华农2016《食品发酵工艺原理》复习题答案.doc

名词解释：工业发酵的含义对工业微生物而言，利用微生物在有氧或无氧条件下的生命活动来获得微生物菌体或代谢产物的过程。如厌氧培养的生产过程，酒精，乳酸等。通气（有氧）培养的生产过程，如抗生素、氨基、酶制剂等。发酵可以定义为：通过生物细胞（微生物、动植物细胞）的生长繁殖和代谢活动，产生和积累人们所需要的产品的生物反应过程统称为发酵。发酵工程的含义给微生物提供适宜的生长条件，利用微生物的某种特定功能，通过现代化的技术手生产出人类所需要的产品的工程。发酵机制发酵机制（或微生物发酵的机理）：特定的微生物通过O代谢活动，利用基质合成人们所需的产物的内在规律。巴斯德效应酵母在厌氧的条件下，能分解葡萄糖产生酒精，并且消耗葡萄糖的速度很快；而在好氧条件下，酵母的发酵能力降低，酒精产量大为降低，葡萄糖消耗速度也会减慢，这种抑制发酵的现象称为巴斯德效应。次级代谢与初级代谢按照产物与微生物生长繁殖的关系分：初级代谢产物与次级代谢产物。为微生物提供生物合成的能量、中间体物质以及从中间体合成细胞物质（蛋白质、核酸、有机酸、脂类、多糖等高分子化合物）这类代谢称初级代谢。例如：EMP途径、三羧酸循环、氨基酸、ATP等的合成酒精、乳酸、柠檬酸、氨基酸等是微生物在一定的生长期里（通常是生长期的后期或稳定生长期里），合成一些对微生物本身没有明显作用的物质，或是在外界环境胁迫下合成的一类有利于其生存的代谢活动，称为次级代谢。次级代谢产物次级代谢产物是指由微生物产生的，与微生物生长、繁殖无关的一类物质。如抗生素、色素、维生素、酶制剂、甾体、激素等。自发突变与诱发突变在自然状况下发生的突变称自然突变或自发突变。微生物在自然条件下发生自发突变，频率为10-810-5。自然选育自然选育：生产中根据菌种自突变的特点进行菌种筛选的过程（定期传代复壮，无人工诱变），通过分离、筛选，排除劣质性状的菌株，选择维持具有原来生产水平或具有更优良性能的高产菌株。通过自然选育可以达到纯化与复壮菌种、防止菌种化的目的。诱变育种用各种物理、化学的因素人工诱微生物突变，提高突变频率，从变异的细胞中筛选出具有所需生产性状的菌株，称为诱变育种。营养缺陷型营养缺陷型菌株指某一菌株丧失了合成某种营养物质的能力，是微生物经诱变剂处理后产生的一种生化突变体。由于基因突变，它失去了合成某种物质（氨基酸、维生素或核苷酸碱基的能力，在基本培养基上不能生长，在培养基中若不外加这种营养成分就不能正常生长的变异菌株。在营养缺陷型突变株中，生物合成途径中的某一步发生了酶的缺陷，合成反应不能完成，某段产物不能累积，因此末端产物的反馈调节被解除。缺陷型表为“X”发酵培养基人工配制的适合于不同微生物生长繁殖或积累代谢产物的营养基质。C/N比生长因子凡是微生物生长不可缺少的微量的有机物质，如氨基酸、嘌呤、嘧啶、维生素等均称生长因子。产物促进剂是指那些非细胞生长所必须的营养物，又非前体，但加入含义后却能提高产量的添加剂。消毒与灭菌消毒(disinfection)：用物理或化学方法杀死物料、容器器具内外病原微生物，而对被消毒的物体基本无害的措施。一般只能杀死营养细胞，例如巴氏消毒法（60，30min）。灭菌(sterilization)：用物理或化学方法杀死或除去物料、空气容器等环境中所有微生物，包括营养细胞、细菌芽孢和孢子。关系：消毒不一定达到灭菌的要求，而灭菌可以达到消毒的目的。过滤介质除菌采用适当的过滤介质对热敏性的液体或气体进行过滤，去除微生物的方法。致死温度实消分批灭菌也叫间歇灭菌或实罐灭菌、实消。培养基的间歇灭菌就是将配制好的培养基放在发酵罐或其他装置中，通入蒸汽将培养基和所用设备一起进行加热灭菌的过程，也称为实罐灭菌，或实消。空消发酵附属设备灭菌，又称空消种子的扩大培养种子扩大培养是指将保存在砂土管、冷冻干燥管中处休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后，再经过扁瓶或摇瓶及种子罐逐级扩大培养，最终获得一定数量和质量的纯种过程，这些纯种培养物称为种子。种子扩培的目的：1、接种量的需要2、菌种的活化、驯化3、缩短发酵时间、保证生产水平种子制备的过程大致可分为：1、实验室种子制备阶段2、生产车间种子制备阶段接种量*是指移的种子液体积与接种后培养液总体积的比例。取决于生产菌种在酵罐中生长繁殖的速率和产品生产的工艺要求，通过实验确定。种龄是指种子罐中培养的菌体开始移下一级种子罐或酵罐时的培养时间。菌体比生长速率菌体比生长速率（specificgrowthrate)，是单位质量菌体在单位时间内的增量g/(gh),即菌体的生长速率除以菌体的浓度，单位为h-1基质比消耗速率单位质量菌体在单位时间内消耗基质的量称为基质的消耗比速率，它表示细胞对营养物质利用的速率或效率。产物比生产速率每克菌体在单位时间（1h）内培养液中产物浓度的变化量，它表示微生物细胞合成产物的速度或效率产物与生长偶联型生长偶联产物生成菌体生长、碳源利用和产物形成几乎在相同时间出现高峰。产物形成直接与碳源利用有关产物与生长非偶联型生长与产物生成部分偶联在生长开始后并无产物生成，在生长继续进行到某一阶段才有产物生成。产物形成间接与碳源利用有关。部分偶联型非生长偶联产物生成在生长停止后才有产物生成。产物形成与碳源利用无准量关系。分批发酵分批（发酵）培养（batchculture）：指在一个密闭系统内一次性投入有限数量营养物，接入微生物进行培养只完成一个生长周期的方法。Fin=Fout=0（无培养基进出）如在好氧发酵过程中，需要不断通入无菌空气并加入酸碱以调节发酵液的pH值，除此以外，与外界没有其它的物料交换。连续发酵指在一开放系统中，以一定的速度向发酵罐内连续供给新鲜培养基，同时以相同速度将含有微生物和产物的培养液从发酵罐内放出，从而使发酵罐内液体量维持恒定，使培养物在近似恒定状态下生长和进行代谢活动的方法。Fin=Fout0补料分批发酵指在分批发酵中间歇地或连续地补（流）新鲜培养基的方法。Fin0（Fout0，Fout0）发酵热发酵热就是发酵过程中所产生的净热量生物热在发酵过程中，菌体不断利用培养基中的营养物质，将其分解氧化产生能量，一部分用于合成高能化合物（如ATP）提供细胞代谢产物合成需的能量，另一部分以热的形式散发，这散发出来的热就叫生物热。溶解氧呼吸强度QQ2 mmol O2/g.h，也称氧的比消耗速率氧的消耗速率也称微生物摄氧率r mmol O2/g.h 。 (其中，X=X0*eut ，X每ml发酵培养液中的菌体质量浓度 g/L) 临界氧浓度临界氧浓度CCr：各种微生物对发酵液中溶氧浓度的最低要求。对产物而言，便是不影响产物合成所允许的最低浓度。KLa以浓度差为推动力溶解氧的传质总系数染菌时间污染时间是指无菌检测方法确定的污染时间，不是杂菌窜入培养的时间。染菌率总染菌率：指一年内发酵染菌的批次与总投料批次数之比的分率：发酵染菌批（次）数/总投料批（次）数*100%简答题或问答题：1、简述自然发酵产特点及其例子2、常见的厌氧和耗氧发酵产物种类厌氧发酵：酒精、乳酸、丙酮与丁醇等好氧发酵：柠檬酸、谷氨酸、抗生素等3、酵母的酒精发酵机制是什么？巴斯德效应及其机理是什么？在酵母体内，葡萄糖经酵解途径生成丙酮酸，在无氧条件下，由丙酮酸脱羧酶催化，丙酮酸脱羧生成乙醛。生成的乙醛作为受氢体，被NADH+H还原为乙醇巴斯德效应及其机理：酵母在厌氧的条件下，能分解葡萄糖产生酒精，并且消耗葡萄糖的速度很快；而在好氧条件下，酵母的发酵能力降低，酒精产量大为降低，葡萄糖消耗速度也会减慢，这种抑制发酵的现象称为巴斯德效应。其机理是因为糖酵解过程(EMP）的受末端产物ATP的反馈控制，即有氧时，由于酵解产生的和丙酮酸进入线粒体而产生大量ATP，控制酵解途径关键酶磷酸果糖激酶的活性，葡萄糖进入途径减少，葡萄糖消耗速率降低。4、简述亚硫酸盐和碱法甘油发酵机制在发酵液中加入3，乙醛与其起加成反应，生成难容的结晶状亚硫酸钠加成物，使乙醛不能作为受氢体。5、了解常见发酵产的工业微生物菌种类型，如高温淀粉酶采用地衣芽孢杆菌，谷氨酸采用棒杆菌或黄色短杆菌糖化酶采用黑曲霉菌株，许多抗生素采用放线菌来生产等等6、简述柠檬酸的发酵机制1、黑曲霉等微生物具有组成型的丙酮酸羧化酶源源不断提供草酰乙酸。2、丙酮酸氧化脱羧生成乙酰CoA和丙酮酸固定CO2反应平衡，及柠檬酸合成酶不被调节抑制，增强了合成柠檬酸的能力。3、在控制Fe+含量的情况下，顺乌头酸酶活性低,从而使柠檬酸积累。4、由于锰的缺乏，抑制了蛋白质的合成，而导致细胞内的NH4+浓度升高，促进了途径的畅通。5、柠檬酸积累增加,降低，在低条件下，顺乌头酸水合酶和异柠檬酸脱氢酶失活，从而进一步促进了柠檬酸自身的积累。7、简述谷氨酸发酵过程中改变细胞膜通透性的措施及意义代谢产物的细胞渗透性是氨基酸发酵的重要因素。细胞膜的渗透性好，有利于代谢产物分泌出来，避免了端产物的反馈调节，有利于提高发酵产量。影响谷氨酸产生菌细胞膜通透性的物质：（1）生物素、油酸、表面活性剂。其作用是引起细胞膜的脂肪成分的改变，尤其是改变油酸的含量，从而改变细胞膜通透性（2）青霉素：抑制细胞壁的合成，由于细胞膜失去细胞壁的保护，细胞膜受到物理损伤，从而使渗透性增强。8、简述工业发酵对菌种的要求1、发酵工业对优良微生物菌种的要求1） 并能高产和稳产所需的代谢产物；2） 2）能在价原料制成的培养基上迅速生长；3） 3）副产物尽量少，便于提纯，以保证产品纯度。4） 4）菌种不易变异退化，以保证发酵生产和产品质量的稳定性。5） 5）生产菌株安全，不是病源菌、不产毒素、对环境无害；用作食品添加剂的发酵产品以及进行食品发酵，其生产所用菌种必须符合食品卫生要求。9、什么叫自然选育？自然选育在艺生产中的意义？根据自然变异从自然界或生产中选择符合生产要求的菌种。回复突变：高产菌株在传代的过程中，由于自然突变导致高产性状的丢失，生产性能下降，这种情况我们称为回复突变。自然选育虽然突变率很低，但却是工厂保证稳产高产的重要措施。10、什么是诱变育种？常用的诱变剂有哪些？用各种物理、化学的因素人工诱微生物突变，提高突变频率，从变异的细胞中筛选出具有所需生产性状的菌株，称为诱变育种。物理诱变剂：紫外线、X射线、y射线，快中子；物理因素中目前使用得最方便而且十分有效的是紫外线。许多高产菌株的选育都用过紫外线，对于一般实验室、中小型工厂都适用，也很安全。其他的几种射线都是电离性质的，有一定的穿透力，一般都由专业人员在专门的设备中使用，否则有一定危险性。化学诱变剂：如碱基类似物、5氟尿嘧啶、烷化剂等，使用最多、最有效的是烷化剂。优缺点：1、大多数情况下，要比电离辐射更有效。2、化学诱变剂经济、简单。3、大部分诱变剂是致癌剂，必须非常谨慎，要避免化学诱变剂与皮肤接触，且切勿吸入其蒸气，有人对某些诱变剂极其敏感。11、简述诱变育种的基本流程（1）出发菌株的选择*诱变目的是提高代谢产物或中间产物的产量、质量，或改变原有代谢途径，产生新的代谢产物（代谢控制育种）等，因此出发菌株的选择直接关系到诱变效果。出发菌株应具备一定的生产能力或某种优良特性的菌株，其遗以下传性状应该是纯的，较高产，遗传性状稳定，对诱变剂敏感。以下几类菌株常用作出发菌株：*自然界新分离的野生型菌株，对诱变处理较敏感，容易发生正突变；*经历生产条件考验的菌株，有一定的生产性状，对生产环境有较好的适应性；*经历多次诱变处理的菌株（2）单细胞或单孢子悬浮液的制备*取处于对数生长期的菌体，且尽可能处于同步生长状态的微生物细胞，芽孢细菌采用芽孢制备悬液，放线菌和霉菌采用其孢子。要尽量选择单倍体细胞、单核或核少的多细胞体来作出诱变细胞。目的：分散的每个细胞与诱变剂机会均等充分接触；菌悬液用生理盐水或缓冲液稀释：真菌孢子和酵母细胞悬浮液的浓度为1061010CFU/ml；放线菌或细菌108CFU/ml。（3）诱变剂的选择：单一诱变剂两种以上的诱变剂（4）诱变剂处理：*预先做诱变剂用量对菌体死亡数量的致死曲线，选择合适的处理剂量。一般以致死率70%-80%为最佳诱变剂量。不同诱变剂的剂量有不同的表方法，紫外线和X射线以强度表示。12、制备不同种类微生物原生质体的方法细菌和放线菌制备原生质体主要采用溶菌酶：制备酵母菌原生质体，一般采用蜗牛消化酶：制备丝状真菌原生质体时可用蜗牛消化酶、纤维素酶，对丝状真菌一般采用两种或三种酶进行处理才能收到好的效果。13、工业发酵中菌种的退化原因及防止措施有哪些？*菌种衰退：指选育出的优良菌种，在传代和保藏的过程中群体中某些生理特征和形态特征逐渐减或完全丧失的现象。定期使菌种复壮是防止菌种衰最有效的方法。菌种的复壮是指使衰退的菌种恢复原来优良性状。狭义的复壮是指在菌种已发生衰退的情况下，通过纯种分离和生产性能测定等方法，从衰退的群体中找出未衰退的个体，以达到恢复该菌原有典型性状的措施；广义的复壮是指在菌种的生产性能未衰退前就有意识的经常、进行纯种的分离和生产性能测定工作，以期菌种的生产性能逐步提高。（另一种答案：造成菌种退化的原因主要是保藏方法不妥、保藏操作不当、传代不当、培养基不适、回复突变等；从菌种选育方法上考虑：1)进行充分的后培养及分离纯化2)增加突变位点，减少基因回复突变的几率从菌种保藏方式上考虑：1)尽量减少传代次数2)选择适宜的保藏培养基从菌种培养适宜条件上考虑：1)结构类似物抗性菌株在保藏培养基中应添加相应药物及时淘汰回复突变细胞。2)基因工程菌添加抗生素于培养基中防止质粒的丢失从菌种管理的措施上考虑（复壮）：1）定期对保藏菌种分离纯化，淘汰已退化细胞；2）定期对发酵液进行分离筛选）14、常见菌种保藏方法的条件和原理是什么？菌种保藏方法的各自优缺点原理：人工创造条件（如低温、干燥、缺氧和缺乏营养物质），使菌种的代谢活动降低低，或处于不活动状态即休眠，以减少变异。生产菌种常用的保藏方法:斜面低温保藏法、石蜡油封保藏法、砂土保藏法、冷冻干燥法、液氮超低温冻结法15、业发酵培养基的基本要求？发酵培养基的组成成分有哪些？(1)发酵培养基的基本要求(2)不同的培养基有不同的营养需求。(3)必须提合成微生物细胞和发酵产物的基本成分。(4)有利于提高产物的合成速度，缩短发酵周期。(5)尽量减少副产物的形成，便于产物的分离纯化。(6)原料价格低廉，质量稳定，取材容易。发酵培养基的一般含有：碳源、氮源、无机盐及微量元素、生长因子和水等菌体生长所必需的元素；以及合成产物所需的前体和促进剂16、常用的碳源有哪些？常用的糖类有哪些，各自有何特点？碳源种类：糖类、油脂、有机酸、正烷烃。葡萄糖：所有微生物都能利用葡萄糖，但注意葡萄糖效应（又称葡萄糖阻遏或分解代谢产生阻遏作用。葡萄糖或某些容易利用的碳源，其分解代谢产物阻遏某些诱导酶体系编码的基因转录的现象。如大肠埃希氏菌培养在含葡萄糖和乳糖的培养基上，在葡萄糖没有被利用完之前，乳糖操纵子就一直被阻遏，乳糖不能被利用，这是因为葡萄糖的分解物引起细胞内含量降低，启动子释放-蛋白，聚合酶不能与乳糖的启动基因结合，以至转录不能发生，直到葡萄糖被利用完后，乳糖操纵子才进行转录，形成利用乳糖的酶，这种现象称葡萄糖效应。附简单解释：只在乳糖与葡萄糖共存的情况下，细菌会优先使用葡萄糖作为代谢原料，而只有当葡萄糖浓度低的情况下，乳糖才被作为能量来源的现象，原因是高葡萄糖浓度下浓度低，无法合成-来刺激乳糖操纵子的启动。）糖蜜：是制糖工业的副产物，主要含蔗糖，总糖可达50%75%。除含糖外，还有很多杂质，使用前要进行预处理。淀粉：微生物必须有能分泌水解淀粉、糊精的酶类。来源广泛、价格底、可以解除葡萄糖效应。难利用、发酵液比较稠，需加入淀粉酶适度水解。糖的种类对微生物代谢产物的合成具有很大影响。17、简述双酶法制备淀粉糖的基本步骤及其优缺点反应原理： a-淀粉酶淀粉葡萄糖苷酶淀粉-糊精、低聚糖-葡萄糖液化糖化优点：作用条件温和，对设备要求低；副反应少，产品纯度高（酶的作用专一性），原料利用率高；对原料要求较低，淀粉乳浓度高缺点：所需设备较多反应时间较长（2-3天），夏天容易变质18、常用的无机氮源和有机氮源有哪些？有机氮源在发酵培养基中的作用？无机氮源：种类氨盐、硝酸盐和氨水等。特点：微生物对它们的吸收快，所以也称谓速效氮源。有机氮源：又称迟效氮源来源花生饼粉、黄豆饼粉、棉子饼粉、玉米浆、玉米蛋白粉。成分：提供氮源外，有些还提供大量的无机盐及生长因子。可溶性蛋白、生长因子生物素）、苯乙酸、乳酸、硫、例如磷、微量元素等。19、什么是生理性酸性物质？什么是生理性碱性物质？举例百度粘来的答案：无机氮源被菌体作为氮源利用后，培养液中就留下了酸性或碱性物质，这种经微生物生理作用（代谢）后能形成酸性物质的无机氮源叫生理酸性物质，如硫酸胺，若菌体代谢后能产生碱性物质的则此种无机氮源称为生理碱性物质，如硝酸钠。正确使用生理酸碱性物质，对稳定和调节发酵过程的有积极作用。20、什么是前体？前体添加的方式？是指某些化合物加入到发酵培养基后，能够被微生物直接用于产物的合成，而其自身的化学结构没有明显的变化，但产物的产量却大幅度提高，这类化合物称为前体。如苯乙酸作为青霉素前体使用；氯化物作为金霉素的前体等。前体使用时一般都采用流加的方法添加。21、常用产物促进剂的种类常用促进剂：各种表面活性剂（吐温、植酸等）、大豆油提炼物、甲醇等22、发酵培养基灭菌的基本要求是什么？培养基灭菌的要求：（1）达到要求的无菌程度（2）尽量减少营养成分的破坏。在灭菌过程中，培养基组分的破坏，是由两个基本类型的反应引起的：培养基中不同营养成分间的相互作用；对热不稳定的组分如氨基酸和维生素等的分解23、为什么发酵培养基采用高温短时灭菌效果的更佳，依据是什么？从微生物死亡动力学方程可以看出，随着温度的升高，微生物死亡速率加快，而比营养物质分解速度快得多，因此高温短时灭菌可达到相同的灭菌效果，而营养物质破坏大大减少。随温度的升高，灭菌反应速度常数增加的倍数大于营养成分破坏反应速度常数增加的倍数。因此，采用高温快速灭菌方法，即可达到杀死培养基中的全部微生物的目的，又可减少营养成分的破坏。24、简述影响培养基灭菌效果的因素1、灭菌时间2、温度3、培养基PH值：培养基中氢离子浓度接影响灭菌的效果。培养基的PH值越低，所需杀灭微生物的温度越低。6.0-8.0时最难灭菌。培养基成分：油脂、糖类及一定浓度的蛋白质可增加微生物耐热性；大肠杆菌.在水中加热60-65死亡；在10%糖溶液中，需要70加热46，在30%糖溶液中，需要加热30。另一些物质，如高浓度的盐类、色素等的存在等可削弱其耐热性4、泡沫：对灭菌极为不利，泡沫中的空气形成隔热层，使传热困难，热难穿透。在易产生泡沫的培养基中加入消泡剂。5、培养基中微生物数量：微生物数量越多，达到要求灭菌效果所需时间也越长。6、培养基的物理状态固体培养基比液体培养基灭菌时间长；颗粒越大，灭菌时蒸汽穿透所需时间越长，灭菌难，对于小于1mm的颗培养基，不必考虑颗对灭菌的影响，但含有少量大颗和粗纤维的培养基的灭菌，则要适当提高温度，在不影响培养基质量的条件下，采用粗过滤的方法预先处理，以防止培养基结块而造成灭菌不彻底。7、其他：微生物细胞的含水量、菌龄等会影响培养基的灭菌效果。25、培养基灭菌过程对营养成份和浓度有何影响？对发酵过程有何影响？26、什么是分批灭菌？什么是连续灭菌？分批灭菌和连续灭菌的优缺点分批灭菌也叫间歇灭菌或实罐灭菌、实消。培养基的间歇灭菌就是将配制好的培养基放在发酵罐或其他装置中，通入蒸汽将培养基和所用设备一起进行加热灭菌的过程，也称为实罐灭菌，或实消。培养基的连续灭菌就是将配制好的培养基在向发酵罐等培养装置输送的同时进行加热、保温和冷却而进行灭菌。27、无菌空气的标准？无菌空气的制备方法及特点？发酵对空气无菌程度的要求一般按染菌机率为10-3来计算，即1000次发酵周期所用的无菌空气只允许通过12个杂菌。无菌空气的制备方法及特点：加热灭菌（220，20秒）灭菌彻底，能耗大，成本高静电除菌除菌效果差，仅用于初除菌辐射灭菌254-265效果最佳，仅限表面灭菌介质过滤除菌主流的除菌方式28、空气过滤除菌的介质主要材料1绝对（表面）过滤。定义：滤空在表面；依靠直接拦截捕获颗粒。特点：易于控制过滤后的空气质量，节约能量和时间，但孔隙小于0.5，材料较贵，容量有限。2深层介质过滤。（1）、污染物被介质内部结构捕获的一种过滤介质，滤孔贯穿于整个介质厚度。（2）、调整流道可以获高容污能力。是以棉花、玻璃纤维、尼龙等纤维或活性炭作为介质填充成一定厚度的过滤层，或将超细玻璃纤维、聚乙烯醇、聚四氟乙烯、金属烧结材料制成过滤层，其介质的空隙大于被滤除的尘埃或微生物。空气流通过这种介质过滤层时，借助惯性碰撞、拦截滞流、静电吸附、扩散等作用，将其尘埃和微生物截留在介质层内，达到过滤除菌目的。特点：设备及操作费用低廉，适用于大量空气的处理。空气过滤设备：（1）以纤维状物或颗粒状物为介质所构成的过滤器纤维状或颗粒介质过滤器过滤层厚度大，体积大，压力降大，操作麻烦，装填介质费时费力。（2）以微孔滤纸、滤板、滤棒构成的过滤器。过滤纸类过滤器除菌效率相当高，对0.3以上颗粒的过滤效率达99.99%以上，阻力小，压力降小，但强度不大，尤其是受潮后强度更差。29、什么是种子的扩大培养？种子扩大培养的目的与要求？种子扩大培养的一般步骤？种子扩大培养是指将保存在砂土管、冷冻干燥管中处休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后，再经过扁瓶或摇瓶及种子罐逐级扩大培养，最终获得一定数量和质量的纯种过程，这些纯种培养物称为种子。30、霉菌、放线菌实验室种子制备的形式孢子做为霉菌实验室制备的种子有何优点？工艺流程短，容易控制，减少染菌机会，节约人力、物力31、什么是发酵级数？影响发酵级数的因素有哪些？种子罐级数：是指制备种子需逐级扩大培养的次数，取决于：菌种生长特性、孢子芽及菌体繁殖速度；所采用酵罐的容积32、简述发酵种子质量的影响因素及控制方法1、培养基：*培养基是直接影响种子培养质量，培养基各成分的关系恰当，才能最大程度挥菌种的特性，提高产量。*生产过程中经常出现种子质量不稳定的现象，其主要原因是原材料质量波动。*措施：1）营养成分要适当丰富和完全，氮源和维生素含量要高，糖分少些（培养生产菌体）；2）孢子培养基要用比较单一的氮源；营养成分适合种子培养的需要选择有利于孢子芽和菌体生长的培养基；3）培养基所用原料要经过发酵试验合格才可使用；严格控制灭菌后培养基的质量；种子罐营养成分要尽可能与发酵培养基相近。2、接种种龄与接种量*通常种龄是以处于生命力极旺盛的对数生长期，菌体量还未达到最大值时的培养时间较为合适。种龄长，菌种趋于老化，生产能力下降，菌体自溶；种龄太短，造成发酵前期生长缓慢。*接种量大小直接影响发酵周期：接种量大缩短延滞期和发酵周期、节约发酵培养动力消耗；过多会移代谢废物，影响发酵。3、培养条件：1)培养温度：温度过低，菌种生长发育缓慢温度过高会使菌丝过早自溶2)培养湿度：湿度低，孢子生长快；湿度大，孢子生长慢。3）PH：选择最适种子培养PH的原则是获得最大比生长速率和适当的菌量; 培养基保持适当PH：酸碱、生理缓冲剂培养最后一级种子的培养基的应接近于发酵培养基的，以便种子能尽快适应新的环境。5、培养时间和冷藏时间（1）培养时间：一般来说，衰老的孢子不如年轻的孢子，因为衰老的孢子已在逐步进芽阶段，核物质趋于分化状态。过于衰老的孢子会导致生产能力的下降。*措施：孢子培养的时间应该控制在孢子量多、孢子成熟、酵产量正常的（2）冷藏时间*孢子成熟程度与孢子斜面冷藏质量的有关。成熟的孢子耐冷藏。如土霉素生产菌种孢子斜面培养4天，孢子尚未成熟，现冷藏78天菌体细胞开始自溶。而培养5天成熟后冷藏，20天未现自溶。*冷藏时间宜短不宜长。例如在链霉素生产中，斜面孢子在6冷藏两个月后的发酵单位比冷藏一个月降低18%，冷藏3个月后降低35%。阶段终止培养。6、通风和搅拌在种子罐中足够的通气量可以提高种子质量。例如，青霉素的生产菌种在制备过程中将通气充足和不足两种情况下得到的种子分别接酵罐内，它们的发酵单位可相差1倍。通气量的多少与菌种、培养基性质和培养阶段有关。7、染菌的控制33、什么是菌体的生长比速？产物的形成比速？基质的消耗比速？产物和细胞得率？1)菌体比生长速率（specificgrowthrate)，是单位质量菌体在单位时间内的增量g/(gh),即菌体的生长速率除以菌体的浓度，单位为。或X表示菌体干重，菌体浓度为Cx反应细胞生长繁殖的快慢：受菌种种类和生长环境的影响。2)基质的消耗比速Qs：单位质量菌体在单位时间内消耗基质的量称为基质的消耗比速率，它表示细胞对营养物质利用的速率或效率。或（）3)产物比生产速率(Qp，g(或mo1)g菌体h)：系指每克菌体在单位时间（1h）内培养液中产物浓度的变化量，它表示微生物细胞合成产物的速度或效率4)产物的形成比速率Qp：（）5)产物得率系数：产物生成量相对于基质消耗量的收得率。用YP/S表示。YP/S相对于基质消耗的实际产物得率（mol/mol或g/g)P产物生成量（mol或g）。6)细胞得率系数：菌体的生长量相对于基质消耗量的收得率，用来描述微生物生长与基质消耗的关系。用YX/S表示。YX/S相对于基质消耗的实际生长得率（g/mol或g/g)X干细胞的生长量（g）S基质的消耗量（mol或g）34、什么是Monod方程其使用条件如何？各参数的意义与求解？当某种基质浓度下降到一定程度，为限制性基质时，比生长速率下降，对数期结束。这时比生长速率与基质浓度有关。1)Monod方程（培养过程中仅有单一限制性基质）：菌体的生长比速S：某种限制性基质浓度Ks：半饱和常数，为1/2m时的限制性基质浓度；max:最大比生长速度*上式中，如果所有的营养物质过量，均能满足S远远大于Ks的条件，则u=um为常数，细胞处于对数生长期。*在对数生长末期,营养物质迅速消耗,一旦营养物质浓度低而成为限制性营养物时，uum.*所以，莫诺得方程适用不同生长时期。当有多种限制营养物或存在抑制剂时，需要修正！2)*减速期：（Monod方程）（0）S为限制性营养物浓度=2Ks为底物利用常数，其数值相当于时的限制性营养物浓度3)*平衡期：=0（）4)*死亡期：035、td与max之间的关系倍增时间 (代时)：细胞浓度增长一倍所需的时间。36、根据微生物的培养方式分，发酵的类型有哪几种？1、分批培养（batchculture）2、连续发酵（continuousculture）3、补料分批培养（fed-upbatchculture）生产上最常用分批培养和补料分批培养。37、分批培养、连续培养、分批补料培养的概念及其各自优缺点分批培养：又称分批发酵，指在一个密闭系统内投入有限数量的营养物质后，接入少量的微生物菌种进行培养，使微生物在特定的条件下只完成一个生长繁殖周期的培养方法。（微生物可表现出典型的生长周期）连续培养概念：又称连续发酵，指按一定的速度向培养系统内添加新鲜的培养基，同时培养液以相同的速度流出，从而使发酵罐内培养物的液量维持恒定，使微生物细胞能在相对恒定的状态下生长。（恒定状态可有效延长分批培养的对数期）优点： 恒定状态可有效地延长分批培养中的对数期，达到稳定高速 培养微生物或产生大量代谢产物的目的。 避免分批培养所需的清洗、投料、灭菌、接种、放罐等各种操作，有利于提高生产率。 发酵产品质量稳定。 便于自动控制。 缺点：菌种在长时间培养中易变异，且容易染菌。 若操作不当，新加入的培养基与原有的培养基不易完全混合。连续发酵的最大特点是微生物细胞的生长速度、产物的代谢均处于恒定状态，可达到稳定、高速培养微生物细胞或产生大量代谢产物的目的。补料分批培养概念：又称半连续发酵，根据菌株生长和初始培养基的特点，在分批培养的某些阶段适当补加培养基，使菌体或其代谢产物的生产时间延长。定时补充物料，可使培养液中的底物浓度较长时间地保持在一定的范围内，既保证了微生物生长，又不会产生不利影响，从而达到提高容量产率、产物浓度和得率的目的。 优点： a.可避免一次投料过多，造成细胞大量生长，溶解氧不足， 通气搅拌设备无法适应的弊病; b.能控制营养缺陷型菌所需营养物量，使之高效率积累产物 c. 有利于前体的补充; d.可实现细胞的高密度培养 e. 便于优化培养。 补料技术可以采用少量多次、少次多量、流加或控制流加。38、分批发酵的不同生长时期的菌体比生长速率1)延迟期：细胞数目几乎不变化。，=02)对数生长期：细胞数目呈指数生长。细胞浓度随时间的变化呈现指数增长。微生物已经调整能适应新的培养环境，且培养基营养物质充足，有害代谢物少。在对数生长阶段，细胞的生长不受限制，因此比生长速率达到最大值。3)稳定期：细胞数目增长较快，但受营养物质浓度限制，细胞数目达到最大值，不再增长；在细胞生长代谢过程中，培养基中的底物不断被消耗，一些对微生物生长代谢有害的物质不断积累。受此影响，微生物的生长速率和比生长速率逐渐下降，直至为零，进入稳定期。=0=04)衰亡期：细胞出现负增长，细胞数目减少。随着营养物的进一步枯竭及有毒代谢物的累积，菌体死亡数增多，而生长的菌体数减少，整个群体进入衰亡期。dX/dt/0.在分批发酵生产中，均在衰亡期开始前已经停止发酵，所以衰亡期的研究对生产价值不大。39、简述延滞期长短对发酵的影响及解决方法种子培养基和培养条件必须合适，只有这样才能获得高的产量。接种后延滞期的长短关系到发酵周期的长短，而与产物形成速率和产率并无必然联系。实际生产过程中，为缩短发酵周期、提高设备利用宰、提高体积生产率，就必须尽可能地缩短延滞期。解决途径：一、尽量选择处于指数生长期的种子；二、扩大接种量。但是，如果要扩大接种量，又往往需要多级扩大制种，这不仅增加了酵的复杂程度，又易造成杂菌污染，故而应从多方面考虑。、种子基与酵基基本相同。40、分批培养中产物生成动力学：偶联型Qp=*Yp/x产物生成速率与菌体生长速率有紧密联系：以菌体细胞为基准的产物得率系数或单位质量细胞生成的产物，g/g细胞；比生长速率，；QP产物比生成速率；41、发酵过程的温度会不会变化？为什么？会。发酵热是引起发酵过程温度变化的原因。Q发酵Q生物Q搅拌Q蒸发Q辐射42、发酵热的定义。生物热的大小与哪些因素有关？发酵热就是发酵过程中所产生的净热量。Q发酵Q生物Q搅拌Q蒸发Q辐射。生物热Q生物：在发酵过程中，菌体不断利用培养基中的营养物质，将其分解氧化产生能量，一部分用于合成高能化合物（如ATP）提供细胞代谢产物合成需的能量，另一部分以热的形式散发，这散发出来的热就叫生物热。影响生物热的因素：菌株、培养基，发酵时期。菌种活力强、培养基丰富、菌体代谢旺盛，则产生热量多。生物热的大小还与菌体的呼吸强度有对应关系。1）生物热与发酵类型有关。微生物进行有氧呼吸产生的热比厌氧发酵产生的热多。2）培养过程中生物热的产生具有强烈的时间性。在培养初期，菌体处于适应期，菌数少，呼吸作用缓慢，产生热量较少。菌体在对数生长期时，菌体繁殖迅速，呼吸作用强，菌体也较多，所以产生的热量多，温度上升快，必须注意控制温度。特别是从对数成长期转入平衡期时，菌体浓度大，代谢旺盛，产生热量最多。培养后期，菌体已基本上停止繁殖，主要靠菌体内的酶系进行代谢作用，产生热量不多，温度变化不大，且逐渐减弱。43、温度对发酵有哪些影响？如何控制发酵过程温度？1）温度影响各种酶和蛋白质的性质：2）温度对发酵液物理性质的影响影响氧在发酵液中的溶解度：温度，溶氧影响基质的分解速率：如菌体对硫酸盐吸收在25时最小。温度对产物合成的影响3）温度影响发酵方向：改变发酵液的物理性质，间接影响细胞的生物合成，影响生物合成方向。e.g.1：四环素发酵中金色链霉菌：T30，产生金霉素；T达到35，产生四环素。e.g.2：谷氨酸发酵中扩展短杆菌：30培养后37发酵，积累过量乳酸。4）温度对菌的调节机制关系密切。同一种产生菌，菌体生长和积累代谢产物的最适温度往往不同。44、发酵过程温度的选择有什么依据？如何确定最适发酵温度？最适温度是指在该温度下最适于菌的生长或产物的生成，它是一种相对概念，它是一定的条件下测得的结果。最适温度与菌种、培养基成分、培养条件和菌体生长阶段有关。确定最适发酵温度。1、根据菌种及生长阶段选择微生物种类不同，所具有的酶系及其性质不同，所要求的温度范围也不同。如黑曲霉生长温度为37，谷氨酸产生菌棒状杆菌的生长温度为3032，青霉菌生长温度为30。2、根据培养条件选择温度选择还要根据培养条件综合考虑，灵活选择：通气条件时可适当降低温度，使菌呼吸速率降低些，溶氧浓度也可高些。培养基稀薄时，温度也该低些。因为温度高营养利用快，会使菌过早自溶。3、根据菌的生长情况确定时间菌生长快，维在较高温度时间要短些；菌生长慢，维较高温度时间可长些。培养条件适宜，如营养丰富，通气能满足，那么前期温度可高些，以利于菌的生长。总的来说，温度的选择根据菌种生长阶段及培养条件综合考虑。要通过反复实践来定出最适温度。45、发酵过程中pH会不会发生变化，为什么？会。发酵过程pH值变化的原因。主要因素：微生物种类、基础培养基的组成和发酵条件均影响发酵过程中的pH值。变化原因：基质代谢、产物形成、菌体自溶。46、pH对发酵的影响表现在哪些方面？1)pH对微生物生长的影响每一类菌都有其最适pH和能耐受的pH范围细菌:pH6.37.5；霉菌和酵母菌：pH4.05.8；酵母菌：pH3.86.0；放线菌：pH78控制一定的pH，不仅可以保证微生物生长，还可以防止杂菌污染。2）pH影响发酵的机理（1）pH影响酶的活性：当pH值抑制菌体某些酶的活性时使菌的新陈代谢受阻;（2）pH值影响微生物细胞膜所带电荷的改变，从而改变细胞膜的透性，影响微生物对营养物质的进出，因此影响新陈代谢的进行;（3）pH值影响培养基某些成分和中间代谢物的解离，从而影响微生物对这些物质的利用。（4）pH影响代谢方向：pH不同，往往引起菌体代谢过程不同，使代谢产物的质量和比例发生改变。47、设计实验确定发酵的最佳pH48、发酵过程的pH控制可以采取哪些措施？1)调节原始培养基的pH值基础培养具有合适碳源比例和盐类，稳定培养液的pH值，或加入缓冲剂，有很好的缓冲能力；2）发酵过程pH值的调节和控制（1）直接补加酸碱调节控制pH发酵过程中加入非营养基质的酸碱调节剂(NaOH、HCl)；当pH值偏离不大，加入强酸碱容易破坏缓冲体系，而且会引起培养液成分发生水解，较少使用。（2）通过调整通风量来控制pH值。在消泡剂加多的情况下，提高通气量可以加速脂肪酸的氧化，减少因脂肪酸的累积引起的pH值降低。（3）补加生理酸碱性基质来调节pH补加氨水、尿素、（NH）SO等，通过代谢调节pH值。补加生理酸碱性物质，既调节了发酵液的pH值，又可补充营养物质，还可减少阻遏作用。酸性基质：铵盐、糖、油脂、玉米浆(脱NH4)碱性基质：NO3盐、有机酸盐、氨水、尿素。（4）通过补料调节控制pH当pH值上升至超过最适值，意味着菌体处于饥饿状态，可加糖调节，糖的过量又会使pH值下降。采用补料的方法同时可以实现补充营养、延长酵周期、调节pH值和改变培养液的性质（如粘度）等几种目的，特别是产物合成有阻遏作用的营养物质，通过少量多次补加可避免对产物合成的影响。49、为何溶氧容易成为好氧发酵的限制性因素？工业发酵所用的微生物大多为好氧菌；因此需要供氧。只有当氧气溶于水中，才对菌体有用。在好氧发酵中，通常需要供给大量的无菌空气才能满足菌体对氧的需求，由于氧气属于难溶性气体，在水中的溶解度很低，故溶解氧往往是发酵生产的限制性因素。50、比耗氧速度和呼吸强度的概念？呼吸强度：QQ2mmolO2/g.h，也称氧的比消耗速率氧的消耗速率：也称微生物摄氧率rmmolO2/g.h。(其中，X=X0*eut，X每ml发酵培养液中的菌体质量浓度g/L)51、临界溶氧浓度、氧饱和度的概念？临界氧浓度CCr：各种微生物对发酵液中溶氧浓度的最低要求。对产物而言，便是不影响产物合成所允许的最低浓度。52、影响微生物需氧的因素有哪些？53、如何调节通气搅拌发酵罐的供氧水平？（1）改变通气速率（增大通风量）：增大KLa值。注意，过分增大通气速率会产生副作用，如泡沫生成、罐温增高等。（2）改变搅拌速度：转速较低时，增大搅拌速度对提高溶氧浓度有明显作用；当转速很高时，再增大搅拌速度起不到调节作用，反而打碎菌丝体，使菌体溶并减少产量。（3）改变气体组成中的氧分压（4）改变罐压：提高C*，不是十分有效（5）改变发酵液的理化性质：如加消沫剂、补加无菌水、改变培养基的成分等（6）加入传氧中间介质：传氧中间介质有血红蛋白、烃类碳氢化合物（煤油、石蜡等）。54、简述不同发酵周期溶解氧变化的趋势1）发酵前期，由于微生物大量繁殖，需氧量不断大幅度增加，此时需要氧超过供氧，溶氧明显下降2）发酵中后期，溶氧浓度明显地受到工艺控制手段的影响，如补料的数量、时机和方式等3）发酵后期由于菌体衰老，呼吸减弱，溶氧浓度也会逐步上升，一旦菌体自溶，溶氧就好明显地上升55、发泡对发酵有哪些有益之处，哪些有害之处？泡沫对发酵的不利影响主要表现在：1)降低了发酵罐的装料系数2)增加了菌群的非均一性3)增加了染菌机会4)大量起泡引起“逃液”，导致产物的损失5)泡沫严重时会影响通气搅拌的正常进行6)消泡剂的加入将给提取工序带来困难56、发酵培养基中容易引起泡的培养基原料有哪些？蛋白质原料，如玉米浆、蛋白胨、酵母粉、黄豆粉等是主要发泡剂。葡萄糖等本身起泡能力很低，但丰富培养基中较高浓度的糖类增加了培养基的粘度，起到稳定泡沫的作用，糊精含量多也会引起泡沫的形成。57、消泡的方法有哪些？常用的化学消泡剂有哪几类？（一）机械消泡机械消泡是一种物理作用，它靠机械强烈振动及压力变化，促使气泡破裂，并将随气体排出的液体加以回收。机械消泡的方式有罐内消泡和罐外消泡两种。优点：节省原料（消泡剂），减少由于加入消泡剂所引起的污染机会。缺点：不能从根本上消除引起稳定泡沫的因素。（二）化学消泡。化学消泡是一种使用化学消泡剂进