DNA的生物合成和损伤修复熊宇芳.ppt

DNA的合成及重组DNABiosynthesisandRecombination 第十六章 DNA生物合成 校正复制中可能出现的错误 并修复受到损伤的DNA 细胞中酶促修复系统 自然界DNA重组和基因转移的基本方式 基因组复制的主要特点TheGeneralfeaturesofGenomeReplication 第一节 一 基因组是细胞或病毒全部遗传信息的总和 含有一种生物的一整套遗传信息的遗传物质 称为基因组 genome 在真核生物体中 基因组是指一套完整单倍体DNA 染色体DNA 和线粒体DNA的全部序列 既包括编码序列 也包括非编码序列 二 基因组DNA复制具备一些共同特征 一 基因组DNA都具有固定的复制起始点 二 复制过程中形成复制泡和复制叉 三 复制的基本单位称为复制子 四 半保留复制方式保证遗传信息的忠实传递 五 半不连续复制克服了DNA空间结构对DNA新链合成的制约 六 复制起点由多个短重复序列组成 七 DNA复制必须有引物 复制起点 origin 指DNA复制所必需的一段特殊的DNA序列 一 基因组DNA都具有固定的复制起始点 双螺旋DNA复制时 复制区生长点的结构呈Y形或叉形 称之为复制叉 二 复制过程中形成复制泡和复制叉 目录 从一个DNA复制起点起始的DNA复制区域 它是一个独立复制单位 包括复制起点和终点 复制子 replicon 三 复制的基本单位称为复制子 四 半保留复制方式保证遗传信息的忠实传递 1 全保留式 conservative 即恢复原来的DNA双螺旋 并产生一个新的子代DNA双螺旋 2 半保留式 semiconservative 即新老搭配 由一条新合成的DNA链和一条复制模板链配对产生子代双螺旋DNA 3 散布式 dispersive 即复制模板链被分成许多小片段 散布于子代DNA中 两条新合成的DNA链和两条原来的复制模板链之间的结合方式可能性 密度梯度实验 实验结果支持半保留复制方式 含重氮 DNA的细菌 第一代 第二代 梯度离心结果 前导链 leadingstrand DNA复制时 一条链的合成方向和复制叉前进方向相同 可以连续复制合成的新链 后随链 laggingstrand 另一条链的合成方向与复制叉前进方向相反 不能连续复制 只能分成若干小片段分别合成 然后连接起来形成新链 后随链中的小片段称为冈崎片段 Okazakifragments 五 半不连续复制克服了DNA空间结构对DNA新链合成的制约 前导链连续复制而后随链不连续复制 即DNA半不连续复制 复制起点的一般特征 由多个独特的短重复序列组成 短重复序列被多亚基的复制起始因子所识别并结合 一般富含AT 利于双螺旋DNA解旋 以产生单链DNA复制模板 六 复制起点由多个短重复序列组成 E coli复制起始点oriC 酵母复制起点为自主复制序列 autonomouslyreplicatingsequences ARS 酵母染色体含有多个复制起点 元件A 富含A T的共有序列 结合一个特异的蛋白质复合物 复制起点识别复合物 ORC 3个序列 B1 B2和B3 可以增加复制起点的效率 其中B2的9个碱基与上述ARS共有序列相同 酵母复制起始点 DNA聚合酶不能从游离的核苷酸开始合成DNA链 必须由引物 primer 提供自由的3 OH末端 通过加入核苷酸使之不断延伸 所有细胞和多数病毒的DNA复制 首先利用模板合成一段RNA引物 这一过程为引发 priming RNA引物5 端的第一个核苷酸通常是pppA 个别为pppG 七 DNA复制必须有引物 1 多数DNA复制使用RNA引物 174等噬菌体以双链环形DNA的一条链上产生切口处的3 OH为引物 腺病毒及某些线性DNA病毒以结合于病毒DNA的5 端磷酸基团的末端蛋白上的dCTP的3 OH为引物开始复制 2 个别DNA复制以DNA或核苷酸为引物 三 不同基因组DNA通过不同的模式进行复制 一 真核生物基因组DNA复制过程涉及反转录 二 基因组单链DNA通过复制中间体完成复制 三 有的基因组DNA通过RNA中间体进行复制 四 双链环状DNA也有不同的复制方式 四 不同基因组RNA通过不同的模式进行复制 一 基因组双链RNA复制过程是双链复制 二 基因组单链正链RNA以负链为模板进行复制 三 基因组单链负链RNA以正链RNA为模板进行复制 四 反转录病毒的基因组RNA通过DNA中间体进行复制 DNA复制过程ProcessofDNAReplication 第二节 一 原核生物DNA复制体现了复制的基本过程和特征 一 在复制起点解旋酶和多种因子形成复合物1 E coli复制起始需要6种蛋白质因子2 解螺旋酶激活引发酶形成引发体3 解旋还需要促旋酶和SSB DnaA DnaB DnaC HU 促旋酶 gyrase 即拓扑异构酶 单链DNA结合蛋白 singlestrandbindingprotein SSB DNA复制需要6种蛋白因子 E coliDNA复制起始 结合oriC的4个9bp反向重复序列形成复制起始复合物 作用于oriC的3个13bp正向重复序列 DNA在这3个位点解链 形成开放型复合物 opencomplex DnaA蛋白 5 3 解旋酶作用产生两条复制模板链激活引发酶DnaG蛋白DnaB蛋白与引发酶结合 形成引发体 DnaB蛋白 使一条DNA链围绕着另一条旋转 消除解旋产生的张力 促旋酶 SSB蛋白 HU蛋白 稳定解旋后的单链DNA构象 有助于解旋 DNA结合蛋白 对复制起促进作用 HU蛋白能够使DNA发生折叠 E coli中DnaB结合引发酶DnaG 催化合成RNA引物 其序列始于pppAG 模板链序列3 GTC 5 引物长度一般11 12个碱基 二 引发酶合成RNA引物 负责切除RNA引物 三 复制时聚合酶 催化DNA合成而聚合酶 切除引物 DNA聚合酶 可利用损伤尚未修复的DNA链作为模板合成DNA 但不能修复损伤 负责合成DNA DNA聚合酶 DNA聚合酶 原核 真核细胞DNA聚合酶的类型和功能 目录 个核心酶1个 复合物 6种亚基 可滑动的DNA夹子 含1对 亚基 DNA聚合酶 全酶结构 全酶结构包括 亚基 130000 主要功能是合成DNA 亚基具有3 5 外切酶活性 校正功能 亚基可增强其活性 亚基可能起组装作用 核心酶由 和 亚基组成 2个 亚基分别和1个核心酶相互作用 其柔性连接区可以确保在复制叉1个全酶分子的2个核心酶能够相对独立运动 分别负责合成前导链和后随链 功能 复合物是DNA夹子加载蛋白 负责将可沿DNA链滑动的一对 亚基 DNA夹子 加载于DNA 使DNA聚合酶 具有持续合成能力 复合物由6种亚基组成 在复制叉同时合成前导链和后随链 5 3 外切酶 去除RNA引物3 5 外切酶 起校正作用DNA聚合酶活性 填补两个冈崎片段之间的缺口 DNA聚合酶 有3个酶促活性结构域 323个氨基酸 小片段 5 核酸外切酶活性 大片段 Klenow片段 604个氨基酸 DNA聚合酶活性 5 核酸外切酶活性 N端 C端 DNA pol Tus蛋白具有反解旋酶 contra helicase 活性 识别并结合ter序列中共有序列 阻止DnaB蛋白的解旋作用 从而抑制复制叉前进 Tus蛋白除了使复制叉停止运动以外 还可能造成复制体解体 四 Tus蛋白识别复制终点使复制终止 在复制叉汇合点两侧约100kb处各有一个终止区 terD A和terC B 当oriC处于半甲基化状态时 SeqA蛋白迅速结合半甲基化的GATC 阻止Dam甲基化酶与之结合 使复制起点不能被完全甲基化 同时阻止DnaA蛋白结合oriC oriC的GATC被完全甲基化 DnaA蛋白就能与之结合 开始新的一轮复制 五 DNA甲基化保证复制起点在每个复制周期中仅起一次作用 E coli复制起点oriC含有11个拷贝GATC 这一回文序列中的A是Dam甲基化酶的靶位点 在复制过程中 DNA每复制10bp 复制叉前方的模板DNA双螺旋就要绕其长轴旋转一周 产生正超螺旋 拓扑异构酶是一种可逆的核酸酶 它们可共价结合DNA分子上的磷酸基团 切断磷酸二酯键 六 DNA复制需要两类DNA拓扑异构酶 消除正超螺旋 使复制叉能够顺利前进 维持E coli 噬菌体和质粒DNA复制起始模板DNA负超螺旋状态 环形染色体复制后产生的两个子染色体连环体解连环 DNA拓扑异构酶功能 E coIi的Topo 只作用于负超螺旋DNA 消除负超螺旋 DNA拓扑异构酶 的功能 E coli的Topo 将前方产生的正超螺旋转变为负超螺旋 DNA拓扑异构酶 的功能 E coli的Topo 功能是将复制产生的两个子染色体从连环体中分离出来 催化连环和去连环过程 真核生物复制子多 冈崎片段短 复制叉前进速度慢等 DNA复制从引发进入延伸阶段发生DNA聚合酶 转换 切除冈崎片段RNA引物的是核酸酶RNAseH 和FEN1等 二 真核生物DNA复制和原核生物相似但更为复杂 真核生物与原核生物DNA复制的差异 一 常见的真核细胞DNA聚合酶有5种 A家族与大肠杆菌Pol 同源 包括Pol 和Pol B家族与大肠杆菌Pol 同源 包括Pol 和 C家族与大肠杆菌Pol 同源 仅在真菌中发现X家族与大肠杆菌DNA聚合酶并无同源性 却与末端转移酶同源 成员包括Pol Y家族 UmuC DinB超家族 近年发现一个特殊的真核及原核DNA聚合酶家族 成员包括Pol 和Rev1 Pol 负责合成引物Pol 负责DNA复制 核苷酸切除修复和碱基切除修复Pol 的功能与Pol 相似 其确切功能尚待定 Pol 可能和碱基切除修复有关Pol 负责线粒体DNA复制和损伤修复 常见的真核DNA聚合酶有5种 真核DNA复制叉主要蛋白质的功能 二 真核DNA复制叉主要蛋白质的类型和功能与原核基本相似 DNA聚合酶 Pol 分子含有4个亚基 1 DNA聚合酶 引发酶复合物合成RNA DNA引物 p180 催化亚基p48 具有引发酶活性p58 p48的稳定性和活性所必需的p70 与组装引发体有关 功能 合成RNA引物反应过程 调节 磷酸化的调节作用 Pol 引发酶复合物 首先 合成RNA引物 其次 利用DNA聚合酶活性将引物延伸 产生起始DNA initiatorDNA iDNA 短序列 形成RNA DNA引物 最后 Pol 引发酶脱离模板链DNA 发生DNA聚合酶转换 switch 结构 p70 p34和p11组成异源三聚体功能 2 RPA的功能与E coli的SSB相似 复制蛋白A replicationproteinA RPA 结合单链DNA促使双螺旋DNA解旋激活Pol 引发酶活性为Pol 依赖复制因子C RFC 和增殖细胞核抗原 PCNA 合成DNA所必需RPA三聚体与SV40T抗原结合 组装引发体复合物所必需RPA参与DNA重组和修复 p140结合PCNAp40 p37和p36组成稳定的核心复合物 具有依赖DNA的ATPase活性p38可能在p140和核心复合物之间起连接作用 3 RFC与E coliDNA聚合酶 的 复合物功能相似 复制因子C replicationfactorC RFC 结构 有p140 p40 p38 p37 p365个亚基 促使可滑动的DNA夹子PCNA结合于引物 模板链 是Pol 在模板DNA链上组装并形成具有持续合成能力全酶所必需的 RFC的功能 PCNA是Pol 的进行性因子 使Pol 获得持续合成能力 PCNA是协调DNA复制 损伤修复 表观遗传和细胞周期调控的核心因子 PCNA水平是检测细胞增殖的重要指标 PCNA能激活Pol 4 PCNA是可滑动的DNA夹子 增殖细胞核抗原 proliferatingcellnuclearantigen PCNA 结构 功能 同源三聚体 可形成闭合环形的可滑动DNA夹子 p125 催化亚基 具有DNA聚合酶活性和3 5 核酸外切酶活性 其N端区与PCNA相互作用p50 辅助PCNA激活p125 5 DNA聚合酶 合成前导链和后随链 结构 Pol 分子是异源二聚体 p125和p50 功能 Pol 合成前导链和后随链 DNA聚合酶 FEN1 flapendonuclease1 具有核酸内切酶和5 3 核酸外切酶活性 FEN1参与去除冈崎片段5 端的RNA引物 6 FEN1和RNAseH 切除RNA引物 RNAseH 是核酸内切酶 参与冈崎片段成熟时切除5 端RNA引物 底物RNA连接在DNA链的5 端 切割后在DNA链的5 端残留一个核糖核苷酸 这个核苷酸再被FEN1切除 DNA复制需要DNA解旋酶打开DNA双螺旋 使复制模板链得以暴露 7 DNA解旋酶打开双螺旋以暴露复制模板 8 真核复制叉有1个Pol 和2个Pol 复合物 真核DNA复制叉模型 Pol 引发酶合成RNA DNA引物Pol 合成前导链和后随链RFC识别引物iDNA的3 端并驱除Pol 引发酶PCNA结合DNA并引入Pol RNAseHI FEN1切除冈崎片段5 端的RNA引物 真核生物复制过程中酶及功能 Pol 或Pol 填补冈崎片段之间的空隙DNA连接酶 封口RPA稳定解旋后的单链DNA解旋酶复制叉的形成和移动必不可少拓扑异构酶释放复制叉前进时产生的扭曲应力 三 引发和延伸发生DNA聚合酶 转换 识别染色体DNA复制起点和DNA局部解旋后 Pol 引发酶复合物结合于复制起点 这一步叫做引发体组装 引发体组装包括DNA解旋酶与Pol 引发酶相互作用 1 解旋酶与Pol 引发酶相互作用组装引发体 前导链 出现在引发后期后随链 发生于每个冈崎片段合成之际发生DNA聚合酶 转换的原因是Pol 不具备持续合成能力DNA聚合酶 转换的关键蛋白是RFC 2 DNA聚合酶 转换 真核DNA聚合酶转换和后随链合成 首先RNAseH 利用核酸内切酶活性切割连接在冈崎片段5 端的RNA片段 在RNA DNA引物连接点旁留下1个核糖核苷酸 然后FEN1利用5 3 核酸外切酶活性切除这最后一个核糖核苷酸 四 切除RNA引物有两种机制 解旋酶Dna2具有依赖DNA的ATPase和3 5 解旋酶活性 其解旋作用可以使前一个冈崎片段的5 端引物形成 盖子 结构 再由FEN1的内切酶活性切除引物 依赖RNAseH FEN1切除方式 依赖Dna2 FEN1切除方式 切除RNA引物的两种机制 RNAseH FEN1 Dna2 FEN1 真核所有染色体DNA复制仅仅出现在细胞周期的S期 而且只能复制一次 五 真核染色体在每个细胞周期中只能复制一次 1 前复制复合物在G1期形成而在S期被激活 真核细胞DNA复制的起始分两步进行 即复制基因的选择和复制起点的激活 复制基因 replicator 是指DNA复制起始所必需的全部DNA序列 复制基因的选择出现于G1期 基因组的每个复制基因位点均组装前复制复合物 pre replicativecomplex pre RC 复制起点的激活出现于细胞进入S期以后 这一阶段将激活pre RC 募集若干复制基因结合蛋白和DNA聚合酶 并起始DNA解旋 在原核细胞中 复制基因的识别与DNA解旋 募集DNA聚合酶偶联进行 而在真核细胞中 这两个阶段相分离可以确保每个染色体在每个细胞周期中仅复制一次 ORC至少募集两种解旋酶加载蛋白Cdc6和Cdt1 复制起点识别复合物 originrecognitioncomplex ORC 识别并结合复制基因 三种蛋白质一起募集真核细胞解旋酶Mcm2 7 前复制复合物 pre RC 的形成 pre RC磷酸化导致在复制起点组装其他复制因子并起始复制 复制因子包括3种DNA聚合酶 DNA聚合酶在复制起点按一定顺序组装 首先Pol 和Pol 结合 然后是Pol 引发酶 在S期 pre RC被蛋白激酶 Ddk和Cdk 磷酸化 从而被激活 pre RC的激活和组装真核DNA复制叉 1 激活pre RC 以起始DNA复制 2 抑制形成新的pre RC 2 Cdk控制pre RC的形成和激活 真核细胞通过依赖细胞周期蛋白的蛋白激酶 cyclin dependentkinases CDK 严格控制pre RC的形成和激活 Cdk功能 在每个细胞周期过程中 仅有一次机会形成pre RC 也仅有一次机会激活pre RC pre RC在被激活后即解体 所暴露的复制基因可形成新的pre RC并迅速结合ORC 但在S G2和M期 高活性的Cdk抑制pre RC的其他组分结合ORC 只有当染色体分离和细胞分裂完成时 Cdk的活性消失 新的pre RC才能形成 六 端粒酶确保染色体末端复制完整 前导链产生完整的子染色单体 后随链3 端留下缩短的未复制的ssDNA区 端粒 telomeres 由富含TG的重复序列组成 人的端粒重复序列为5 TTAGGG 3 这些重复序列多为双链 但每个染色体的3 端比5 端长 形成单链ssDNA 这一特殊结构可解决染色体末端复制问题 端粒酶 telomerase 是一种核糖核蛋白 RNP 由RNA和蛋白质组成 端粒酶以自己的RNA组分作为模板 以染色体的3 端ssDNA 后随链模板 为引物 将端粒序列添加于染色体的3 端 这些新合成的DNA为单链 DNA聚合酶 催化合成DNADNA解旋酶 helicase 解开DNA双螺旋 暴露复制模板链引发酶 引发 即合成RNA引物 利用引物3 OH开始延伸DNA连接酶 连结冈崎片段其他酶和蛋白因子 小结 DNA复制需要多种酶参与 如 起稳定作用的单链DNA结合蛋白 SSB 和改变DNA超螺旋状态的DNA拓扑异构酶 topoisomerase 等 DNA聚合酶的合成前误差控制 presyntheticerrorcontrol 和校正控制 proofreadingcontrol 功能 细胞修复系统是DNA复制高度忠实性的重要因素 复制起始利用引物也是确保DNA复制忠实性的重要机制之一 DNA复制具有高度忠实性 DNA复制是双向复制 一个起点 两个复制叉 双向复制 两个起点 两个生长点 单向复制 一个起点 一个复制叉 单向复制 DNA链的合成3种方式 线粒体DNA的D环 D loop 复制噬菌体的滚环 rollingcircle 复制 三 线粒体和噬菌体DNA复制具有特殊方式 一 线粒体DNA按D环方式复制 环形 双螺旋DNA分子两条链一条为重链 H链 另一条为轻链 L链 线粒体DNA分子特点 有特异的复制起点 环形线粒体DNA两条链 H和L 的复制不同步D环或取代环 displacementloop 线粒体DNA复制开始以H链作为模板合成新的L链 取代原来的L链并和H链互补 而原来的L链则保持单链状态 形成类似英文字母D的区域 两条链具有不同的复制起点和相反的合成方向 线粒体DNA复制也需要RNA引物 线粒体DNA复制特点 二 噬菌体DNA按滚环方式复制 环形双螺旋DNA分子一条为模板链 另一条为非模板链 E coli噬菌体DNA的分子结构特点 仅以一条链作为模板合成若干环形DNA分子拷贝噬菌体DNA复制的方式是滚环复制 噬菌体DNA复制特点 噬菌体DNA复制首先由它自己编码的A蛋白在非模板链上造成缺口 再以所产生的游离3 端羟基作为引物 并在宿主细胞的DNA聚合酶 解旋酶和SSB蛋白等作用下合成新链 新链和模板链互补并取代了原来的非模板链 这种复制方式称为滚环复制 滚环复制 滚环复制 双螺旋DNA在复制起点解链不一定导致两条链同时复制 也可能利用一条链作为模板起始DNA合成 双螺旋DNA的两条DNA链的复制起点也可能处于不同的位置 滚环复制和D环不对称复制的存在说明 DNA的反转录合成Reversetranscription 第三节 RNA肿瘤病毒 DNA原病毒 或前病毒 RNA肿瘤病毒 Temin等提出 原病毒 provirus DNA是RNA肿瘤病毒在复制过程中的中间物 反转录的发现发展了中心法则 DNA 中间模板分子 mRNA 蛋白质 中心法则 反转录酶的发现发展了中心法则 反转录病毒 retroviruses RNA病毒 含有反转录酶 反转录 在反转录酶的作用下以RNA为模板合成DNA的过程 RNA指导的DNA聚合酶活性 DNA指导的DNA聚合酶活性 RNAseH的活性是指它能够从5 3 和3 5 两个方向水解DNA RNA杂合分子中的RNA 一 反转录酶以tRNA为引物合成双链cDNA 反转录酶有3种酶的活性 反转录酶的结构 反转录病毒RNA基因组和原病毒 反转录病毒RNA基因组转变为双链cDNA的途径 二 反转录病毒在宿主细胞内的主要活动 一 反转录合成双链cDNA 二 双链cDNA插入宿主染色体形成原病毒 原病毒或前病毒 存在于真核染色体中和反转录病毒RNA基因组相对应的双链DNA序列 gag基因编码几种病毒核心蛋白 衣壳蛋白 pol基因编码3种酶 反转录酶 蛋白酶和整合酶 env基因编码插入病毒外膜磷脂双层中的糖蛋白 三 原病毒DNA转录产生病毒RNA 具有自我复制能力的反转录病毒基因组含有3个基因 直接翻译产生多蛋白Gag和Gag Pol 含有包装信号 因此构成完整的病毒基因组 大约一半初级转录产物经过剪接加工形成gag polmRNA和envmRNA 原病毒初级转录产物有3种重要功能 初级转录产物多蛋白Gag Pol 经过蛋白酶水解 可产生反转录酶 蛋白酶和整合酶 多蛋白Gag经过加工 生成4种病毒衣壳蛋白 env基因编码的Env蛋白 经过加工以后插入病毒外膜磷脂双层 这些病毒蛋白和病毒RNA基因组可以迅速组装成许多新的反转录病毒颗粒 四 病毒RNA经翻译和包装形成反转录病毒颗粒 DNA损伤修复DNADamageandRepair 第四节 一 多种因素通过不同形式可引起DNA损伤 碱基开环和糖苷键断裂引起碱基丢失辐射或氧化损伤等引起碱基改变化学因素可引起核苷酸插入或缺失辐射和化学损伤可引起DNA链断裂物理和化学因素可引起DNA链间或链内交联 其一 导致复制或转录障碍其二 导致复制后产生基因突变 DNA损伤的结果 二 DNA损伤修复系统有多种类型 修复对象 将DNA中因紫外线照射而形成的嘧啶二聚体分解 机制 细胞内光裂合酶 photolyases 分子中生色基团次甲四氢叶酸吸收光子并将FADH2激活生成的激发型FADH2 再将电子转移给嘧啶二聚体 使其还原 分布 分布广泛 除哺乳动物外均有之 一 直接修复 directrepair 利用修复酶简单地逆转DNA损伤 光复活修复系统 修复对象 DNA中被甲基化修饰的鸟嘌呤 O6 甲基鸟嘌呤 与T配对 机制 将甲基转移到酶蛋白活性中心的Cys残基侧链上 使鸟嘌呤复原 避免发生突变 特点 DNA甲基转移酶一旦接受甲基就不再具有催化活性 修复代价高昂 O6 甲基鸟嘌呤DNA甲基转移酶修复 糖苷酶 glycosylases 识别 切除受损碱基 产生AP位点 apurinicorapyrimidinicsite AP内切酶在AP位点的5 端切断磷酸二酯键 AP外切酶再切割AP位点的3 端 DNA聚合酶填补产生的缺口 最后DNA连接酶连接 二 碱基切除系统修复切除受损碱基 碱基切除修复 baseexcisionrepair BER 对象 受损的碱基修复系统 E coli碱基切除修复系统切除胞嘧啶自发脱氨基产生的尿嘧啶 胞嘧啶脱氨基产生的尿嘧啶 氧化的鸟嘌呤 oxoG 脱氨基的腺嘌呤 开环碱基 碳原子之间双键变成单键的碱基等 DNA糖苷酶识别的异常碱基包括 功能 利用DNA糖苷酶切除DNA复制前未去除的损伤碱基 自动防故障 fail safe 系统 碱基切除修复系统切除鸟嘌呤氧化产物oxoG DNA聚合酶和连接酶以未损伤的DNA链为模板修补缺口 三 核苷酸切除修复系统识别DNA双螺旋变形 核苷酸切除修复 nucleotideexcisionrepair NER 系统识别DNA双螺旋形状的变形 E coli的NER主要由4种蛋白质组成 UvrAUvrBUvrCUvrD UvrA识别DNA双螺旋结构变形UvrB负责解链 募集核酸内切酶UvrCUvrC在损伤部位的两侧切断DNA链UvrD去除这两个切点之间的DNA片段DNA聚合酶 和连接酶填补缺口 核苷酸切除修复系统 XPC蛋白负责发现DNA双螺旋中的变形XPA和XPD蛋白具有解旋酶活性核酸酶ERCC1 XPF切割损伤部位5 侧 XPG切割3 侧DNA聚合酶和连接酶负责填补产生的缺口 高等真核生物的NER作用 NER不仅能够修复整个基因组中的损伤 而且能拯救因转录模板链损伤而暂停转录的RNA聚合酶 即参与转录偶联修复 transcription coupledrepair 作用方式 NER蛋白质被募集于暂停的RNA聚合酶 转录偶联修复的意义 将修复酶集中于正在转录DNA 使该区域的损伤尽快得以修复 1 在核苷酸切除修复 包括转录偶联修复 时起DNA解旋酶的作用 2 在转录过程中打开DNA模板 真核转录偶联修复的核心是TF H TF H分别参与两个独立过程 对于DNA双链断裂 double strandbreak DSB 损伤 细胞采用双链断裂修复 即重组修复 recombinationalrepair 通过与姐妹染色体正常拷贝的同源重组来恢复正确的遗传信息 四 重组修复系统能够修复双链断裂损伤 RecBCD酶复合物有解旋酶和核酸酶活性 RecB和RecD是两种DNA解旋酶 RecB沿DNA链5 末端解旋 运动速度较慢 而RecD沿DNA链3 末端解旋 运动速度快 导致单链DNA环状结构逐渐积累 重组修复作用机制 E coli的rec基因 recA recB recC和recD 编码的几种酶参与重组修复 RuvA蛋白识别Holliday结构连接处 内切酶RuvC特异识别Holliday结构中的ATTG序列并切割DNA 使Holliday结构分离 完成DNA重组 当RecBCD遇到chi序列 5 GCTGGTGG3 就在其附近将单链DNA切断 从而DNA重组成为可能 利用上述重组修复系统修复断裂染色体 细胞中必须存在姐妹染色体 在细胞周期早期 姐妹染色体还没有产生 如果染色体发生断裂 自动防故障系统将通过通过非同源末端连接 nonhomologousendjoining NHEJ 发挥作用 正在复制的DNA聚合酶可能遭遇尚未修复的DNA损伤 细胞自动防故障系统能够使复制体绕过损伤部位 这一机制就是跨损伤DNA合成 E coli跨损伤DNA合成由UmuC UmuD 复合物进行 五 跨损伤DNA聚合酶能够跨越损伤部位合成DNA E coli跨损伤DNA合成 三 DNA损伤修复具有重要的生物学意义 修复系统的存在保证了物种遗传的稳定性 对降低修复缺陷相关疾病的发病率有十分重要的意义 第五节DNA重组DNARecombination DNA重组的类型 同源重组特异位点重组转座重组 一 同源重组是最基本的DNA重组方式 同源重组 homologousrecombination HR 是指发生在同源序列间的重组 它通过链的断裂和再连接 在两个DNA分子同源序列间进行单链或双链片段的交换 又称基本重组 generalrecombination 同源重组不需要特异DNA序列 而是依赖两分子之间序列的相同或类似性 以E coli的同源重组为例 了解同源重组机制的Holliday模型 Holliday模型中 同源重组主要4个关键步骤 两个同源染色体DNA排列整齐 一个DNA的一条链断裂 并与另一个DNA对应的链连接 形成Holliday中间体