3微生物的营养与代谢.ppt

第3章微生物的营养与代谢 微生物的营养微生物的代谢 本章教学目标 1 了解微生物细胞的化学组成 2 理解微生物的营养要素及功能 3 理解微生物吸收营养物质四种方式的性质和特点 4 理解微生物生长曲线及生长特点 5 掌握微生物培养基的分类 常用培养基以及应用 教学重难点 重点 1 掌握微生物营养要素及碳源谱 氮源谱中主要的培养基原料 2 着重掌握培养的有关知识 包括培养基配制方法和注意事项 3 领悟培养基的设计与微生物纯培养技术之间的重要关系 难点 碳源 氮源 能源 生长因子 选用和设计培养基的原则和方法 选择性和鉴别性培养基及作用原理 微生物同其他生物一样都是具有生命的 微生物细胞直接同生活环境接触并不停地从外界环境吸收适当的营养物质 在细胞内合成新的细胞物质和贮藏物质 并储存能量 微生物从环境中吸收营养物质并加以利用的过程即称为微生物的营养 nutrition 那些能够满足机体生长 繁殖和完成各种生理活动所需要的物质通常称为微生物的营养物质 第1节微生物的营养 一 微生物细胞的化学组成和营养要素营养物质是微生物构成菌体细胞的基本原料 也是获得能量以及维持其它代谢机能必须的物质基础 微生物吸收何种营养物质取决于微生物细胞的化学组成 一 微生物细胞的化学组成 分析微生物细胞的化学成分 发现微生物细胞与其他生物细胞的化学组成并没有本质上的差异 微生物细胞平均含水分80 左右 其余20 左右为干物质 在干物质中有蛋白质 核酸 碳水化合物 脂类和矿物质等 这些干物质是由碳 氢 氧 氮 磷 硫 钾 钙 镁 铁等主要化学元素组成 其中碳 氢 氧 氮是组成有机物质的四大元素 大约占干物质的90 97 其余的3 10 是矿物质元素 这些矿质元素对微生物的生长也起着重要的作用 微生物菌体的化学组成 元素水平 主要元素 碳 氢 氧 氮 磷 硫 钾 镁 钙等 微量元素 锌 锰 氯 钼 硒 钴 铜等 占细胞干重的97 微生物的营养要素 营养六要素 碳源 氮源 能源 生长因子 无机盐和水 按照营养物质在菌体中生理作用的不同 可将它们分成六大类 无论从元素水平还是营养要素水平 微生物的营养要求与摄食型的动物 含人类 和光合自养型的植物都十分接近 生物之间存在 营养上的统一性 微生物细胞的化学组成 微生物细胞的化学组成 微生物细胞 水 70 90 干物质 无机物 灰分 矿物质 有机物蛋白质 糖 脂 核酸 维生素等及其降解产物 微生物和动物 植物营养要素的比较 二 微生物的营养物质及其生理功能 通过了解微生物的化学组成 可见微生物在新陈代谢活动中 必须吸收充足的水分以及构成细胞物质的碳源和氮以及钙 镁 钾 铁等多种多样的矿质无素和一些必须的生长辅助因子 才能正常地生长发育 一 水分水分是微生物细胞的主要组成成分 不同种类微生物细胞含水量不同 同种微生物处于发育的不同时期或不同的环境其水分含量也有差异 幼龄菌含水量较多 衰老和休眠体含水量较少 微生物所含水分以游离水和结合水两种状态存在 两者的生理作用不同 结合水不具有一般水的特性 不能流动 不易蒸发 不冻结 不能作为溶剂 也不能渗透 游离水则与之相反 具有一般水的特性 能流动 容易从细胞中排出 并能作为溶剂 帮助水溶性物质进出细胞 微生物细胞游离态的水同结合态的比例为4 1 微生物细胞中的结合态水约束于原生质的胶体系统之中 成为细胞物质的组成成份 是微生物细胞生活的必要条件 游离水是细胞吸收营养物质和排出代谢产物的溶剂及生化反应的介质 一定量的水分又是维持细胞渗透压的必要条件 由于水的比热高又是热的良导体 能有效地调节细胞内的温度 微生物如果缺乏水分 则会影响代谢作用的进行 不同微生物细胞含水量不同 同种微生物处于发育的不同时期或不同的环境 其含水量也有差异 幼龄菌含水量较多 衰老和休眠体含水量较少 水分含量 细菌酵母霉菌芽孢孢子水份 75 8570 8085 904038干物质 15 2520 3010 156062 水的生理功能主要有 起到溶剂与运输介质的作用 参与细胞内一系列化学反应 维持蛋白质 核酸等生物大分子稳定的天然构象 通过水合作用与脱水作用控制由多亚基组成的结构 高比热 高汽化热等 以保证微生物的生命活动 微生物细胞含水量很高 细菌 酵母和霉菌菌体分别是80 75 和85 而霉菌孢子含水39 细菌芽孢含水很低 约为30 左右 水分活度aw 表示天然或人为环境中微生物可实际利用的游离水的含量 同温同压下 某溶液的蒸气压 P 与纯水蒸气压 P0 之比 aw P P0 纯水的aw 1 无水产品 水蒸气压为零 aw 0 0 aw 1 各类微生物aw范围 0 600 0 998 不同细胞及不同细胞结构中游离水的含量有较大差别 二 碳源物质凡是可以被微生物利用 构成细胞代谢产物碳素来源的物质 统称为碳源物质 碳源物质通过细胞内的一系列化学变化 被微生物用于合成各代谢产物 微生物对碳素化合物的需求是极为广泛的 根据碳素的来源不同 可将碳源物质分为无机碳源物质和有机碳源物质 糖类是较好的碳源 尤其是单糖 葡萄糖 果糖 双糖 蔗糖 麦芽糖 乳糖 绝大多数微生物都能利用 此外 简单的有机酸 氨基酸 醇 醛 酚等含碳化合物也能被许多微生物利用 所以我们在制作培养基时常加入葡萄糖 蔗糖作为碳源 淀粉 果胶 纤维素等 这些有机物质在细胞内分解代谢提供小分子碳架外 还产生能量供合成代谢需要的能量 所以部分碳源物质既是碳源物质 同时又是能源物质 在微生物发酵工业中 常根据不同微生物的需要 利用各种农副产品如玉米粉 米糠 麦麸 马铃薯 甘薯以及各种野生植物的淀粉 作为微生物生产廉价的碳源 这类碳源往往包含了几种营养要素 可以无机碳源提供主要碳素营养的 自养微生物 较少 自然界中 利用有机碳源的微生物种类占绝大多数 其中必须以有机碳源提供碳素营养的 异养微生物 绝大多数 从整体上看 微生物是自然界中碳源谱最广的生命形式 从某种角度来说 世界上存在的所有有机物 几乎没有微生物不能利用的 微生物的生物多样性 目前在微生物发酵工业中所利用的碳源物质主要有单糖 蔗糖 淀粉 糖蜜 麸皮 米糠 代粮发酵 纤维素 石油 CO2等 对大多异养菌来说 其最适碳源是 C H O 型碳源 其中 糖类 最广泛 最经济酸醇脂类 次要糖类中 单糖 双糖 多糖己糖 戊糖葡萄糖 果糖 半乳糖 甘露糖等淀粉 纤维素 几丁质等一般不把含蛋白质 氨基酸的牛肉膏 蛋白胨等原料降格做碳源使用 微生物的碳源谱 注意 碳源谱广泛 是针对整个微生物界来说的 对某一具体微生物来说 差异很大 对一切异养菌来说 其碳源可同时兼作能源 因此碳源是它们的双功能营养物 对天然来源的碳源营养物 如糖蜜 淀粉质原料 来说 除主要提供碳源营养外 其中还含有氨基酸 无机盐等多种营养成分 三 氮源物质微生物细胞中大约含氮5 13 它是微生物细胞蛋白蛋和核酸的主要成分 在微生物生长繁殖过程中 能为其提供氮素营养来源的物质称氮源 即 是用来满足菌体物质中或代谢产物中的氮素需要的营养物质 氮素对微生物的生长发育有着重要的意义 微生物利用它在细胞内合成氨基酸和碱基 进而合成蛋白质 核酸等细胞成分 以及含氮的代谢产物 无机的氮源物质一般不提供能量 只有极少数的化能自养型细菌如硝化细菌可利用铵态氮和硝态氮在提供氮源的同时 通过氧化产生代谢能 微生物营养上要求的氮素物质可以分为三个类型 1 空气中分子态氮只有少数具有固氮能力的微生物 如自生固氮菌 根瘤菌 能利用 2 无机氮化合物如铵态氮 NH4 硝态氮 NO3 和简单的有机氮化物 如尿素 绝大多数微生物可以利用 3 有机氮化合物大多数寄生性微生物和一部分腐生性微生物需以有机氮化合物 蛋白质 氨基酸 为必需的氮素营养 实验室常用的无机氮源有碳酸铵 硝酸盐 硫酸铵 尿素 蛋白胨 牛肉膏 酵母膏等 生产上常用的氮源有硝酸盐 铵盐 尿素 氨以及蛋白含量较高的鱼粉 蚕蛹粉 黄豆饼粉 花生饼粉 玉米浆等 蛋白氮必须通过水解之后降解成胨 肽 氨基酸等才能被机体利用 这种氮源叫迟效氮源 无机氮源或以蛋白质降解产物形式存在的有机氮源可以直接被菌体吸收利用 这种氮源叫做速效氮源 速效氮源 通常是有利于机体的生长 迟效氮源有利于代谢产物的形成 一般而言 能利用有机氮的也可以利用无机氮但是 能利用无机氮的不一定能利用有机氮 对大多数异养菌来说 其最适氮源是 N C H O 型或 N C H O X 型氮源 有机氮源 N H 型氮源 无机氮源 如NH4 次之 氨基酸自养型生物 不需要氨基酸做氮源 能利用尿素 铵盐 硝酸盐甚至氮气等自行合成所需氨基酸的生物 氨基酸异养型生物 需要从外界吸收现成的氨基酸做氮源才能满足需要的 按对氨基酸的需要的不同 可将微生物生物分为 四 无机元素微生物细胞中的矿物元素约占干重的3 10 左右 它是不可缺少的微生物细胞结构物质组成成分和微生物生长的营养物质 许多无机矿物质元素构成酶的活性基团或酶的激活剂 并具有调节细胞的渗透压 调节酸碱度和氧化还原电位以及能量的转移等作用 微生物需要的无机矿质元素分为常量元素和微量元素 常量矿质元素是磷 硫 钾 钠 钙 镁 铁等 磷 硫的需要量很大 磷是微生物细胞中许多含磷细胞成分 如核酸 核蛋白 磷脂 三磷酸腺苷 ATP 辅酶的重要元素 硫是细胞中含硫氨基酸及生物素 硫胺素等辅酶的重要组成成分 钾 钠 镁是细胞中某些酶的活性基团 并具有调节和控制细胞质的胶体状态 细胞质膜的通透性和细胞代谢活动的功能 微量元素有钼 锌 锰 钴 铜 硼 碘 镍 溴 钒等 一般在培养基中含有0 1mg L或更少就可以满足需要 无机盐的生理功能 无机元素的来源和功能 元素人为提供形式生理功能PKH2PO4 K2HPO4核酸 磷酸和辅酶的成分SMgSO4含硫氨基酸 含硫维生素成分KKH2PO4 K2HPO4酶的辅因子 维持电位差和渗透压NaNaCl维持渗透压 某些细菌和蓝细菌需要CaCa NO3 2 CaCl2胞外酶稳定剂 蛋白酶辅因子 细菌芽孢和真菌孢子形成MgMgSO4固氮酶辅因子 叶绿素成分FeFeSO4Cyt成分 合成叶绿素 白喉毒素和氯高铁血红素所需MnMnSO4超氧化物歧化酶 氨肽酶 L 阿拉伯糖异构酶等的辅因子CuCuSO4氧化酶 酪氨酸酶的辅因子CoCoSO4VB12复合物的成分 肽酶的辅因子ZnZnSO4碱性磷酸酶 脱氢酶 肽酶 脱羧酶辅因子Mo NH4 6Mo7O24固氮酶和同化型及异化型硝酸盐还原酶的成分 五 生长因子生长因子是微生物维持正常生命活动所不可缺少的 微量的特殊有机营养物 这些物质微生物自身不能合成 必须在培养基中加入 缺少这些生长因子就会影响各种酶的活性 新陈代谢就不能正常进行 生长因子是指维生素 氨基酸 嘌呤 嘧啶等特殊有机营养物 而狭义的生长因子仅指维生素 这些微量营养物质被微生物吸收后 一般不被分解 而是直接参与或调节代谢反应 在自然界中自养型细菌和大多数腐生细菌 霉菌都能自己合成许多生长辅助物质 不需要另外供给就能正常生长发育 缺乏合成生长因子能力的微生物称为 营养缺陷型 微生物 另外有些微生物生长还需要其它特殊的成分 例如某些乳酸杆菌生长需要核苷 某些酵母菌和真菌生长需要肌醇 某些肺炎球菌生长需要胆碱等 配制培养基时 常使用生长因子丰富的天然物质制备物作为补充生长因子的培养基成分 如 酵母膏 玉米浆 麦芽汁 肝浸液等 六 能源 能为微生物的生命活动提供最初能量来源的营养物或辐射能 称能源 能源谱 化学物质 辐射能 化能异养微生物的能源 有机物 无机物 化能自养微生物的能源 光能自养和光能异养微生物的能源 单功能营养物 如光能多功能营养物 如铵盐 氨基酸等 二 微生物对营养物质的吸收 微生物不象动物那样具有专门的摄食器官 也不象植物那样具有根系吸收营养和水分 它们对营养物质的吸收是借助生物膜的半渗透性及其结构特点以几种不同的方式来吸收营养物质和水分的 如果营养物质是大分子的蛋白质 多糖 脂肪 微生物则分泌出相应的酶 这类在细胞内产生 分泌到细胞发挥作用的酶称为胞外酶 将大分子降解成小分子后 再吸收利用 各种物质对细胞质膜的透性不一样 就目前对细胞膜结构及其传递系统的研究 认为营养物质主要以以下几种方式透过细胞膜 一 单纯扩散 simplediffusion 这是通过细胞膜进行内外物质交换最简单的一种方式 营养物质通过分子的随机运动透过微生物细胞膜上的小孔进出细胞 其特点是物质由高浓度区向低浓度区扩散 浓度梯度 这是一种单纯的物理扩散作用 不需要能量 一旦细胞膜两侧的浓度梯度消失 即细胞内外的物质浓度达到平衡 细胞内外的物质交换达到动态平衡 所以输送物质的速度较低 单纯扩散是非特异性的 没有运载蛋白质 渗透酶 参与 也不与膜上的分子发生反应 扩散的物质本身也不发生改变 单纯扩散的物质主要是一些小分子物质 如一些气体 O2 CO2 水 某些无机离子及一些水溶性小分子 甘油 乙醇等 单纯扩散模式图 细胞膜外 细胞膜内 细胞膜 二 促进扩散 facilitateddiffusion 除单纯扩散外 在细胞膜上还存在多种具有运载营养物质功能的特异性蛋白质 称为渗透酶 它们大多是诱导酶 当外界存在所需的营养物质时 能诱导细胞产生相应的渗透酶 每一种渗透酶能帮助一类营养物质的运输 这种吸收方式的特点是依靠渗透酶与底物的亲和力的改变 达到携带营养物质的作用 具备以下特点 物质由高浓度区向低浓度区扩散 浓度梯度 这是一种单纯的物理扩散作用 不需要能量 一旦细胞膜两侧的浓度梯度消失 即细胞内外的物质浓度达到平衡 细胞内外的物质交换达到动态平衡 现在已分离出有关葡萄糖 半乳糖 阿拉伯糖 亮氨酸 精氨酸 酪氨酸 磷酸 Ca2 Na K 等的载体蛋白 它们的分子量介于9000 40000Da之间 而且都是单体 促进扩散是真核生物的普遍运输机制 如酵母菌运输糖类就是通过这种方式 在原核生物中却相对少见 在厌氧微生物中 促进扩散的过程常参与某些化合物的吸收和发酵产物的排出 特点 营养物质本身在分子结构上也不会发生变化不消耗代谢能量 故不能进行逆浓度运输运输的速率由胞内外该物质的浓度差决定 但养料浓度过高时 与载体蛋白出现饱和效应需要细胞膜上的载体蛋白 透过酶 参与物质运输被运输的物质与载体蛋白有高度的特异性促进扩散的运输方式多见于真核微生物中 例如通常在厌氧生活的酵母菌中 某些物质的吸收和代谢产物的分泌是通过这种方式完成的 三 主动运输 activetransport 靠浓度梯度吸收营养物质显然不能满足高速生长繁殖的微生物的需要 事实上微生物细胞中有些营养物质以高于细胞外的浓度在细胞内积累 如大肠杆菌在生长期中 当以乳糖作为碳源时 细胞内乳糖的浓度比周围环境高出500倍 主动运输的特点是营养物质的吸收不受浓度梯度的影响 并且多数情况是由低浓度向高浓度进行 逆浓度梯度地被 抽 进细胞内的 这个过程不仅需要渗透酶携带 渗透酶与底物有高度的特异性 其与底物的亲和力随渗透酶的构型而改变 渗透酶构型的改变 需要消耗代谢能量 能量由腺三磷 ATP 提供 由于对其营养物质具有高度亲和力 并且特异性地与之结合 形成渗透酶 运载物质复合体 复合体从膜外方转移到细胞膜内表面 消耗代谢能量ATP 使渗透酶构型发生变化 亲和力减弱 于是被结合的物质则被释放到细胞质中去 构型变化的渗透酶 再获得能量恢复原状 亲和力增强 又可重复进行这种主动运输 这种吸收方式是微生物物质运输的主要方式 特点 需要消耗代谢能可以进行逆浓度运输的运输方式需要载体蛋白参与对被运输的物质有高度的立体专一性被运输的物质在转移的过程中不发生任何化学变化不同的微生物在主动运输过程中所需的能量来源不同 好氧微生物中直接来自呼吸能 厌氧微生物主要来自化学能 光合微生物中则主要来自光能 主动运输是微生物吸收营养物质的主要方式 主动运输模式图 细胞膜 细胞膜外 细胞膜内 恢复原构象 移位 再循环 结合 构象改变 四 基团转位 grouptranslocation 微生物对营养物质吸收过程中 还有一种特殊的运输方式 叫基团转位 这种方式除具有主动运输的特点外 主要是被转运的物质改变了本身的性质 有化学基团转移到被转运的营养物质上面去 降低底物与载体的亲和力 这种运输过程的磷酸转移酶系统包括酶 酶 和热稳定蛋白 HPr 酶 是非特异性的 它们对许多糖都一样起作用 酶 是膜上的结构酶 并能诱导产生 它对某一种糖具有特异性 只能运载某一种糖类 酶 同时起着渗透酶和磷酸转移酶的作用 HPr是热稳定的可溶性蛋白质 它能够象高能磷酸载体一样起作用 该酶系统催化的反应分两步进行 运送机制 是依靠磷酸转移酶系统 即磷酸烯醇式丙酮酸 己糖磷酸转移酶系统 运送步骤 1 少量的HPr被磷酸烯醇丙酮酸 PEP 磷酸化细胞内高能化合物磷酸烯醇式丙酮酸 PEP 的磷酸基团把HPr激活 酶 PEP HPr丙酮酸 P HPrHPr是一种低分子量的可溶性蛋白 结合在细胞膜上 具有高能磷酸载体的作用 2 糖被磷酸化后运入膜内膜外环境中的糖先与外膜表面的酶 结合 再被转运到内膜表面 这时 糖被P HPr上的磷酸激活 并通过酶 的作用将糖 磷酸释放到细胞内 酶 P HPr 糖糖 P HPr酶 是一种结合于细胞膜上的蛋白 它对底物具有特异性选择作用 因此细胞膜上可诱导出一系列与底物分子相应的酶 基团转位可转运糖 糖的衍生物 如葡萄糖 甘露糖 果糖 N 乙酰葡萄糖胺和 半乳糖苷以及嘌呤 嘧啶 碱基 乙酸 但不能输送氨基酸 等 这个运输系统主要存在于兼性厌氧菌和厌氧菌中 但某些好氧菌 如枯草杆菌和巨大芽孢杆菌也利用磷酸转移酶系统将葡萄糖传送到细胞内 四种运输营养物质方式的比较 自养型生物 微生物在长期进化过程中 由于生态环境的影响 逐渐分化成各种营养类型 根据微生物要求碳源的性质和能量来源不同将微生物分为光能自养型 光能异养型 化能自养型和化能异养型四种营养类型 三 微生物的营养类型 一 光能自养型微生物利用光能为能源 以二氧化碳 CO2 或可溶性的碳酸盐 CO32 作为唯一的碳源或主要碳源 以无机化合物 水 硫化氢 硫代硫酸钠等 为氢供体 还原CO2 生成有机物质 光能自养型微生物主要是一些蓝细菌 红硫细菌 绿硫细菌等少数微生物 它们由于含光合色素 能使光能转变为化学能 ATP 供细胞直接利用 光蓝细菌CO2 2H2O CH2O H2O O2 叶绿素光绿硫细菌CO2 2H2S CH2O H2O 2S菌绿素比较以上两反应 可写成以下通式 光CO2 2H2A CH2O H2O 2A光合色素 二 化能自养微生物这一类微生物的能源来自无机物氧化所产生的化学能 利用这种能量去还原CO2或者可溶性碳酸盐合成有机物质 如亚硝酸细菌 硝酸细菌 铁细菌 硫细菌 氢细菌就可以分别利用氧化NH3 NO2 Fe H2S和H2产生的化学能来还原CO2 形成碳水化合物 例如 亚硝酸细菌能从氧化氨为亚硝酸中获得能量 用以还原二氧化碳 形成碳水化合物 亚硝酸细菌2NH3 3O2 2H2O 2HNO2 4H 4OH 能量CO2 4H CH2O H2O这一类型的微生物完全可以生活在无机的环境中 分别氧化各自合适的还原态的无机物 从而获得同化CO2所需的能量 三 光能异养型微生物这种类型的微生物以光能为能源 利用有机物作为供氢体 还原CO2 合成细胞的有机物质 例如深红螺菌 Rhodospirillumrubrum 利用异丙醇作为供氢体 进行光合作用并积累丙酮 这类微生物生长时大多需要外源性的生长因素 光2 CH3 2CHOH CO2 2CH3COCH3 CH2O H2O光合色素此菌在光和厌氧条件下进行上述反应 但在黑暗和好氧条件下又可能用有机物氧化产生的化学能推动代谢作用 四 化能异养型微生物这种类型的微生物其能源和碳源都来自于有机物 能源来自有机物的氧化分解 ATP通过氧化磷酸化产生 碳源直接取自于有机碳化合物 它包括自然界绝大多数的细菌 全部的放线菌 真菌和原生动物 根据生态习性不同可将这种营养类型分为以下几种 1 腐生型从无生命的有机物获得营养物质 引起食品腐败变质的某些霉菌和细菌就属这一类型 如引起腐败的梭状芽孢杆菌 毛霉 根霉 曲霉等 2 寄生型必须寄生在活的有机体内 从寄主体内获得营养物质才能生活称为寄生 这类微生物叫寄生微生物 兼性寄生 即能在活体 又能在死亡的有机体上生长 微生物具有很强的适应性 上述营养类型的划分并非绝对 只是根据主要的营养状况提出的 绝大多数异养型微生物也能利用CO2 这是异养生物普遍存在的反应 所以 营养类型的划分是是否能利用CO2作为唯一的碳源或主要碳源 在自养型和异养型之间 光能型和化能型之间还存在过渡类型 兼性 营养类型 微生物营养类型的分类 四 培养基 medium 为了研究和利用微生物 必须人为地创造适宜的环境培养微生物 培养基是指经人工配制而成的适合微生物生长繁殖和积累代谢产物所需要的营养基质 配制培养基不但需要根据不同微生物的营养要求 加入适当种类和数量的营养物 并要注意一定的碳氮比例 C N 还要调节适宜的酸碱度 pH 保持适当的氧化还原电位和渗透压 绝大多数微生物都可以在人工培养基上生长 除少数严格寄生或共生的微生物外 微生物培养基的用途 促进微生物生长繁殖 积累代谢产物 分离微生物菌种 鉴定微生物种类 微生物细胞计数 菌种保藏 制备微生物制品 一 配制培养基的基本原则 配制微生物的培养基 主要考虑以下几个因素 一 符合微生物菌种的营养特点 不同的微生物对营养有着不同的要求 所以 在配制培养基时 培养基的营养搭配及搭配比例首先要考虑到这一点 营养的要求主要是对碳素和氮素的性质 如果是自养型的微生物则主要考虑无机碳源 如果是异样型的微生物 主要提供有机碳源物质 除碳源物质外 还要考虑加入适量的无机矿物质元素 有些微生物菌种在培养时还要求加入一定的生长因子 除营养物质要求外 还要考虑营养成分的比例适当 其中碳素营养与氮素营养的比例很重要 C N比是指培养基中所含C原子的摩尔浓度与N原子的摩尔浓度之比 不同的微生物菌种要求不同的C N比 二 适宜的理化条件除营养成分外 培养基的理化条件也直接影响微生物的生长和正常代谢 其中主要有 1 pH微生物一般都有它们适宜的生长pH范围 细菌的最适pH一般在pH7 8范围 放线菌要求pH7 5 8 5范围 酵母菌要求pH3 8 6 0 霉菌的适宜pH为4 0 5 8 由于微生物在代谢过程中 不断地向培养基中分泌代谢产物 影响培养基的pH变化 在配制培养基时 要加入一定的缓冲物质 通过培养基中的这些成分发挥调节作用 常用的缓冲物质主要有磷酸盐类和碳酸钙 2 渗透压由于微生物细胞膜是半通透膜 外有细胞壁起到机械性保护作用 要求其生长的培养基具有一定的渗透压 所以营养成分的浓度要适当 不是越高越好 二 培养基的类型 一 根据成分划分1 天然培养基利用天然的动植物组织器官和抽提物 如牛肉膏 蛋白胨 麸皮 马铃薯 玉米浆等制成 它们的优点是取材广泛 营养全面而丰富 制备方便 价格低廉 适宜于大规模培养微生物之用 缺点是成分复杂 每批成分不稳定 实验室常用的牛肉膏蛋白胨培养基便是这种类型 2 合成培养基利用已知成分和数量的化学物质配制而成 此类培养基成分精确 重复性强 一般用于实验室进行营养代谢 分类鉴定和选育菌种等工作 缺点是配制较复杂 微生物在此类培养基上生长缓慢 加上价格较贵 不宜用于大规模生产 如实验室常用的高氏1号培养基 察氏培养基 3 半合成培养基用一部分天然物质作为碳氮源及生长辅助物质 又适当补充少量无机盐类 这样配制的培养基叫半合成培养基 如实验室常用的马铃薯蔗糖培养基 半合成培养基应用最广 能使绝大多数微生物良好地生长 二 根据物理状态划分1 液体培养基 liquidmedium 把各种营养物质溶解于水中 混合制成水溶液 调节适宜的pH 成为液体状态的培养基质 该培养基有利于微生物的生长和积累代谢产物 常用于大规模工业化生产和观察微生物生长特征和研究生理生化特性 2 固体培养基 solidmedium 一般采用天然固体营养物质 如马铃薯块 麸皮等作为培养微生物的营养基质 亦有在液体培养基中加入一定量的凝固剂 如琼脂 1 5 2 0 明胶等煮沸冷却后 使凝成固体状态 常用来观察 鉴定和分离纯化微生物 3 半固体培养基 semi solidmedium 加入少量凝固剂 0 5 0 8 的琼脂 则成半固体状态的培养基叫半固体培养基 常用来观察细菌的运动 鉴定菌种噬菌体的效价滴定和保存菌种 三 根据用途划分1 加富培养基 enrichedmedium 根据培养菌种的生理特性加入有利于该种微生物生长繁殖所需要的营养物质 使微生物生长旺盛 如加入血 血清等以培养营养要求比较苛刻的微生物 加富培养基主要用于菌种的保存或用于菌种的分离筛选 2 选择培养基 selecticmedium 根据某种或某一类微生物特殊的营养要求 配制而成的培养基 如纤维素选择培养基 还有在培养基中加入对某种微生物有抑制作用 而对所需培养菌种无影响的物质 如在分离霉菌时常在培养基中加入抗生素 3 鉴别培养基 differencialmedium 根据微生物的代谢特点通过指示剂的显色反应用以鉴定不同微生物的培养基 补充 培养基及器皿灭菌 培养基 应科研或生产的需要 由人工配制的 适合于不同微生物生长繁殖或积累代谢产物用的营养基质 混合养料 培养基几乎是一切对微生物进行研究和利用工作的基础 需要六大营养要素 碳源 氮源 无机盐 能源 生长因子 水 且比例适当 任何培养基一旦配成 必须立即进行灭菌处理 常用高压蒸汽灭菌 1 05kg cm2 121 3 15 20min 0 56kg cm2 112 6 15 30min 器皿的灭菌及无菌室的消毒 器皿的灭菌 干热空气 160 2小时无菌室的消毒 紫外线化学药物熏蒸 苯酚 高锰酸钾 甲醛 第二节微生物的代谢 微生物同其他生物一样都是具有生命的 新陈代谢作用贯穿于它们生命活动的始终 新陈代谢作用包括合成代谢 同化作用 和分解代谢 异化作用 微生物细胞直接同生活环境接触 微生物不停地从外界环境吸收适当的营养物质 在细胞内合成新的细胞物质和贮藏物质 储存能量 即同化作用 这是其生长 发育的物质基础 同时 又把衰老的细胞物质和从外界吸收的营养物质进行分解变成简单物质 产生一些中间产物作为合成细胞物质的基础原料 最终将不能利用的废物排出体外 一部分能量以热量的形式散发 这便是异化作用 在上述物质代谢的过程中伴随着能量代谢的进行 在物质分解过程中 伴随着能量代谢 这些能量一部分以热的形式散失 一部分以高能磷酸键形式贮存在三磷酸腺苷 ATP 中 这些能量主要用于维持微生物的生理活动或供合成代谢需要 根据微生物代谢过程中产生的代谢产物在微生物体内的作用不同 又可将代谢分成初级代谢与次级代谢两种类型 初级代谢是指能使营养物质转换成细胞结构物质 维持微生物正常生命活动的生理活性物质或能量的代谢 初级代谢的产物成为初级代谢产物 次级代谢是指某些微生物进行的非细胞结构物质和维持其正常生命活动的非必须物质的代谢 如一些微生物积累发酵产物的代谢过程 抗生素 毒素 色素等 物质代谢 物质在体内转化的过程 能量代谢 伴随物质转化而发生的能量形式相互转化 按代谢产物在机体中作用不同分 初级代谢 提供能量 前体 结构物质等生命活动所必须的代谢物的代谢类型 产物 氨基酸 核苷酸等 次级代谢 在一定生长阶段出现非生命活动所必需的代谢类型 产物 抗生素 色素 激素 生物碱等 新陈代谢的特征 代谢是生命的基本特征代谢通过代谢途径完成代谢途径是不平衡的稳态体系代谢途径的形式多样代谢途径有明确的细胞定位代谢途径相互沟通代谢途径间有能量关联关键酶限制代谢途径的流量 新陈代谢的功能 从周围环境中获得营养物质 将外界引入的营养物质转变为自身需要的结构元件 即大分子的组成前体 将结构元件装配成自身的大分子 例如蛋白质 核酸 脂类以及其他组分 形成或分解生物体特殊功能所需的生物分子 提供生物活动所需的一切能量 新陈代谢的特点 不是完全自发进行 而是靠生物催化剂 酶来催化的 条件温和 酶是生物体内全部代谢活动的工具 由于酶作用的专一性 每一种化学反应都有特殊的酶参与作用 它们使错综复杂的新陈代谢过程成为高度协调的 高度整合在一起的化学反应网络 生物体内酶催化的化学反应是连续的 前一种酶的作用产物往往成为后一种酶的作用底物 这种在代谢过程中连续转变的化学反应 无论是外界引入的或是体内形成的有机分子 最后都转变成代谢的最终产物 新陈代谢途径中的个别环节 个别步骤称为中间代谢 一 微生物的能量代谢 微生物在生命活动中需要能量 它主要是通过生物氧化而获得能量 所谓生物氧化就是指细胞内一切代谢物所进行的氧化作用 它们在氧化过程中能产生大量的能量 分段释放 并以高能磷酸键形式储藏在ATP分子内 供需要时用 能量代谢是新陈代谢中的核心问题 中心任务 把外界环境中的各种初级能源转换成对一切生命活动都能使用的能源 ATP 有机物最初能源日光通用能源还原态无机物 化能自养菌 化能异养菌 光能自养菌 一 微生物的呼吸 生物氧化 类型 根据在底物进行氧化时 脱下的氢和电子受体的不同 微生物的呼吸可以分为三个类型 即 好氧呼吸 厌氧呼吸 发酵 一 好氧呼吸 aerobicrespiration 以分子氧作为最终电子受体的生物氧化过程 称为好氧呼吸 许多异养微生物在有氧条件下 以有机物作为呼吸底物 通过呼吸而获得能量 以葡萄糖为例 通过EMP途径和TCA循环被彻底氧化成二氧化碳和水 生成38个ATP 化学反应式为 C6H12O6 6O2 38ADP 38Pi 6CO2 6H2O 38ATP 二 厌氧呼吸 anaerobicrespiration 以无机氧化物作为最终电子受体的生物氧化过程 称为厌氧呼吸 能起这种作用的化合物有硫酸盐 硝酸盐和碳酸盐 这是少数微生物的呼吸过程 例如脱氮小球菌利用葡萄糖氧化成二氧化碳和水 而把硝酸盐还原成亚硝酸盐 故称反硝化作用 反应式如下 C6H12O6 12NO3 6CO2 6H2O 12NO2 429000卡 三 发酵作用 fermentation 如果电子供体是有机化合物 而最终电子受体也是有机化合物的生物氧化过程称为发酵作用 在发酵过程中 有机物既是被氧化了基质 又是最终的电子受体 但是由于氧化不彻底 所以产能比较少 酵母菌利用葡萄糖进行酒精发酵 只释放2 26 105J热量 其中只有9 6 104J贮存于ATP中 其余又以热的形式丧失 反应式如下 C6H12O6 2ADP 2Pi 2C2H5OH 2CO2 2ATP 二 生物氧化链 微生物从呼吸底物脱下的氢和电子向最终电子受体的传递过程中 要经过一系列的中间传递体 并有顺序地进行 它们相互 连控 如同链条一样 故称为呼吸链 生物氧化链 它主要由脱氢酶 辅酶Q和细胞色素等组分组成 它主要存在于真核生物的线粒体中 在原核生物中 则和细胞膜 中间体结合在一起 它的功能是传递氢和电子 同时将电子传递过程中释放的能量合成ATP 三 ATP的产生 生物氧化的结果不仅使许多还原型辅酶 得到了再生 而且更重要的是为生物体的生命活动获得了能量 ATP的产生就是电子从起始的电子供体经过呼吸链至最终电子受体的结果 利用光能合成ATP的反应 称为光合磷酸化 利用生物氧化过程中释放的能量 合成ATP的反应 称为氧化磷酸化 生物体内氧化磷酸化是普遍存在的 有机物降解反应和生成物合成反应通过氧化还原而偶联起来 使能量得到产生 保存和释放 微生物通过氧化磷酸化生成ATP的方式有两种 二 电子传递磷酸化在电子传递磷酸化中 通过呼吸链传递电子 将氧化过程中释放的能量和ADP的磷酸化偶联起来 形成ATP 一个NAD分子 通过呼吸链进行氧化 可以产生3个ATP分子 它分别在三个位置 各产生一个ATP 第1个ATP大约在辅酶 和黄素蛋白之间 第2个ATP大约在细胞色素b和c1之间 在第3个ATP大约在细胞色素c和a之间 一 底物水平磷酸化在底物水平磷酸化中 异化作用的中间产物的高能磷酸转移给ADP 形成ATP 如下述反应 磷酸烯醇丙酮酸 ADP 丙酮酸 ATP 二 微生物的分解代谢 地球上最丰富的有机物是纤维素 半纤维素 淀粉等糖类物质 自然界中微生物赖以生存的主要也是糖类物质 人们培养微生物 进行食品加工和工业发酵等也是以糖类物质为主要的碳源和能源物质 因此 微生物的糖代谢是微生物代谢的一个重要方面 掌握这方面的知识 对于认识自然界不同的微生物类群 以及搞好微生物的培养利用都是重要的基础知识 一 微生物糖代谢的途径 微生物糖代谢的主要途径有 EMP途径 Embden Meverhef ParnusPathway HMP途径 Hexose Mono PhosphatePathway E D途径 Entner DoudorofPathway Pk途径 Phosphoketolasepathway 等四种 1 EMP途径 EMP途径也称已糖双磷酸降解途径或糖酵解途径 这个途径的特点是当葡萄糖转化成1 6 二磷酸果糖后 在果糖二磷酸醛缩酶作用下 裂解为两个3 化合物 再由此转化为2分子丙酮酸 EMP途径的过程由以下10个连续反应组成 己糖激酶 葡萄糖 ATP 6 磷酸葡萄糖 ADP 磷酸己糖异构酶 6 磷酸葡萄糖 6 磷酸果糖 磷酸己糖激酶 6 磷酸果糖 ATP 1 6 磷酸果糖 ADP 醛缩酶 1 6 二磷酸果糖 磷酸二羟丙酮 3 磷酸甘油醛 磷酸丙糖异构酶 磷酸二羟丙酮 3 磷酸甘油醛 3 磷酸甘油醛脱氢酶 3 磷酸甘油醛 NAD H3PO4 1 3 二磷酸甘油酸 NADH 3 磷酸甘油酸激酶 1 3 二磷酸甘油酸 ADP 3 磷酸甘油酸 ATP 磷酸甘油酸变位酶 3 磷酸甘油酸 2 磷酸甘油酸 烯醇化酶 2 磷酸甘油酸 磷酸烯醇式丙酮酸 H2O 丙酮酸激酶 磷酸烯醇式丙酮酸 ADP 丙酮酸 ATP总反应式为 C6H12O6 2NAD 2 ADP Pi 2CH3COCOOH 2ATP 2NADH2 关于EMP途径的讨论 EMP途径是生物体内6 磷酸葡萄糖转变为丙酮酸的最普遍的反应过程 EMP途径的关键酶是磷酸已糖激酶和果糖二磷酸醛缩酶 许多微生物都具有EMP途径 但EMP途径往往是和HMP途径同时存在于同一种微生物中 以EMP途径作为唯一降解途径的微生物极少 只有在含有牛肉汁酵母膏复杂培养基上生长的同型乳酸细菌可以利用EMP作为唯一降解途径 EMP途径的生理作用主要是为微生物代谢提供能量 即ATP 还原剂 即NADH2 及代谢的中间产物如丙酮酸等 在EMP途径的反应过程中所生成的NADH2不能积累 必须被重新氧化为NAD后 才能保证继续不断地推动全部反应的进行 NADH2重新氧化的方式 因不同的微生物和不同的条件而异 厌氧微生物及兼厌氧性微生物在无氧条件下 NADH2的受氢体可以是丙酮酸 如乳酸细菌所进行的乳酸发酵 也可以是丙酮酸的降解产物 乙醛 如酵母的酒精发酵等 好氧性微生物和在有氧条件下的兼厌氧性微生物经EMP途径产生的丙酮酸进一步通过三羧酸循环 被彻底氧化 生成CO2 氧化过程中脱下的氢和电子经电子传递链生成H2O和大量ATP 三羧酸循环 TCA 的总反应式为 C6H12O6 6O2 38 ADP Pi 6CO2 6H2O 38ATP TCA循环在微生物代谢中的枢纽地位 糖类乙醇乳酸葡萄糖丙酮甘油EMP丁醇脂肪丙酮酸丁二醇B 氧化脂肪酸乙酰 CoA氨基酸蛋白质ATP 各种有机酸 天冬氨酸 柠檬酸 谷氨酸 2 HMP途径 也称已糖单磷降解途径或磷酸戊糖循环 这个途径的特点是当葡萄糖经一次磷酸化脱氢生成6 磷酸葡萄糖酸后 在6 磷酸葡萄糖酸脱氢酶作用下 再次脱氢降解为1分子CO2和1分子磷酸戊糖 磷酸戊糖的进一步代谢较复杂 由3分子磷酸已糖经脱氢脱羧生成的3分子磷酸戊糖 3分子磷酸戊糖之间 在转酮酶和转醛酶的作用下 又生成2分子磷酸己糖和一分子磷酸丙糖 磷酸丙糖再经EMP途径的后半部反应转为丙酮酸 这个反应过程称为HMP途径 反应步骤可分为以下十一步反应 己糖激酶 葡萄糖 ATP 6 磷酸葡萄糖 ADP磷酸葡萄糖脱氢酶 6 磷酸葡萄糖 NADP 6 磷酸葡萄糖内酯 NADPH2内酯酶 6 磷酸葡萄糖内酯 H2O 6 磷酸葡萄糖酸磷酸葡萄糖酸脱氢酶 6 磷酸葡萄糖酸 NADP 5 磷酸核酮糖 NADPH2 CO2 3 磷酸甘油醛 磷酸二羟丙酮 3 磷酸甘油醛 1 6 二磷酸果糖磷酸酯酶 1 6 二磷酸果糖 6 磷酸果糖 H3PO4 6 磷酸果糖 6 磷酸葡萄糖完全HMP途径的总反应式为 6 磷酸葡萄糖 7H2O 12NADP 6CO2 12NADPH2 H3PO4 HMP途径的关键酶系是6 磷酸葡萄糖酸脱氢酶和转酮 转醛酶系 其中6 磷酸葡萄糖酸脱氢酶催化磷酸已糖酸的脱氢脱羧 而转酮 转醛酶系则作用于三碳糖 四碳糖 五碳糖 六碳糖及七碳糖的相互转化 反应到 8 步反应为止 为不完全HMP途径 所生成的3 磷酸甘油醛经过EMP途径的后半部分 转化成丙酮酸 关于HMP途径的讨论 HMP途径的另一特点是只有NADP参与反应 在有氧条件下 HMP途径所产生的NADPH2在转氢酶的作用下 可将氢转给NAD 形成NADH2 经呼吸链 将电子和氢交给分子态氧形成水 并由电子传递磷酸化作用形成ATP 但是一般认为HMP途径不是主要的产能途径 而是为细胞的生物合成提供供氢体 NADPH2 另外 HMP途径还为细胞生物合成提供大量的 3 4 5 6和 7等前体物质 特别是磷酸戊糖 它是合成核酸 某些辅酶以及合成组氨酸 芳香族氨酸 对氨基苯甲酸等化合物的重要底物 此外 HMP途径与化能自养菌和光合细菌的碳代谢有密切联系 因此 HMP途径的生理功能是多方面的 在微生物代谢中占有重要的地位 HMP途径普遍存在于微生物细胞中 通常是和EMP途径同时存在一种微生物中 能以HMP途径作为唯一降解途径的微生物 目前发现的只有亚氧化醋酸杆菌 Acetobactersuboxydans 3 ED途径 也称2 酮 3 脱氧 6 磷酸葡萄糖酸途径 在醛缩酶 KDPGaldolase 的作用下 裂解为丙酮酸和3 磷酸甘油醛 3 磷酸甘油醛再经EMP途径的后半部反应转化为丙酮酸 葡萄糖 ATP6 磷酸葡萄糖 2H6 磷酸葡萄糖酸 H2O2 酮 3 脱氧 6 磷酸葡萄糖酸 3 磷酸甘油醛 丙酮酸 总反应式为 C6H12O6 ADP Pi NADP NAD 2CH3COCOOH ATP NADPH2 NADH2 ED途径的关键酶系是6 磷酸葡萄糖脱水酶和2 酮 3 脱氧 6 磷酸葡萄糖酸醛缩酶 ED途径是糖类的一个厌氧降解途径 它在细菌中 特别是革兰氏阴性细菌中分布很广 在好氧菌中分布不普遍 例如嗜糖假单胞杆菌 Pseudomonassaccharophila 发酵假单胞菌 Zymomonasmobilos 以及铜绿色假单胞杆菌 Pseudomonasaeruginasa 等中都具有ED途径 这个途径多数情况下是与HMP途径同时存在于一种微生物中 但也可以独立存在于某些细菌中 4 PK途径 也称磷酸解酮酶途径 在微生物降解已糖的过程中 除了EMP HMP和E D途径外 还有一条途径即磷酸解酮酶途径 PhosphoketolasePathway 该途径为少数细菌所独有 磷酸解酮酶有两种 一种是戊糖磷酸解酮酶 一种是己糖磷酸解酮酶 有些异型乳酸发酵的微生物 肠膜明串球菌 Leuconostocmesenteulides 短乳酸杆菌 Lactobacillusbrevie 甘露乳酸杆菌 Lactobacillusmanitopoeum 等 是通过戊糖磷酸解酮酶途径进行异型乳酸发酵的 反应途径如下 这个途径的特点是降解1分子葡萄糖只产生1分子ATP 相当于EMP途径的一半 另一特点是几乎产生等量的乳酸 乙醇和CO2 戊糖磷酸解酮途径的关键酶系是磷酸木酮糖解酮酶 它催化5 磷酸木酮糖裂解为3 磷酸甘油醛和乙酰磷酸的反应 二 多糖的分解 多糖种类很多 主要讨论淀粉 纤维素 果胶质的分解 1 淀粉的分解淀粉是多种微生物用作碳源的原料 微生物对淀粉的分解是由微生物分泌的淀粉酶催化进行的 淀粉酶是水解淀粉糖苷键一类酶的总称 它的种类有以下几种 1 液化型淀粉酶 又称 淀粉酶 淀粉 极限糊精2 糖化型淀粉酶其将淀粉水解为麦芽糖或葡萄糖 故称为糖化型淀粉酶 1 淀粉酶 1 4 麦芽糖苷酶 淀粉 麦芽糖 2 糖化酶 1 4 1 6 葡萄糖苷酶 淀粉 葡萄糖3 异淀粉酶 1 6 糊精酶 淀粉 直链淀粉微生物产生的淀粉酶广泛用于粮食加工 食品工业 发酵 纺织 医药 轻工 化工等行业 2 纤维素的分解纤维素酶是一类纤维素水解酶的总称 它由c1酶 cx酶和纤维二糖酶组成 其水解过程如下 纤维二糖酶C1酶Cx1Cx2酶天然纤维素 水合纤维素分子 纤维二糖 葡萄糖生产纤维素酶的菌种常有绿色木霉 康氏木霉 某些放线菌和细菌 我国采用绿色木霉 木素木霉为菌种 进行了研究 试制 纤维素酶在为开辟食品及发酵工业原料新来源 提高饲料的营养价值 综合利用农村的农付产品方面将会起着积极的作用 具有重要的经济意义 3 果胶质的分解果胶是植物细胞的间隙物质 使邻近的细胞壁相连 是半乳糖醛酸以 1 4糖苷键结合成直链状分子化合物 其羧基大部分形成甲基酯 而不含甲基酯的称为果胶酸 果胶在浆果中最丰富 它的一个重要特点是在酸和糖存在下 可以形成果冻 食品厂利用这一性质来制造果浆 果冻等食品 但对果汁加工 葡萄酒生产引起榨汁困难 果胶酯酶聚半乳糖醛酸酶果胶 甲醇 果胶酸 半乳糖醛酸 三 蛋白质的分解 1 蛋白质的分解蛋白质是由氨基酸组成的分子巨大 结构复杂的化合物 它们不能直接进入细胞 微生物利用蛋白质 首先分泌蛋白酶至体外 将其分解为大小不等的多肽或氨基酸等小分子化合物后再进入细胞 通式如下 蛋白酶蛋白质多肽 氨基酸产生蛋白酶的菌种很多 细菌 放线菌 霉菌等中均有 不同的菌种可以产生不同的蛋白酶 例如黑曲霉主要生产酸性蛋白酶 短小芽孢杆菌用于生产碱性蛋白酶 不同的菌种也可生产功能相同的蛋白酶 同一个菌种也可产生多种性质不同的蛋白酶 2 氨基酸的分解 微生物对氨基酸的分解 主要是脱氨作用和脱羧基作用 1 脱氨作用脱氨方式随微生物种类 氨基酸种类以及环境条件的不同 也不一样 主要有以下几种 1 氧化脱氨 在酶催化下 氨基酸在氧化脱氢的同时释放游离氨 这一过程即氧化脱氨 这种脱氨方式须在有氧气条件下进行 专性厌氧菌不能进行氧化脱氨 微生物催化氧化脱氨的酶有两类 一类是氨基氧化酶 以FAD或FMN为辅基 另一类是氨基酸脱氢酶 以NAD或NADP作为氢的载体 交给分子态氧 反应式如下 2R CHNH2 COOH O2 2R CO COOH 2NH3 2 还原脱氨 还原脱氨在无氧条件下进行 脱氨生成饱和脂肪酸 能进行还原脱氨的微生物是专性厌氧菌和兼性厌氧菌 腐败的蛋白质中常分离到饱和脂肪酸便是由相应的氨基酸生成 如大肠杆菌可使甘氨酸还原脱氨成乙酸 反应式如下 NADH2NADHOOC CHNH2 COOH CH3COOH NH3 CO2 3 水解脱氨 不同氨基酸经水解脱氨生成不同的产物 同种氨基酸水解之后也可形成不同的产物 反应通式如下 水解酶R CHNH2 COOH H2O R CHOH COOH NH3有些细菌可