毕赤酵母产木聚糖酶实验方案(最终).doc

. 重组毕赤酵母产木聚糖酶摇瓶培养实验一、 实验目的1) 熟练摇瓶发酵的操作流程和无菌操作技术。2) 掌握细胞浓度、产物浓度的表征和测定方法。3) 熟悉测定生长曲线和产物生成曲线的方法。二、 毕赤酵母简介甲醇营养型毕赤酵母 (Pichia pastoris) 表达系统是80年代初被开发和研制的一种新型酵母表达系统。40年前，Ogata等人首次发现有些酵母能够利用甲醇作为唯一的碳源和能源进行生长。随后，甲醇营养酵母作为潜在的单细胞蛋白 (single cell protein, SCP) 来源立即引起广泛关注，最初将其作为高蛋白的动物饲料在市场上销售。在20世纪70年代，Phillips Petroleum公司开发出毕赤酵母利用甲醇生长的培养基、发酵操作手册和高密度连续培养生产工艺。70年代的石油危机导致了甲烷价格的急剧上升，与此同时，动物饲料蛋白的主要替代源大豆价格的下降，导致利用甲醇生产SCP在经济上已不再合适。在以后的10年中，PhiLLips PetroLeum公司与SIBIA公司合作开发利用毕赤酵母作为生物体表达外源蛋白的研究，研究人员分离了醇氧化酶 (alcohol oxidase, AOX) 的基因和启动子，构建了表达载体和菌株，开发了毕赤酵母基因操作相关技术。成熟的SCP发酵方法的开发，加上醇氧化酶强启动子的可调控表达特性，极大地影响着外源蛋白在毕赤酵母中的高水平表达。1993年，Phillips Petroleum公司委托Invitrogen公司代理毕赤酵母表达系统产品。毕赤酵母能在以甲醇为唯一碳源的培养基中快速生长，其中醇氧化酶AOX甲醇代谢途径的关键酶可达细胞可溶性蛋白的30。而在葡萄糖、甘油或乙醇作为碳源的培养细胞中则检测不到AOX。AOX的合成是在转录水平调控的。其基因启动子具有明显的调控功能，可用于调控外源基因的表达。此调控作用是由一般碳源抑制/解抑制及碳源特殊诱导机制控制的。外源基因在甲醇以外的碳源中处于非表达状态，而在培养液中加入甲醇后，外源基因即被诱导表达。巴斯德毕赤酵母中存在着一种称为微体的细胞器，其中大量合成过氧化物酶，因此也称为过氧化物酶体。与大肠杆菌等原核表达系统相比，毕赤酵母作为一种低等真核生物，除了具有遗传操作简单、细胞生长快、易于培养等原核生物的特点外，又具有真核生物完整的蛋白表达、正确加工和修饰功能，能有效克服大肠杆菌系统表达蛋白过程中存在的不足；而与高等哺乳动物细胞相比，又具有产量高、培养成本低、产物的分离纯化简单等优点。因此，毕赤酵母表达系统因其具有表达效率高、外源基因遗传稳定、易实现高密度培养、产物可分泌和蛋白翻译后加工等众多其它表达载体所无法比拟的优点，已成为近年来极受青睐的外源蛋白表达宿主，受到越来越多的重视和利用。截止2005年，已有500多种外源蛋白通过毕赤酵母表达系统得到克隆表达，这些外源蛋白产品涉及食品、饲料、纺织和医药品等关系国计民生的多个行业。然而，要实现众多新的外源蛋白产品在工业发酵罐水平下大规模商业化生产，除了构建高效、稳定的毕赤酵母生产菌株外，利用过程控制的方法和手段，最大限度地提高生物反应器中基因工程菌的总生物量，发挥菌种的最大生产潜力，提高单位体积培养液中目标蛋白的表达水平是实现大规模、商业化重组蛋白生产、提高生产效率的一个关键因素。三、 毕赤酵母生产表达外源蛋白的发酵过程一般而言，毕赤酵母高密度流加培养生产表达外源蛋白过程由甘油分批培养、甘油流加培养和甲醇诱导表达三个不同阶段构成。甘油分批培养的目的是为了积累一定的生物量，同时抑制AOX启动子及外源蛋白表达；甘油流加培养是通过限制性的甘油流加，进一步增加生物量，尽可能地获得高细胞浓度，同时解除过量甘油对AOX启动子的抑制作用，为细胞进入诱导期作准备；甲醇诱导表达阶段是通过添加诱导剂甲醇，实现AOX高水平转录和外源蛋白的高效表达。四、 木聚糖酶简介木聚糖是植物细胞壁的主要成分之一，属于非淀粉多糖。作为半纤维素的一种，在自然界中是含量仅次于纤维素的可更新多糖，存在于各种陆生植物的几乎所有部位.它从仅由-1，4糖苷键连接的多聚糖线形分子到以-糖甘键形成取代基支链的高度分枝的异质多糖，结构变化的范围很大。通常，木聚糖以异质多糖形式存在并与纤维素结合在一起。木聚糖酶是木聚糖的专一降解酶。属于水解酶类，包括内切木聚糖酶、外切木聚糖酶和木糖苷酶三种。内切木聚糖酶能随机切断木聚糖主链上的木聚糖苷键，生成分子量不同的木寡糖；外切木聚糖酶则从木聚糖非还原性末端切下单个的D-木糖；而木糖苷酶则水解木寡糖生成D-木糖，且仅能水解木二糖。三者酶解作用产生的D-木糖可以被动物吸收和利用。近年来对木聚糖酶的研究发现，它应用于饲料中提高了饲料营养价值，突破了饲料资源开发利用的局限，增强了动物的生产与抗病能力，减少了动物排泄物造成的污染，作为一种环保添加剂，在发展环保型畜牧业中具有十分重要的意义与价值。五、 毕赤酵母产木聚糖酶摇瓶实验方案1. 培养基种子培养基 (g/L)：葡萄糖 20，酵母粉 10，蛋白胨 20。甘油生长培养基 (g/L)：甘油 20 mL/L，MgSO4 1，K2SO4 1，(NH4)2SO4 5，CaSO4 0.1，H3PO4 2% (v/v)，PTM1 10 mL/L，KOH 20，pH 6.0。甲醇诱导培养基(g/L)：甲醇 10 mL/L，MgSO4 1，K2SO4 1，(NH4)2SO4 5，CaSO4 0.1，H3PO4 2% (v/v)，PTM1 10 mL/L，KOH 20，pH 6.0。PTM1组成(g/L)：CuSO45H2O 6g，NaI 0.08g，MnSO4H2O 3g，Na2MoO4 0.2g，H3BO3 0.02g，CoCL2 0.5g，ZnCL2 20g，FeSO47H2O 65g，H2SO4 5mL，生物素 0.2g培养基配置要求：1) KOH 等其它试剂溶解后在灭菌前加入；2) PTM1、调pH用氨水和甲醇在灭菌后、接种前添加。3) 调pH用氨水的用量需提前确定。2. 操作步骤如图1：图1 毕赤酵母产木聚糖酶摇瓶实验操作流程图3. 分析检测1) 细胞浓度的测定采用比浊法，使用紫外分光光度仪进行测定。将从摇瓶中所采集的样品经适当稀释（控制吸光度在0.1-0.7），测定其在600nm下的吸光度OD600。2) 发酵上清液样品蛋白浓度测定(考马斯亮蓝比色法)原理考马斯亮蓝G-250是一种染料，在游离状态下呈红色，当它与蛋白质结合后变为青色。蛋白质含量在01000mg范围内，蛋白质-色素结合物在595nm下的吸光度与蛋白质含量成正比，故可用比色法测定A595。试剂配制(1) 标准蛋白质溶液 称取100mg牛血清白蛋白，溶于蒸馏水并定容至100mL，制成1g/L的原液。(2) 考马斯亮蓝G-250蛋白试剂 称取100mg考马斯亮蓝G-250，溶于50mL 90乙醇中，加入 85%(m/v)的磷酸 100mL，最后用蒸馏水定容到1000mL。此溶液在常温下可放置一个月。操作步骤标准曲线的制作取6支带塞试管，编号后，按下表所示加入相应试剂：操作项目管 号1 2 3 4 5 6标准蛋白质溶液 (mL)0 0.2 0.4 0. 6 0.8 1.0蒸馏水 (mL)1 0.8 0.6 0.4 0.2 0G-250试剂 (mL)各5蛋白质含量 (g)0 0.2 0.4 0.6 0.8 1盖上塞子，摇匀。放置2min后在595 nm波长下比色测定(比色应在1h内完成)。以牛血清白蛋白含量(g)为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘出标准曲线。发酵上清液样品制备及检测吸取经适当稀释的待测发酵上清液样品1.0mL于比色管中，加入5.0mL考马斯亮蓝G-250试剂，摇匀，25放置5min后，在595nm波长下