辅料对胃肠道中吡格列酮析出物粒径大小的影响.docx

辅料对胃肠道中吡格列酮析出物粒径大小的影响对生物等效性的影响Masaru Sugita1,3, Makoto Kataoka2,Masahisa Sugihara1, Susumu Takeuchi1,Shinji Yamashita21 SawaiPharmaceutical Co., Ltd., 5-2-30 Miyahara,Yodogawa-ku, Osaka, Osaka532-0003,Japan.2 Facultyof Pharmaceutical Sciences, Setsunan University, 45-1, Nagaotoge-cho, Hirakata,Osaka 573-0101,Japan.3 To whomcorrespondence should be addressed. (e-mail:m.sugitasawai.co.jp)关键词：生物等效性研究、羟丙基纤维素、粒度分布、吡格列酮、析出物摘要本研究旨在了解新开发的盐酸吡格列酮仿制药的生物不等效的原因，并改进配方使其与参比制剂（RLD）生物等效。在临床研究中，尽管具有与RLD相似的体外溶出曲线，但新的口服产品显示出较低的吡格列酮血药浓度。吡格列酮为弱碱,溶解度呈强pH依赖性,表明溶解于胃液中的吡格列酮会在小肠中析出。因此，进行体外实验，研究辅料对吡格列酮析出物的粒度分布的影响，然后讨论粒度对体内吸收的影响。来自RLD的吡格列酮析出物出现小粒径颗粒（1m）的峰，这在新产品的析出物中未检测到。作为辅料，羟丙基纤维素（HPC）影响吡格列酮析出物的粒度，并且制剂中HPC的用量被增加至与RLD相同的水平，改进产品析出物的粒度分布与RLD大致相同，并且在临床研究中成功证明了生物等效性。总之，对于具有低溶解度的药物，除了溶出曲线研究，对药物析出物的粒度分布进行分析的研究方式可以有助于获得更好的口服吸收体外体内相关性，开发出具备生物等效性的产品。简介生物药剂学分类系统（BCS）(1,2)中的II类药物具有低溶解度和高渗透性，在胃肠道（GI）中的溶解度和/或溶解速率被认为是限制口服吸收的主要因素(3)。在难溶性药物的制剂中使用各种方法提高溶解速率或溶解度来改善吸收。这些方法包括微粉化、成盐、共结晶、固体分散体、使用增溶剂或脂质基础配方。为确定这些制剂方法的作用，在进行体内研究之前，先体外测定制剂的药物溶出曲线。在口服药物产品的生物等效性研究中，广泛应用体外溶出试验测定活性成分的溶出曲线。对于仿制药，为了证明新开发的制剂与参比制剂（RLD）的生物等效性，首先在体外证实药物溶出曲线的相似性，然后进行人体临床研究(4)。口服药物研发的常规过程，源于药物的溶出曲线可反映胃肠道的溶出吸收这个观点。药物吸收的体外体内相关性（IVIVC）可通过体外溶出曲线情况来预测药物的口服吸收情况。然而，已经报道的很多案例研究发现在药物体外溶出和体内吸收之间的相关性很差。较差的IVIVC可能由于体外溶出试验条件不能反映人体胃肠道条件(5)。尽管使用模拟人工胃肠液（例如，分别为禁食或进食状态模拟肠液，FaSSIF或FeSSIF）组成的生物相关溶出介质可以显著改善可预测性(6-9)，其他条件如液体体积和搅拌强度的差异仍然是导致IVIVC差的原因。作为预测难溶性药物口服吸收的先进系统，开发了药物溶解与膜渗透的体外整合体系，以实现更好的IVIVC(10-18)。盐、共结晶或无定形形式（固体分散体）可以使药物以高于其热力学平衡溶解度的浓度溶解。现在这种过饱和状态被认为是改善难溶性药物吸收的关键因素之一，并且已作出大量努力使其在胃肠道中长时间维持较高的浓度(19-22)。然而，一旦开始成核反应，过饱和会导致药物的析出,析出的药物会重新溶解在胃肠道中以被吸收到体循环中,否则，析出的药物不能被吸收。如果析出和再溶解过程明显影响药物吸收的程度和速率，那么仅通过观察药物体外溶出曲线来预测体内吸收是不够的。换句话说，口服药物产品在胃肠道中的总体性能，不仅是溶出，还应该评估析出和再溶解过程以实现更好的IVIVC。盐酸吡格列酮是一种口服降糖药，属于BCS II类弱碱（pKa = 5.8和6.8，logP = 2.3）。盐酸吡格列酮的溶解度属pH依赖型，分别为4.4mg / ml（pH 1.2），0.042mg / ml（pH 3.0），0.005mg / ml（pH 4.0），0.0005mg / ml（pH 5.0）和0.0003mg / ml（pH 6.8）(23)。因此，口服给药后，吡格列酮在低pH条件下的胃中溶解，在小肠中可能析出或达到过饱和。本报告中，根据我们对盐酸吡格列酮仿制药的生物等效性研究，探讨析出和再溶解过程对药物吸收的影响，主要研究了吡格列酮析出物的粒度分布。材料和方法化学品和试剂盐酸吡格列酮（吡格列酮盐酸盐）购自Tokuyama Corporation（日本东京）。羟丙基纤维素（HPC）购自Nippon Soda Co.，Ltd（日本东京）。低取代羟丙基纤维素（L-HPC）购自Shin-Etsu Chemical Co.，Ltd（日本东京）。D-甘露醇购自Mitsubishi ShojiFoodtech Co.，Ltd（日本东京）。甲醇，乙腈，乙酸和甲酸铵购自Wako Pure ChemicalIndustries，Ltd（日本大阪）。药品ACTOStablets 30 (简称ACT30)和ACTOSOD tablets 30 (简称ACTOD30)购自武田制药（日本大阪）。产品560T4SC704（简称SC704）和560T4SH906（简称SH906）是由泽井制药（日本大阪）开发的ACTOD30的仿制药。这些吡格列酮产品的规格均为30mg。SC704的辅料包括D-甘露醇，乙基纤维素，羟丙甲纤维素（HPMC），HPC，三乙酸，L-HPC，阿斯巴甜，索马甜，交联聚维酮，微粉硅胶和硬脂富马酸钠。SH906的辅料包括D-甘露醇，HPC，L-HPC，阿斯巴甜，L-酒石酸钠，交联聚维酮，微粉硅胶和硬脂酸镁。ACT30的辅料包括一水乳糖，羧甲基纤维素钙，HPC和硬脂酸镁。ACTOD30的辅料包括D-甘露醇，一水乳糖，微晶纤维素，羧甲基纤维素钙，HPC，阿斯巴甜，氯化钠，黄氧化铁，交联聚维酮和硬脂酸镁。体外溶出研究照日本药典中的桨法测定ACT30，ACTOD30，SC704和SH906中的盐酸吡格列酮的溶出曲线(24)，即测定溶解的药物浓度随时间变化过程。转速为50rpm，溶出介质体积900ml，温度为37.00.5。使用pH1.2的JP1液（日本药典溶出试验液第一液）和pH6.8的JP2液（日本药典崩解试验液第二液）作为溶出介质。样品经0.45m过滤，用高效液相色谱法（HPLC）测定滤液含量。生物等效性研究生物等效性研究遵守赫尔辛基宣言和GCP规范。第一项研究在Doujin Memorial Meiwa Hospital（日本东京）进行，第二项研究由NITTAZUKA Medical Welfare CenterFukui General Hospital（日本福井）指挥，上述研究均由各实验机构的审查委员会批准。将受试制剂（SC704、SH906）口服给药后的吡格列酮的血药浓度与参比制剂（ACT30、ACTOD30）进行比较。试验设计为单次给药、双向交叉、空腹超过12小时、随机分组、清洗期7天。20或24个健康男性志愿者在被告知研究目的、方案和风险之后，交叉进行研究。受试者在研究前和研究期间至少7天没有服用过任何其他药物。在口服含有30mg吡格列酮的受试制剂或参比制剂后，分别于0、0.5、1、1.5、2、3、4、6、8、12、24和34h（或32）取血，离心，分离血浆并在-20储存待测。将血浆样品用1甲醇稀释以析出蛋白质，并通过液相色谱质谱串联法（LC/MS/MS）测定药物浓度。使用符合日本仿制药生物等效性试验指南的BESTS软件（3.0.4版本，CAC Corporation，Tokyo，Japan）计算并统计比较药代动力学参数。如果对数转换的Cmax和AUCt均值比（受试/参比）的90置信区间（90CI）在80-125内，则受试制剂和参比制剂之间的生物等效性可被接受。盐酸吡格列酮速释颗粒的制备在塑料袋中以振摇方式混合16.5g盐酸吡格列酮、24.5g D-甘露醇和7.5g L-HPC。随后，加入15.0g粘合剂进行制粒。制备两种型号的粘合剂，分别为1和10（w/w）HPC水溶液。将用1HPC和10（w/w）HPC水溶液制备的颗粒分别命名为“颗粒-1”和“颗粒-10”。湿颗粒置烘箱中60条件干燥1小时后烘干并用710m孔径的筛网过筛。含有析出颗粒的混悬液的制备通过以下步骤获得含有析出颗粒的混悬液：将ACTOD30，SC704，SH906，颗粒-1或颗粒-10（均含有30mg吡格列酮）分别溶解在5ml JP1液中，然后将1ml JP1液加入200ml McIlvaine缓冲液（pH6.5）中。经过10或30分钟的混合后，测定混悬液的粒度。在颗粒-1和颗粒-10的实验过程中，测定吡格列酮溶解在McIlvaine缓冲液中的浓度-时间曲线。向McIlvaine缓冲液中加入1ml JP1液后，在1、15、30、45、60、90、120和240分钟取样，立即经过0.45m过滤，滤液用LC/MS/MS法进行含量分析。含析出颗粒的溶液中粒度分布的测量使用Mastersizer 2000激光衍射粒度分析仪（Malvern InstrumentsLtd.，Worcestershire，UK）测量上述混悬液中析出颗粒的粒度分布。该设备可通过激光衍射技术测量0.01至2000m范围内的颗粒尺寸。考虑粒度仪的最佳参数，设定泵速300rpm，为避免在测量期间析出颗粒的分解或复溶，不采用超声处理。每个样品测量5次取平均值绘制粒度分布曲线。大鼠肠原位闭环吸收研究所有动物实验经Setsunan大学伦理审查委员会批准，并遵照实验动物护理原则（NIH出版号85-23，1985年修订）进行。为了评价HPC对吡格列酮的肠吸收的影响，使用原位闭环法将含有从颗粒-1和颗粒-10获得的析出的颗粒混悬液灌注于大鼠肠道。雄性Wistar大鼠（SHIMIZU Laboratory SuppliesCo.，ltd。，Kyoto，Japan）,体重200-250g（7-8周龄）,实验前禁食24h，可自由摄取水。打开腹腔后，插入硅胶管（内径3mm）在近端空肠处形成肠环（长10cm），然后缓慢注入盐水和空气除去肠内容物。使用前述方法（即含有析出颗粒的混悬液的制备）制备含有药物析出物颗粒的混悬液并储存10分钟，然后将大约0.5ml（2ml/kg体重）的混悬液引入肠道环中，并且将环的两端连接。在引入后15、30、60、90、120、180和240分钟从颈静脉采血，离心，分离血浆并储存在-20待测。将血浆样品用甲醇稀释10以析出蛋白质，然后通过LC/MS/MS分析。药物浓度测定使用LC/MS/MS系统测定样品中吡格列酮的浓度。LC系统：双梯度泵（LC10Avp），自动进样器（SIL-HTC）和柱温箱（CTO10Avp），来自Shimadzu Corporation（Kyoto，Japan）。色谱柱:CadenzaCD-C18（302.0mm，Imtakt Corporation Kyoto，Japan）。流动相:含有5mM甲酸铵的乙腈和乙酸的混合物（1000:1）。定量检测：API3000三重四极杆质谱仪（AB SCIEX MA，USA）质谱MS/MS检测器，采用正离子方式检测，选择多反应监测（MRM）模式扫描，离子通道为吡格列酮m/z357m/z134。结果体外溶出研究评价JP1液和JP2液中受试制剂（SC704）和参比制剂（ACT30）的盐酸吡格列酮的溶出曲线。结果见图1。盐酸吡格列酮的溶出曲线强烈依赖于其溶解度，在pH1.2和6.8下的溶解度分别为4.4和0.0003mg/ml(23)。在JP1液中，两产品中盐酸吡格列酮在15分钟内几乎完全溶出，因为盐酸吡格列酮在pH1.2条件下具有足够高的溶解度。比较前10分钟的溶出速率发现，与ACT30相比，SC704显示出更快的溶出速率，这种差异可能是因为SC704是因为需在口腔中快速崩解而设计的口腔速崩剂型。相比之下，在JP2液中，在两种产品中盐酸吡格列酮的溶出均不足10，因为其在pH6.8下溶解度非常低。根据日本仿制药生物等效性研究指南，这两种产品体外溶出曲线评价是“相似”的。人体生物等效性研究因为体外溶出试验显示两种产品的溶出曲线“相似”，所以进行临床研究以确认受试制剂与参比制剂的“生物等效性”。图2为健康志愿者口服SC704、ACT30后吡格列酮的药时曲线。如图2所示，20名受试者口服SC704后34小时的吡格列酮平均血药浓度更低，ACT30的AUCt和Cmax均高于SC704。根据日本指导原则，当对数转换的AUC t和C max均值比（受试/参比）的90置信区间（90CI）在80-125内，认为受试制剂和参比制剂生物等效。然而在本研究中，因为AUCt和Cmax的90CI分别为68.3-83.6和70.5-88.8，所以SC704被判定与ACT30生物不等效。析出物的粒度分布为了探究生物不等效性的原因，我们将重点集中在吡格列酮在胃肠道中的析出过程，因为药物在体外溶出试验中的溶解过程被认为是相似的。用ACT30，SC704或SC704（空白对照，不含吡格列酮）制备含有析出颗粒的混悬液并通过激光衍射测定其中的粒度分布，结果见图3。如图3所示，用ACT30和SC704制备的混悬液粒度分布曲线不同。在ACT30的粒度分布曲线中在约100m、4m和0.2m处检测到三个峰。相比之下，SC704仅在约70m处产生一个峰且在约6m处产生一个肩峰，但较小颗粒（小于1m）的峰消失了。然而，因为这两种产品是不同制剂，含有的辅料和添加剂不同，所以难以鉴定析出的吡格列酮的粒度分布的差异。图3所示的粒度分布曲线还可能包括不溶性成分的峰及其附聚物，如崩解剂。HPC对吡格列酮析出物的粒度分布的影响就这些制剂的成分而言，我们假设HPC含量的差异可能影响析出物的粒度分布。两种产品中均含有HPC作为粘合剂，但用量不同。根据专利信息(25)，ACT30中的HPC用量约为3.0mg；制剂SC704在制粒之前，先将含有0.3mg HPC、0.3mg HPMC和6.0mg乙基纤维素等聚合物的水性分散体喷雾在33.1mg盐酸吡格列酮（相当于30.0mg吡格列酮）上制备包衣微粒，然后将包衣微粒和其它辅料用含有0.45mg HPC的水溶液作为粘合剂制粒。为了评价HPC对析出物的粒度分布的影响，我们制备两种类型的颗粒，即颗粒-1和颗粒-10，两种颗粒仅HPC用量不同，盐酸吡格列酮和其他辅料均相同，颗粒-1：HPC/吡格列酮（w/w）=1/100（和SC704中比例最接近），对于颗粒-10中则为10/100（参照ACT30专利信息的比例）。用颗粒-1和颗粒-10制备含有析出颗粒的混悬液，并测定颗粒的粒度分布。如图4所示，仅颗粒-10的混悬液在约0.2-0.3m的粒度下观察到清晰的峰，颗粒-10混悬液的粒度分布与ACT30相似（如图3所示），而颗粒-1的粒度分布曲线则与SC704相似。从图3和图4的结果可以清楚地发现，HPC用量的差异引起析出物的粒度分布曲线的差异。因为颗粒中的HPC可溶于介质中，我们认为颗粒-10混悬液中直径小于1m的小颗粒来自析出的吡格列酮。将颗粒-1或颗粒-10溶解在5ml JP1液中后，量取1ml溶液加入到200ml McIlvaine缓冲液（pH6.5）中，此后测定吡格列酮的浓度以研究HPC对吡格列酮在pH6.5介质中浓度的影响（图5）。因为颗粒-1和-10中的盐酸吡格列酮已完全溶解在JP1液中，所以吡格列酮在JP1液中的浓度为6mg/ml（30mg/5ml）。因此，已经溶解的吡格列酮在McIlvaine缓冲液中的初始浓度理论上应该是30g/ ml（稀释200倍）。然而在第一个取样时间点（稀释后1分钟），吡格列酮在McIlvaine缓冲液中的溶解浓度仅为1.2g/ml，并在240分钟时逐渐降至约0.2g/ml。HPC的用量差异（颗粒-1和颗粒-10）在吡格列酮的浓度方面没有引起大的差别。HPC含量对吡格列酮的肠吸收的影响使用大鼠肠原位闭环方法进行肠吸收研究以确定析出物的粒度分布的差异是否会影响吡格列酮的吸收。用颗粒-1和-10制备含有析出颗粒和附聚物的混悬液，然后施用于大鼠肠环以观察吡格列酮在血液循环中的吸收。在将混悬液施用于大鼠肠道之前，通过HPLC测定溶解的吡格列酮的浓度，并未检测到吡格列酮的浓度存在明显差异（颗粒-10为680.3ng/ml，颗粒-1为704.9ng/ml）。图6显示了给予含有析出物的混悬液后吡格列酮的药时曲线。AUCt和Cmax计算结果见表1。尽管平均来说没有观察到AUCt或Cmax的显着差异，但是施用由颗粒-10制备的混悬液后，吡格列酮的血药浓度比颗粒-1高。此外，当施用由颗粒-10制备的混悬液时，血药浓度迅速增加在1小时达到Cmax。然而，在施用颗粒-1的混悬液后，血药浓度逐渐增加直到3小时达到Cmax。因为两种混悬液中吡格列酮的溶解浓度大致相同，所以血药浓度的差异可能源于析出的吡格列酮的再溶解速率的差异。图3所示的粒度分布曲线可能支持这一假设，因为仅在由颗粒-10制备的溶液中发现析出的吡格列酮的小颗粒（小于1m）。因此，认为这些小颗粒快速重新溶解在肠道中以被吸收到血液循环中是合理的。具有高用量HPC的盐酸吡格列酮的新口服产品基于颗粒-1和颗粒-10的实验结果，开发了盐酸吡格列酮（SH906）的新产品。在SH906中，在制粒之前不对盐酸吡格列酮进行包衣，将含有3.0mg HPC的水溶液用作粘合剂将盐酸吡格列酮和其它辅料制粒。此外，为了鉴定析出的吡格列酮的粒度，制备了不包括吡格列酮的SH906的空白对照，命名为SH906（空白对照）。用SH906、SH906（空白对照）和参比制剂（ACTOD30）制备含有析出颗粒的混悬液，通过激光衍射法测定粒度分布。如图7所示，SH906显示与ACTOD30相似的粒度分布曲线，在约0.2-0.3m处出现峰，在混悬液制备后10和30分钟观察到相同的分布。相比之下，SH906（空白对照）在小于1m的范围内没有产生峰。此外，在SC704或SC704（空白对照）中均未观察到较小的颗粒（小于1m），证实约0.2-0.3m的峰来自析出的吡格列酮，而不是来自包括HPC在内的其它辅料。该结果表明含有高用量HPC的新产品（SH906）可能和RLD（ACTOD30）生物等效。然后进行生物等效性临床研究，结果见图8。两种盐酸吡格列酮产品显示吡格列酮的血药浓度曲线相似;因此，在AUCt和Cmax中没有发现差异。对数转换的AUC t和C max均值比（受试/参比）的90置信区间（90CI）分别为95.7-111.6和96.6-113.6，在生物等效性的可接受范围内。讨论通常，为了证明新开发的口服药物产品和参比制剂的生物等效性，首先在体外测定溶出曲线的相似性，然后进行人体临床试验。然而，在本研究中，虽然盐酸吡格列酮的新口服产品具有与参比制剂相似的溶出曲线，但由于其口服给药后吡格列酮的血药浓度偏低，人体临床研究未能证明新产品的生物等效性。吡格列酮是一种难溶于水的药物，属于BCS II类。因为吡格列酮是弱碱，其盐酸盐在酸性条件下的JP1液中迅速溶解，但在pH6.8的JP2液中具有有限的溶解度（图1）。从体外溶出试验结果可以合理地认为，在口服给药后，盐酸吡格列酮完全溶解在胃中，然后在小肠中吡格列酮析出。析出的吡格列酮应该重新溶解在小肠中以被吸收到体循环中。在酸性条件下，我们的新产品（SC704）中盐酸吡格列酮的溶解速率比参比制剂（ACT30）快。因此，如果不考虑辅料对药物析出过程或随后再溶解的影响，就不能解释生物等效性研究中SC704产生较低的吡格列酮血药浓度（图2）的原因。因为在SC704和ACT30的组分中，最明显的差异是HPC的用量，所以我们重点关注HPC对吡格列酮体内吸收的影响。水溶性聚合物，如HPMC和HPC，可维持难溶药物的过饱和状态，并改善其口服吸收(20)。这些聚合物抑制过饱和溶液中药物分子的核反应(20-22,26)。如果吡格列酮也是这种情况，则ACT30中较高量的HPC可能通过防止吡格列酮在小肠中的析出而使之有较高的吸收。然而，如图5所示，HPC用量的差异不会使吡格列酮在pH6.5介质中的浓度（析出速率）-时间曲线有显著差异。此外，在将溶解的吡格列酮溶液（JP1）加到pH6.5的介质1分钟后，吡格列酮的浓度仅为1.2g/ ml。因为吡格列酮的初始浓度理论上为30g/ ml，所以该结果表明，在将溶液加入pH6.5的介质后，约96的溶解态吡格列酮在1分