好泵之后，先purge一下，以驱赶气泡。Purge两次后，还是压力波动大，这有可能单向阀坏了，需要清洗或更换。Ctc自动进样器的常用维护操作（实验室现场操作）：换针：调针位：调针位：设定洗针体积：一些小概念：PEEK：聚醚醚酮色谱管道，外径多为1/16inch，1inch=2.54cm，1/16in=2.54cm，内径大小以颜色标准，红色（我们用的）最小，为0.13mm（应该是国际统一标准）PEEK接头手紧即可不锈钢接头要用工具紧接头分一体的和分为主体和压紧环两部分的。后者在拧紧的过程中，不易带动管道扭曲变形。不锈钢的压紧环是一次性的单位换算：1MPa=10bar=7500.6torr=14.5psiPsi：pound per square inch (psi)Torr：托里彻利，标准大气压的1/760。也就是mmHg（毫米汞柱） 其它问题：残留大：很可能是洗针过程有问题，注意观洗针时有没有抽上液体，抽上来的液体是否有很多气泡。出现过由于转子磨损，洗针液不能顺畅流出进样口。造成洗针不充分。清洗或更换转子。也可能进样过程有问题，注意观察进样针活塞是否推到底。可能由于流通阀堵塞，造成压力大，进样针没法推到底。重现性不好：内标波动大，可能喷雾针脏了，使得喷雾不均匀。可能是液相方法没有开发好。峰型差，峰太宽都有可能造成面积不重复（不会差别太大）。注意观察重现性不好的那几针，是否峰型比较特殊，保留时间也有较大变化，如果是，很有可能是由于pump里进了气泡，造成流速不稳，这点可以从压力变化得到确认，但是好像没法记录压力曲线。质谱检测器的色谱图：chromatogram，强度和时间的图。等同于紫外检测的色谱图。质谱检测器的光谱图：spectrum，某一时间点（段时间内平均）的强度相对质荷比的图下图上半为一色谱图，下半部为图是灰色方块（2.5min左右）内，平均强度相对质荷比的光谱图。类似于紫外中的全波长图。 分辨率：unit分辨率定义为半峰宽为0.7。其意义如下：=WW=1.70=0.7则W=0.7*1.70=1.19差不多刚好实现单位质荷比的分离线性范围：信号强度与样品浓度的关系可用如下关系式表示：R=ARCX。R为信号强度大