DNA的酶切、连接、转化和重组子的筛选与鉴定.docx

第二次分子生物学实验报告DNA的酶切、连接、转化和重组子的筛选与鉴定一、 实验目的1、 学习和掌握限制性内切酶的分类、特性与作用原理，掌握载体和外源目的DNA酶切的操作技术。2、 学习利用T4 DNA 连接酶把酶切后的载体片段和外源目的DNA 片段连接起来，构建体外重组DNA 分子的技术，了解并掌握几种常用的连接方法。3、 掌握利用CaCl2 制备感受态细胞的方法；学习和掌握热击法转化E. coli 的原理与方法。4、 学习并掌握使用红白菌落法筛选获得重组子以及互补筛选法的原理及方法。5、 学习和掌握使用试剂盒抽提质粒的方法；6、 复习琼脂糖凝胶电泳的原理和方法；7、 通过对重组子进行重组质粒DNA 的抽提与酶切鉴定，进一步确定重组质粒中含有外源目的DNA 片段，并验证重组子是期望的重组子。二、 实验原理1、限制性内切酶限制性核酸内切酶是一类能够识别双链DNA 分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA 双链结构的酶，主要是从原核生物中分离纯化出来的。在限制性核酸内切限制酶的作用下，侵入细菌的“外源”DNA 分子便会被切割成不同大小的片段，而细菌自己固有的DNA 由于修饰酶(通常是一种甲基化酶)的保护作用，则可免受限制酶的降解。目前已经鉴定出3 种不同类型的限制性核酸内切酶，即型酶、II 型酶和III 型酶。型酶切割位点是随机的，至少距识别位点1000bp。型限制酶的切割位点距识别序列3端为2426bp。型限制酶的切割位点一般在识别序列上或与之靠近，而且具有序列特异性，故在基因克隆中有特别广泛的用途。型核酸内切限制酶具有3个基本的特性：在DNA 分子双链的特异性识别序列部位切割DNA 分子，产生链的断裂；2个单链断裂部位在DNA 分子上的分布通常不是彼此直接相对的；断裂结果形成的DNA 片段往往具有互补的单链延伸末端。限制性核酸内切酶对DNA 底物的酶切作用是否完全，直接关系到连接反应、重组体分子的筛选和鉴定等实验结果。核酸内切限制酶活性的充分发挥受到以下几个因素的影响：1）DNA样品的纯度，可采取措施有纯化DNA、加大酶的用量、延长酶催化反应的保温时间，扩大反应体积；2）DNA 的甲基化程度，基因工程中必须使用甲基化酶失活突变的菌株；3）酶切消化反应的温度；4）DNA 的分子结构；5）限制性核酸内切酶的缓冲液。限制核酸内切酶是分子克隆中最常用的工具酶，在DNA重组技术中限制性核酸内切酶主要用在一下几方面：构建重组质粒；构建基因文库；DNA 分子的杂交；制备DNA 放射性探针；绘制DNA 分子的限制酶图谱DNA 序列分析；基因定位及DNA 同源性研究。2、限制性内切酶的酶切反应体外构建重组DNA 分子，首先要了解目的基因的酶切图谱，选用的限制性核酸内切酶都不能在目的基因内部有专一的识别位点，即当用一种或者两种限制性核酸内切酶切割外源供体DNA 时，能够得到完整的目的基因。其次，选择具有相应的单一酶切位点的质粒、噬菌体等载体分子作为克隆的载体。常用的酶切方法有双酶切法和单酶切法两种。（1）双酶切法：如果只在要克隆的目的DNA 二端具有不同的限制性核酸内切酶的识别位点，而目的基因内部没有相应的识别序列，可用这二种限制性核酸内切酶酶切，则目的DNA可产生二种不同的黏性末端。选择同样具有这二种限制性核酸内切酶识别位点的合适载体，酶切后，同样产生二个不同的黏性末端，当构建重组分子时，目的DNA 可以一定的方向插入载体中，这样操作效率高，也利于重组子的筛选。（2）单酶切法：:如果目的DNA 片段只能用一种限制性核酸内切酶切割，酶切后的片段两端产生相同的粘性末端或者平末端。选择具有同样限制性核酸内切酶识别位点的合适载体，在构建重组分子时，除了形成正常的重组子之外，还可能会出现目的DNA 片段以相反方向插入载体分子中，或者目的DNA 串联后再插入载体分子中，甚至出现载体分子自连，重新环化的现象，因此重组效率较低。如果没有很好的方法区分转化子中的重组子，筛选重组子会比用双酶切法构建重组DNA 分子的工作量大很多。单酶切法和双酶切法各有优缺点，在实际操作时要根据具体情况来定。3、DNA连接酶DNA 连接酶能催化双链DNA 片段紧靠在一起的3羟基末端与5磷酸基团末端之间形成磷酸二酯键，使两末端连接。目前用于连接DNA 片段的DNA 连接酶有E. coli DNA 连接酶和T4 DNA 连接酶。E. coli DNA 连接酶只能催化双链DNA 片段互补黏性末端之间的连接，不能催化双链DNA 片段平末端之间的连接。T4DNA 连接酶既可用于双链DNA 片段互补黏性末端之间的连接，也能催化双链DNA 片段平末端之间的连接，但平末端之间连接的效率比较低。DNA 连接酶同限制性核酸内切酶一样，都是在体外构建重组DNA 分子所必不可少的基本工具酶。限制性核酸内切酶可以将DNA 分子切割成不同大小的片段，然而要将不同来源的DNA 片段组成新的杂交DNA 分子，还必须将它们彼此连接起来。目前有3 种体外连接DNA 片段的方法：用DNA 连接酶连接具有互补黏性末端的DNA 片段；用T4 DNA 连接酶直接将平末端的DNA 片段连接起来，或是用末端脱氧核苷酸转移酶给具平末端的DNA 片poly(dA)-poly(dT)尾之后，再用DNA 连接酶连接起来；先在DNA 片段末端加上化学合成的衔接物或接头，使之形成黏性末端，再用DNA 连接酶连接起来。这3 种方法虽然互有差异，但共同的一点都是利用DNA 连接酶所具有的连接和封闭单链DNA 的功能。4、载体与外源DNA的连接反应外源DNA 片段与载体分子的连接，即DNA 分子体外重组，主要依赖于DNA 连接酶来完成。DNA 连接酶催化两双链DNA 片段相邻的5-磷酸和3-羟基间形成磷酸二酯键。在分子克隆中最有用的DNA 连接酶是来自T4 噬菌体的DNA 连接酶：T4 DNA 连接酶，该酶需要ATP 作为辅助因子。目的DNA 片段与载体DNA 片段之间的连接方式主要有以下几种：（1）互补粘性末端片段之间的连接当载体和外源DNA 用同一种限制性内切酶切割时，产生相同的粘性末端，连接后仍保留原限制性内切酶的识别序列；如果用两种能够产生相同的粘性末端的限制酶（同尾酶）切割时，虽然可以有效地进行连接，但是获得的重组DNA 分子消失了原来用于切割的那两种限制性核酸内切酶的识别序列，这样不利于从重组子上完整地将插入片段重新切割下来。定向克隆：根据核酸内切限制酶的性质，用两种不同的限制酶同时消化一种特定的DNA分子，将会产生出具有两种不同粘性末端的DNA 片段。十分明显，如果载体分子和待克隆的DNA 分子都是用同一对核酸内切酶切割，然后混合起来，那么载体分子和外源DNA 片段将按一种取向退火形成重组DNA 分子。互补粘性末端连接方案中还有一个问题：片段的多拷贝插入。当需要表达蛋白质产物时，多拷贝的插入，在没有拼连剪切信号的情况下，将会导致表达困难或紊乱。所以需要用内切酶图谱对单拷贝插入片段进行鉴定和筛选。适当的插入片段与载体分子比率能减少多拷贝插入片段的形成，一般比例为2:1（插入片段摩尔数:载体摩尔数）。（2） 平末端及非互补黏性末端片段之间的连接载体分子和外源DNA 插入片段并不一定总能产生出互补的粘性末端。实际上有许多情况都是例外的，因为有些限制酶切割DNA 分子之后所形成的都是平末端的片段；有的实验要用两种不同的限制酶分别切割载体分子和外源DNA，形成的也多半是非互补的粘性末端或平末端；再如用机械切割法制备的DNA 片段，PCR 扩增的和化学合成的DNA 片段或由RNA 为模板反转录合成的cDNA 片段，也不会具有互补的粘性末端。既然在一定反应条件下，用T4 DNA 连接酶可以将平末端的DNA 片段有效地连接起来，那么对于上面提到的非互补粘性末端的两种DNA 片段之间，经过专门作用于单链DNA 的S1 核酸酶处理变成平末端或用大肠杆菌DNA 聚合酶I 的Klenow 片段填补后变成平末端，一样也可以使用T4 DNA 连接酶进行有效地连接。不过，平末端DNA 片段间的连接作用不仅在效率上明显地低于粘性末端间的连接作用，而且重组之后一般不能从原位删除下来。影响DNA连接的因素有温度、时间、酶量、缓冲体系、DNA末端的性质及浓度、DNA判断的大小等。温度，理论上最佳温度是37，此时酶的活性最高，但37时粘性末端分子形成的氢键配对极不稳定，因此我们选择在1216进行连接。时间，在最适温度下，一般粘性末端连接30min即可取得较好的效果，连接60min则更完全些，为了实验方便有时也在4下连接过夜。而对于平末端建议在4下连接，并且时间适当延长。更为普遍的条件是：16连接过夜酶单位（Takara）在20ml的连接反应体系中，6mg的 DNA-Hind 的分解产物在16下fanying30分钟时，有90%以上的DNA片段进行连接的酶量为1U。酶量，连接实验中DNA的浓度比酶量定义状态下低很多倍，所以酶是过量的。Takara的T4-DNA连接酶浓度是350U/ml。缓冲体系（buffer），Tris-HCl提供连接所需的合适的ph值，DTT提供还原力，ATP促进连接反应的有效进行。DNA浓度，连接反应中DNA的浓度一般为0.11pmol/ml。其中载体浓度过高会增加载体间分子的环化，而过低则获得重组分子的效率低，甚至导致载体分子的自身环化，外源DNA则依据连接类型的不同加入载体浓度的110倍。5、 感受态细胞的制备与质粒转化体外连接的DNA 重组分子导入合适的受体细胞才能大量地进行复制、增殖和表达，将外源重组体分子导入受体细胞的途径，包括转化（或转染）、转导、显微注射和电穿孔等多种不同的方式。重组质粒DNA 分子通过与膜蛋白结合进入受体细胞，并在受体细胞内稳定维持和表达的过程称之为转化（transformation）。细菌转化的本质是受体菌直接吸收来自供体菌的游离DNA 片段，即转化因子，并在细胞中通过遗传交换将之组合到自身的基因组中，从而获得供体菌的相应遗传性状的过程。大肠杆菌是一种革兰氏阴性菌，自然条件下很难进行转化，其主要原因是转化因子的吸收较为困难，尤其是那些与其亲缘关系较远的DNA 分子更是如此。通常的做法是采用人工的方法制备感受态细胞，然后进行转化处理，其中代表方法之一是CaCl2诱导的大肠杆菌转化法。感受态是指宿主细胞最容易接受外源DNA片段并实现转化的一种生理状态，由受体菌的遗传性状决定，同时也受菌龄和环境因子的影响。感受态的细胞一般出现在对数生长期。重组DNA 转化细菌的技术操作关键就是通过化学方法，人工诱导细菌细胞进入一个敏感的感受态，以便外源DNA 进入细菌内。CaCl2诱导的大肠杆菌转化的原理是将处于对数生长期的细菌置于0，CaCl2 低渗溶液中，细菌细胞膨胀成球形，同时钙离子使细胞膜磷脂层形成液晶结构，使得位于外膜与内膜间隙中的部分核酸酶离开所在区域，这就构成了大肠杆菌人工诱导的感受态。此时加入DNA，钙离子又与DNA 结合形成抗脱氧核糖核酸酶（Dnase）的羟基-磷酸钙复合物，并粘附在细菌细胞膜的外表面上。经短暂的42热脉冲处理后，细菌细胞膜的液晶结构发生剧烈扰动，随之出现许多间隙，致使通透性增加，DNA 分子便趁机进入细胞内。影响感受态细胞制备及转化的因素有细胞的状态、DNA的质量和浓度、试剂的纯度等。（1） 细胞的生长状态和密度：从甘油管中新鲜活化而不是多次转接的菌；培养至指数前期到指数期；应为限制-修饰系统缺陷菌株；感受细胞和所转化的载体性质应匹配。（2） 质粒DNA的质量和浓度：超螺旋构想的质粒DNA，较其线性构想的转化率高10100倍；加入DNA的体积不应超过感受态细胞的5%，1ng的cccDNA即可使50l的感受态细胞达到饱和；对于同一类型的载体而言，分子量越大转化率越低。（3） 其他药品、试剂质量：氯化钙应用高纯度药品、超纯水配制，过滤除菌、分装保存；所有试剂、容器、耗材等均需无菌处理；感受态细胞制备过程均需无菌、冰浴操作。5、互补利用-半乳糖苷酶筛选系统，跟据菌落颜色筛选含有重组质粒的转化子。载体上插入了-半乳糖苷酶的调控序列和-半乳糖苷酶N端146个氨基酸的编码序列，而其对应的宿主菌染色体上整合有-半乳糖苷酶C端序列的遗传信息。当质粒载体导入相应宿主菌后，通过 互补作用，形成完整的-半乳糖苷酶。在加有氨苄青霉素的麦康凯培养基平板上，不含质粒pUC19的E. coli DH5无法生长；含有质粒pUC19的E. coli DH5利用-半乳糖苷酶分解培养基中的乳糖产生有机酸，pH降低，培养基中的指示剂变红，菌落变为红色；含有重组质粒的E. coli DH5具有氨苄青霉素抗性可以生长，但质粒pUC19中有外源基因插入到多克隆位点，使-半乳糖苷酶N端的基因不能表达，无法实现 互补作用，所以其菌落为白色。利用这种筛选方法可方便地将含目的基因的重组子筛选出来。6、 重组质粒的鉴定重组质粒是外源基因通过单酶切（或双酶切）与用相同的（或二种）限制性核酸内切酶切割的质粒载体理解后获得的，因此在连接处仍保留原限制性核酸内切酶的识别序列，用该酶（或二种酶）再次切割重组质粒，能把插入片段切离载体，根据琼脂糖凝胶电泳检测可见有载体片段和插入的外源DNA片段，并可知插入片段的大小。7、麦康凯培养基蛋白胨、胨提供碳氮源、维生素和生长因子；牛胆盐和结晶紫可抑制革兰氏阳性菌的生长；氯化钠维持均衡的渗透压；琼脂是培养基的凝固剂；乳糖为可发酵的糖类；中性红是pH指示剂，细菌发酵乳糖产酸时菌落呈粉红色并在菌落周围出现胆盐沉淀的浑浊圈。三、主要仪器和实验试剂1、仪器与材料LB培养基，NaOH溶液，氨苄青霉素母液（20mg/mL），无水乙醇，超纯水，限制性核酸内切酶Hind及其相应的Buffer，T4-DNA连接酶及其Buffer，麦康凯培养基，100mmol/L CaCl2溶液，Omega质粒抽提试剂盒，琼脂糖，TAE电泳缓冲液（50），上样缓冲液（10），溴化乙锭（EB）。2、实验试剂恒温振荡培养箱，高速冷冻离心机，漩涡振荡器，恒温水浴锅，Eppendorf管，微量移液器，培养皿，三角瓶，酒精灯，量筒，牛皮纸，接种环，涂布器，电子天平，微波炉，电泳仪，制胶槽，电泳槽，凝胶成像检测仪，琼脂糖凝胶梳子，手套。3、实验材料E.coli DH5（pUC19）；pUC19质粒；DNA。四、实验步骤1、酶切在无菌Ep管中按ddH2O、buffe、DNA、限制性内切酶的顺序依次加入酶切反应的各种成分（各组分的量见Figure 1），混匀，4000rpm离心1min，将液体集中于管底。37，12小时，在-20冰箱保存。酶切产物电泳检测酶切效率，各小组向EP观众加8l上周得到的酶切反应液，并加2l Loading buffer。加样序号体系组成 自己提取的pUC19商品DNA商品pUC191ddH2O（ul）13.070.064.0210*Buffer（ul）2.010.08.03DNA（ul）4.015.04.04Hind(5M/ul)1.05.04.0总计（ul）20.0100.080.0Figure 1 pUC19 质粒及DNA 酶切反应体系2、连接（1）在无菌Ep管中依次加入连接反应的各种成分（见Figure 2），混匀；（2）4000tpm离线1min，集液于管底；（3）在16的恒温水浴锅中反应过夜。组份ddH2010*Ligase BufferpUC19DNA/HindDNA/HindT4-DNA连接酶（30U/ul）合计含量(ul)3.21.02.03.00.810.0Figure 2 连接反应体系3、感受态细胞的制备(1)倒LB平板，划线活化E. coli DH5。(2)从LB平板上挑取E. coli DH5单菌落至5mL LB液体培养基里，37振荡培养过夜。(3)以1%的接种量将过夜培养的E. coli DH5接种于20mL新鲜LB液体培养基，220rpm培养2-2.5h。(4)将菌液之于冰浴中。 (5)分别取1.5mL 菌液于2 个无菌的1.5mL Ep管中，4000rpm 离心5min，弃上清液，收集菌体。(6)每支离心管中加入用冰预冷的800l 0.1mol/LCaCl2，轻轻悬浮细胞，冰上放置10min，4000rpm离心5min。(7)弃上清液，加入100LCaCl2 溶液，轻轻悬浮细胞，冰上放置20min，即为感受态细胞，分装至50l/管。4、转化步骤1感受态细胞2DNA3冰浴4热击5冰浴6复苏7培养基涂平板-实验组100连接物5.010min90s5minLB：0.9ml/管，0.5-1h含amp麦康凯培养基，50l*2、100l*2、150l*2、200ul*l*2-转化对照50pUC191.010min90s5minLB：0.9ml/管，0.5-1h含amp麦康凯培养基，50l*1-细胞对照5010min90s5minLB：0.9ml/管，0.5-1h含amp麦康凯培养基，50l*1；麦康凯培养基，50l*1Figure 3 重组质粒及转化对照表平板至置于操作台上10分钟后，导致于37温箱中培养1620h。5、转化子和重组质粒的筛选（1）转化后的细胞在含有氨苄青霉素的LB培养基上为白色菌落，选取六个白色菌落在另一LB培养基上划线，过夜培养。（2）六个菌落中选取三个转接到3mL含氨苄青霉素的LB培养基中，37振荡培养过夜。6、重组质粒的验证（1）取菌液3.0mL用试剂盒提取质粒。A. 将带有重组质粒的菌体接种5ml于含amp的LB培养基上，37摇床过夜；B. 取15ml菌液，室温下10000rpm离心1min收集菌体；C. 弃培养基，加入250ml solution/RNaseA混合液，涡旋震荡使细胞完全悬浮；D. 往混合液中加入250l solution，轻轻颠倒混匀，裂解时间不要超过5min；E. 加入350lsolution ，温和颠倒数次至形成白色絮状沉淀；F. 室温，10000rpm离心10min；G. 转移上清液到套有2ml收集管的HiBind DNA结合柱中，室温下，10000rpm离心1min，倒去滤液；H. 柱子重新装回收集管，加500l HB Buffer，按上述条件离心，弃去滤液；I. 柱子重新装回收集管，加700lDNA Wash Buffer，按上述条件离心，弃去滤液；J. 柱子重新装回收集管，10000rpm离心空柱2min；K. 把柱子装在干净的Ep管上，加入50l Elution Buffer到柱子基质中，10000rpm离心1min洗脱出DNA。（2）对有外源基因插入的质粒用限制性内切酶切割，进行进一步鉴定。（3）37保温0.51h。（4）利用空载体pUC19片段和目的基因片段为对照，对没切后的重组质粒的片段进行琼脂糖凝胶电泳，从酶切后片段的数目及大小上进行确认。处理：2l ddH2O，2l质粒，1l loading buffer，轻弹/用枪吹吸混匀，快速离心集液于管底。五、结果分析1、酶切结果电泳检验Figure 4酶切检验上样顺序在电泳图中，我们第9小组的酶切产物在第14泳道，主要的亮带有两条。先从位置上看，较近的一条和第5泳道的pUC19（商品）/Hind对齐，说明是这条带是切开的质粒，是线性DNA；较远的一条带和第4泳道的亮带对齐，说明这条带是未被切开的质粒，是环状DNA。环状DNA电泳速率比线性DNA快，这也验证了“近处条带是酶切成功的质粒，远处条带是未切开的质粒”的说法。再从亮度上看，酶切开的质粒的条带亮度远远亮于未酶切开的质粒，相比其他组，我们组酶切效果是比较好；但相比商品化质粒的酶切效，我们小组的效果不是很好。在第6条带以后的条带的远处都有宽而暗的模糊条带，而在商品化pUC19的泳道里，没有，这应该是未分离干净的RNA；点样槽处亮带可能是附着蛋白质的DNA片段、染色体片段等。Figure 5 质粒酶切电泳结果(我们小组的是第14泳道的，第4泳道是未酶切的pUC19，第5泳道是酶切的商品化质粒，第1、3泳道为酶切的DNA)2、转化结果观察与分析实验设组培养基涂布平板培养结果-试验组含amp的麦康凯培养基50*2平均每个平板17个菌落，其中2个白斑100*2平均每个平板40个菌落，其中3个白斑150*2平均每个平板65个菌落，其中5个白斑200*2平均每个平板100个菌落-转化对照含amp的麦康凯培养基50*1多于100个菌落，均为红斑-细胞对照含amp的麦康凯培养基50*1没有菌落不含amp的麦康凯培养基