生物化学实验指导书.doc

生物化学实验指导书 (1)预习实验实验前必须认真预习实验内容，明确实验的目的，掌握实验原理，了解试验详细步骤，做到心中有数。 写好实验预习报告，否则，不能进行实验。 (2)遵守实验室纪律注意安全，保持室内安静，不大声说笑和喧哗。 (3)认真操作认真按照实验步骤和操作规程进行实验；及时、如实记录实验数据；实验完毕及时数据，并按时上交实验报告。 (4)做好卫生实验过程中保持实验台面、称量台、药品架、水池以及各种实验仪器的保持清洁整齐。 药品称完后立即盖好瓶盖放回药品架；严禁瓶盖及药勺混杂；切勿使药品洒落在天平和实验台面上；对污染的台面、仪器应及时、妥善清洁。 (5)注意安全确保实验过程的安全。 例如，实验室内严禁吸烟、饮水和进食；配制腐蚀性、毒性溶液和使用洗液必须严格小心按要求进行；严禁用嘴吸移液管和虹吸管；易燃液体不得接近明火和电炉；凡产生烟雾、有害气体和不良气味的实验，均应在通风条件下进行。 多余的重要试剂和各种有机试剂要按教师要求进行回收，不得丢弃；强酸强碱必须倒入废液缸或冲稀后排放；各种废物不得倒入水池，只能倒入废物桶。 (6)使用各类仪器，尤其是贵重精密仪器应严格遵守操作规程。 (7)对于小型玻璃器皿、仪器采取分组管理，每组使用固定的仪器和玻璃器皿，尽量避免使用他组仪器。 实验完毕必须及时清洗使用过的器皿、保持实验台面、实验柜整洁。 洗净、放好并清点各种玻璃仪器；确保各组所属仪器，如电炉、水浴锅、分光光度计、天平等处于电源关闭、清洁、正常状态；打破了玻璃仪器、发现仪器异常要及时向教师报告，不得将器皿遗弃在分光光度计内和其他实验台面上。 (8)结束实验并做好各自的卫生工作之后，经指导教师同意，方可离开实验室。 (9)由班长指定值日生认真做好实验室的公共卫生。 实验1索氏抽提法测定食物中脂肪含量【实验目的】通过本实验的学习掌握索氏提取器提取脂肪的原理和方法。 索氏提取器由提取瓶、提取管、冷凝器三部分组成的，索氏提取器装置见图。 提取时，采用低沸点有机溶剂回流抽提，除去样品中的粗脂肪。 样品位于提取管内。 加热提取瓶，有机溶剂气化，冷凝，当连接管内的有机溶剂液面超过虹吸管高度，溶有粗脂肪的有机溶剂经虹吸管流入提取瓶。 流入提取瓶的有机溶剂继续被加热气化、上升、冷凝，滴入提取管内，不断抽提出样品中的脂肪，如此循环往复，直到抽提完全为止。 由于有机溶剂的抽提物中除脂肪外，还或多或少含有游离脂肪酸、甾醇、磷脂、蜡及色素等类脂物质，因而抽提法测定的结果只能是粗脂肪。 【实验材料、主要仪器和试剂】1.试剂实验采用正己烷（实验结束后需要回收）2.材料奶粉、花生粉、芝麻粉、杏仁粉、核桃粉等。 3.器材 (1)索氏提取器 (2)水浴锅 (3)脱脂滤纸 (4)镊子 (5)100mL量筒 (6)分析天平 (7)烘箱【操作方法】1.样品处理将样品置于研钵中研磨细，放在80100烘箱中烘4h（实验前已备好）。 称取2g左右样品，置于烘干的脱脂滤纸上，准确记录其总重量，并包扎好，勿使样品漏出。 2.抽提把提取器各部分连接，接口处不能漏气。 将正己烷从提取管口，经虹吸管流入提取瓶内，约为瓶容积的1/22/3（100mL）。 将样品包用镊子放入提取管内。 套上冷凝管。 加热抽提在电热恒温90水浴中进行，回馏2h左右。 控制电热板的温度，每小时回馏35次为宜。 注解从提取管内吸取少量正己烷，滴在干净的滤纸上，待正己烷蒸干后，滤纸上不留有油脂的斑点则表示已经提取完全。 提取完毕，取出滤纸包。 回收提取管以及提取瓶中的正己烷。 将滤纸包在通风橱内风干后，再置入80烘箱中烘干、恒重，记录重量。 3.计算实验中，抽提结束，滤纸包减少的重量即为粗脂肪，因此样品中粗脂肪的百分含量按下式计算粗脂肪的含量（）=100式中W0滤纸包抽提后重量；W滤纸包抽提前重量。 注意事项 （1）若采用乙醚易燃、易爆，应注意规范操作。 （2）样品包内样品应低于提取管的虹吸部分，保证样品能被有机溶剂完全浸泡。 （3）加热抽提也可用电热板加热，但不能使用火焰加热的水浴锅，严禁用火焰直接加热索氏提取器。 注解 （1）也可采用抽提瓶增重法测定脂肪含量。 要求抽提瓶、提取管在使用前清洗干净，不带油脂；提取瓶测定前恒重；提取完毕后将有机溶剂通过减压法完全去除后，称量瓶子的增重。 （2）样品若是液体，应将一定体积的样品滴在滤纸上，在6080烘箱内烘干后，再装入提取管中提取。 0W W?（）样品重量实验2氨基酸的纸层析法分离鉴定【实验目的】掌握纸层析的基本技术，学习纸层析分离、鉴定氨基酸的方法。 纸层析是以滤纸作为支持物的分配层析法。 它利用不同物质在同一推动剂具有不同的分配系数，经层析而达到分离的目的。 在一定条件下，一种物质在某溶剂系统中的分配系数是一个常数，若以K表示分配系数K层析溶剂（又称推动剂），是选用有机溶剂和水组成的。 滤纸纤维素与水有较强的亲和力（纤维素分子的葡萄糖基上的-OH基与水通过氢键相作用）能吸附很多水分，一般达滤纸重的22左右（其中约有6的水与纤维素结合成复合物），由于这部分水扩散作用降低形成固定相；而推动剂中的有机溶剂与滤纸的亲和力很弱，可在滤纸的毛细管中自由流动，形成流动相。 层析时，点有样品的滤纸一端浸入推动剂中，有机溶解连续不断地通过点有样品的原点处，使其上的溶质依据本身的分配系数在两相间进行分配。 随着有机溶解不断向前移动，溶质被携带到新的无溶质区并继续在两相间发生可逆的重新分配，同时溶质离开原点不断向前移动，溶质中各组分的分配系数不同，前进中出现了移动速率差异，通过一定时间的层析，不同组分便实现了分离。 物质的移动速率以R f值表示R f各种化合物在恒定条件下，层析后都有其一定的R f值，借此可以达到分离、定性、鉴别的目的。 溶质的结构与极性、溶剂系统的物质组成与比例、pH值、滤纸质地以及层析温度、时间等都会影响R f值。 【仪器试剂和材料】1.仪器 (1)带橡胶塞500mL三角瓶（层析缸） (2)滤纸条 (3)薄膜手套 (4)电炉 (5)喷雾器 (6)毛细管 (7)5mL、2mL、1mL移液管各1支溶质在固定相中的浓度溶质在流动相中的浓度原点到层析点中心的距离原点到溶剂前沿的距离2.试剂 (1)标准氨基酸溶液A、B、C三种标准氨基酸溶液均配制成2mg/mL的0.1mol/L的盐酸溶液。 （三种氨基酸可能为精氨酸、丙氨酸和谷氨酸的任意一种） (2)展层剂按比例现配正丁醇88甲酸水1532（v/v）或10:2:1.5 (3)0.5%（w/v）的茚三酮丙酮溶液3.材料 (1)滤纸（裁成条状） (2)毛细管【操作步骤】 (1)将15ml展层剂注入三角瓶中，盖上橡胶塞。 (2)取准备好的滤纸放在干净的纸上，轻轻用直尺和铅笔在距滤纸底边1cm处划一条平行于底边的直线做为基线，将滤纸纵向对折。 （用手接触滤纸须带薄膜手套） (3)沿直线以一定的间隔做标记以指示标准氨基酸和样品的加样位置。 （用毛细管吸少量氨基酸样品点于标记的位置上。 点样时，毛细管口应与滤纸轻轻接触，样品直径一般控制在0.3cm之内。 风干。 (4)加样完毕后，将滤纸下边缘浸入三角瓶中，盖上橡胶塞。 当溶剂前沿上升到距纸上端适当高度（保证氨基酸能充分分离）时，取出滤纸，立即用铅笔记下溶剂前沿的位置，用电炉均匀加热，挥发干有机溶剂。 (5)用茚三酮丙酮溶液均匀地喷洒在滤纸有效面上，切勿喷得过多致使斑点扩散。 然后用吹风机或电炉加热，显色。 【结果处理】用铅笔轻轻描出显色斑点的形状，并用一直尺度量每一显色斑点中心与原点之间的距离和原点到溶剂前沿的距离，计算各色斑的R f值，并根据此三种标准氨基酸的性质，确定它们分别为什么氨基酸。 【思考题】 (1)氨基酸纸层析的原理是什么？ (2)影响物质移动速率R f值的因素有哪些？【附注】 (1)点样斑点不能太大（直径应小于0.3cm），防止层析后氨基酸斑点过度扩散和重叠；且吹风温度不宜过高，否则斑点变黄，且无法正常层析。 (2)展层开始时切勿使样品点浸入溶剂中。 (3)作为展层剂的正丁醇要重新蒸馏，甲酸必须用分析醇。 且展层剂要临用前配制，以免发生酯化，影响层析效果。 试验3淀粉酶活力的测定【实验目的】经过本次实验，掌握酶活测定的一般流程，还原糖的测定方法。 -淀粉酶可随机地作用于淀粉中的-1,4-糖苷键，生成葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖、糊精等还原糖，同时使淀粉的粘度降低，因此又称为液化酶。 还原糖能使3,5-二硝基水杨酸还原，生成棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸，其反应如下淀粉酶活力的大小与产生的还原糖的量成正比。 用标准浓度的葡萄糖溶液制作标准曲线，计算生成的还原糖的量，以单位重量样品在一定时间内生成的还原糖的量表示酶活力。 例如由样品在540nm吸光值（y），可知葡萄糖当量的还原糖的生成量（x）。 本次实验，在此反应条件下，反应1min转化生成1umol还原糖为1U。 计算1mL样品中，具有的酶活力。 （U/mL）本实验内容为测定淀粉酶样品中-淀粉酶的活力。 【实验材料、主要仪器和试剂】1.实验材料淀粉酶样品。 2.仪器 （1）恒温水浴（40、100） （2）试管21200型试管 （3）试管架y=0.6695xRy=0.6695xR22=0.999800.10.20.30.40.50.60.70.800.10.20.30.40.50.60.70.800.511.55葡萄糖含量（mmol）A540nm （4）移液管2mL1,1mL4,10mL1 （5）烧杯100ml1 （6）分光光度计3.试剂（均为分析纯） (1)标准葡萄糖溶液（1mg/mL）精确称取100mg葡萄糖，用蒸馏水溶解并定容至100mL。 (2)3,5-二硝基水杨酸试剂精确称取3,5-二硝基水杨酸1g，溶于20mL2mol/L NaOH溶液中，加入50mL蒸馏水，再加入30g酒石酸钾钠，待溶解后用蒸馏水定容至100mL。 盖紧瓶塞，勿使CO2进入。 若溶液混浊可过滤后使用。 (3)0.1mol/L pH5.6的柠檬酸缓冲液A液（0.1mol/L柠檬酸）称取C6H8O7H2O21.01g，用蒸馏水溶解并定容至1L。 B液（0.1mol/L柠檬酸钠）称取Na3C6H5O72H2O29.41g，用蒸馏水溶解并定容至1L。 取A液55mL与B液145mL混匀，既为0.1mol/LpH5.6的柠檬酸缓冲液。 (4)2%淀粉溶液称取2g淀粉加热溶于100mL0.1mol/L pH5.6的柠檬酸缓冲液中。 （本次实验，4种溶液已配好。 ）【操作步骤】 (1)葡萄糖标准曲线的制作取7支干净的试管，编号，按表1加入试剂表表1作葡萄糖标准曲线制作试剂管号1234567葡萄糖标准液（mL）00.10.30.50.70.91.0蒸馏水（mL）1.00.90.70.50.30.103,5-二硝基水杨酸（mL）1.01.01.01.01.01.01.0摇匀，置沸水浴中煮沸5min。 取出后冷却接近室温，加蒸馏水8mL，即总体积10mL。 以1号管作为空白调零点，在540nm波长下比色测定光密度，各浓度取平均值。 以葡萄糖含量为横坐标，光密度为纵坐标，绘制标准曲线。 (2)酶活力的测定取干净的试管，编号，按表2进行操作。 表表2样品酶活力测定表操作项目淀粉酶活力测定试管编号-1-2-3（对照组）样品（mL）0.10.10.1预保温将加入样品的试管和淀粉溶液置于40恒温水浴中保温10min添加2%淀粉溶液（mL）0.90.90.9对照组添加3,5-二硝基水杨酸（mL）终止反应1.000I-2/3进行酶反应在40恒温水浴中准确保温10min I-2/3添加3,5-二硝基水杨酸（mL）终止反应01.01.0沸水浴显色5min定容加入8mL蒸馏水将各试管摇匀，显色后进行540nm比色测定光密度，记录测定结果。 注解A540nm=A540nm样品-A540nm空白【结果计算】 (1)绘制葡萄糖标准曲线； (2)说明淀粉酶活力定义，根据酶活力测定结果和标准曲线计算样品中-淀粉酶的活力（U/mL）。 【思考题】 (1)淀粉溶液为什么用100mL0.1mol/L pH5.6的柠檬酸缓冲液稀释？ (2)操作中两次40水浴的目的分别是什么？ (3)对照试管为什么先加入3,5-二硝基水杨酸？ (4)100沸水浴的目的是什么？备注为了确保酶促反应时间的准确性，在进行保温这一步骤时，可以将各试管每隔一定时间（如30s）依次放入恒温水浴，准确记录时间，到达10min时取出试管，立即加入3,5-二硝基水杨酸以终止酶反应，以便尽量减小因各试管保温时间不同而引起的误差。 同时恒温水浴温度变化应不超过0.5。 试验4Folin-酚法测定蛋白质含量【实验目的】测定实验3中淀粉酶样品的蛋白含量。 掌握Folin-酚法测定蛋白质含量的原理和方法，熟悉分光光度计的操作。 Folin-酚试剂法包括两步反应第一步是在碱性条件下，蛋白质与铜作用生成蛋白质-铜络合物；第二步是此络合物将磷钼酸-磷钨酸试剂（Folin试剂）还原，产生深蓝色（磷钼蓝和磷钨蓝混合物），颜色深浅与蛋白质含量成正比。 此法操作简便，灵敏度比双缩脲法高100倍，定量范围为5100g蛋白质。 Folin试剂显色反应由酪氨酸、色氨酸和半胱氨酸引起，因此样品中若含有酚类、柠檬酸和巯基化合物均有干扰作用。 此外，不同蛋白质因酪氨酸、色氨酸含量不同而使显色强度稍有不同。 【实验材料、主要仪器和试剂】1实验材料淀粉酶样品（稀释200倍）。 2仪器 （1）移液管（0.5mL、1mL、5mL） （2）量筒 （3）精密电子天平 （4）分光光度计3试剂（纯度均为分析纯） （1）0.5mol/L NaOH (2)试剂甲（A）称取10g Na2CO3，2g NaOH和0.25g酒石酸钾钠，溶解后用蒸馏水定容至500mL。 （B）称取0.5g CuSO45H2O，溶解后用蒸馏水定容至100mL。 每次使用前将（A）液50份与（B）液1份，即为试剂甲，其有效期为1d，过期失效。 （3）试剂乙在1.5L容积的磨口回流器中加入100g钨酸钠（Na2WO42H2O）,钼酸钠（Na2Mo42H2O）25g和700mL蒸馏水，再加50mL85磷酸和100mL HCl充分混匀，接上回流冷凝管，以小火回流10h。 回流结束后，加入150g硫酸锂和50mL蒸馏水及数滴液体溴，开口继续沸腾15min，驱除过量的溴，冷却后溶液呈黄色（倘若仍呈绿色，再滴加数滴液体溴，继续沸腾15min）。 然后稀释至1L，过滤，滤液置于棕色试剂瓶中保存，使用前大约加水1倍，使最终浓度相当于1mol/L。 （4）标准牛血清白蛋白溶液在分析天平上精确称取0.0250g结晶牛血清白蛋白，倒入小烧杯内，用少量蒸馏水溶解后转入100mL容量瓶中，烧杯内的残液用少量蒸馏水冲洗数次，冲洗液一并倒入容量瓶中，用蒸馏水定容至100mL，则配成250g/mL的牛血清白蛋白溶液。 （试剂已配好）【操作步骤】1标准曲线的制作 （1）系列标准牛血清白蛋白溶液的配制取12支普通试管（两组平行），按表1加入标准浓度的牛血清白蛋白溶液和蒸馏水，配成一系列不同浓度的牛血清白蛋白溶液，做两组平行。 然后各加试剂甲5mL，混合后在室温下放置10min，再各加0.5试剂乙，立即混合均匀（这一步速度要快，否则会使显色程度减弱）。 30min后，以不含蛋白质的1号试管为对照，用分光光度计于650nm波长下测定各试管中溶液的光密度并记录结果。 （2）标准曲线的绘制以牛血清白蛋白含量（g/mL）为横坐标，以光密度平均值为纵坐标绘制标准曲线。 2样品的制备及测定取1mL稀释酶溶液，分别加入试剂甲5mL，混匀后放置10min，再各加试剂乙0.5mL，迅速混匀，室温放置30min，于650nm波长下测定光密度，并记录结果。 表1标准曲线和样品测定试管号123456样品重复2次次蒸馏水/ml10.80.60.40.200标准液或样品/ml00.20.40.60.81.01Folin-甲试剂/ml5.05.05.05.05.05.05.0置于室温下放置10min，并不时振荡Folin-乙试剂/ml0.50.50.50.50.50.50.5置立即摇匀，室温下放置30min，测A650A650值备注 （1）待测样品重复两次，取平均值。 （2）在实验操作时，标准曲线和样品的测定可同时进行。 【结果计算】计算出两重复样品光密度的平均值，根据标准曲线计算样品中蛋白质的含量（g/mL）。 【思考题】查阅课本、参考书，试述有几种测定蛋白含量的方法，及其简要原理和优、缺点，做归纳表。 生化实验评分办法生化实验两位同学一小组评分项目 （1）预习情况以小组为单位准备一份预习报告，包含实验步骤流程、数据记录表、疑问以及实验注意事项。 实验前务必完全了解操作步骤，否则一律不准进入实验室，实验中途，若发现同学未熟知操作步骤，指导教师将令该组同学即刻离开实验室，该次实验0分，不得补做。 缺预习报告小组，一律不准进入实验室实验，该次实验0分计算。 未按预习报告要求内容准备者，给予扣分。 （2）正式报告按正式报告要求的内容撰写。 操作步骤具体、数据翔实、讨论充分。 若发现数据不实者该次实验成绩0分计算。 迟交、完全抄袭他人者，该次实验成绩0分计算 （3）实验态度/报告缴交时间无故缺席该次实验成绩0分计算。 迟到15分钟者，该次实验态度扣2分，迟到15分钟以上，本次实验态度0分计算。 因人为操作不当，危害实验安全者；因人为操作不当，使实验仪器遭到重大损坏，或迫使实验必须中断者，全组该次实验态度0分。 实验完后，需将仪器、药品归还原位，并应仪器，清洗器皿后，方可离去。 未遵守各项实验室规则者，实验态度酌情扣分，情况严重者，教师立刻停止该同学进行实验，并令该同学离开实验室。 该次实验成绩0分计算。 预习报告于实验前带入实验室，实验结束后经教师检查签字后，方可离开实验室，否则本次实验成绩为0分。 实验报告连同预习报告装订后，于实验后指定时间之前缴交。 根据实验认真、负责程度打分。 实验报告格式实验报告格式 （1）实验前的准备预习报告每组同学在实验前需带预习报告，其目的在帮助学生了解实验之基本原理和实验流程，减少实验失败及确保实验安全性。 预习报告手写，应包括下列项目1.实验名称2.组号和组员3.基本原理4.实验步骤（须转成流程，简洁明了，便于实验操作；实