乙肝病毒核酸检测实验操作流程幻灯片.ppt

乙肝病毒核酸检测实验操作流程 广西临床检验中心唐娟 主要内容 HBV DNA的检测原理HBV DNA操作流程HBV DNA检测结果分析临床意义 DNA提取 PCR扩增 标本采集 检测原理 HBV 用一对乙型肝炎病毒特性引物 Primer 和一条乙型肝炎病毒特异性荧光探针 配以PCR反应液 耐热DNA聚合酶 Taq酶 四种脱氧核苷酸单体 dNTPs 等成分 用PCR体外扩增法定量检测乙型肝炎病毒DNA 原理图 每产生一条DNA链 就切断一条探针每切断一条探针 就产生一个荧光信号信号强度与结合探针的DNA分子数成正比 操作流程 一 标本采集 一次性无菌注射器抽取受检者静脉血2毫升 注入无菌的干燥玻璃管室温 22 25 C 放置30 60分钟血标本使用水平离心机 4000转 分离心5分钟吸取上层血清 转移至1 5ml灭菌离心管 血清的采集 血浆的采集 用一次性无菌注射器抽取受检者静脉血2毫升 注入含EDTA或枸橼酸钠抗凝剂的试管立即轻轻颠倒玻璃管混合5 10次 使抗凝剂与静脉血充分混匀5 10分钟后即可分离出血浆 转移至1 5ml灭菌离心管 注意事项 尽量吸取血清的上层液 有纤维蛋白的标本应离心去除脂类浑浊标本拒收 离心4000rpm 5min 血清 血清 不能使用肝素抗凝因为对PCR扩增有抑制作用 且很难在核酸提取过程中完全去除 血浆 二 HBV DNA的提取 打开HBV DNA试剂盒 取出DNA浓缩液 DNA提取液 置室温融解 充分混匀 取已灭菌的1 5ml离心管并按样本唯一编号 加入DNA浓缩液和待测样本各100ul 振荡混匀 12000rpm 离心10min 去上清 沉淀中加入20ulDNA提取液 振荡混匀 阴 阳性质控品处理方法 各取50ul 分别加入DNA提取液各50ul 100 恒温干浴10min 12000rpm离心5min 注意事项 1 加入等体积的浓缩液后请用震荡器剧烈震荡混匀 不能用移液器混匀2 标本12000rpm离心时一定要统一离心管摆放方向 离心后应沿着沉淀存在的对侧缓缓吸去上清 枪头贴管壁顺着液面下移 防止带走不可见的沉淀物 如沉淀不明显可以保留少量液体 建议将移液器量程调至190ul一次性吸取 注意事项 3 浓缩离心后若出现有 絮状悬浮物 去上清时应一并把 絮状悬浮物 吸除 不影响实验结果 如不吸取絮状悬浮物会导致实验结果偏低 4 加入20ul的DNA提取液 DNA提取液用前充分融解混匀 并用震荡器剧烈震荡混匀20秒后 瞬时离心 5 裂解温度要确保有100 1 裂解时间10min 1 三 PCR扩增步骤 取上清液2ul点样 8000rpm离心数秒 按顺序放进扩增仪微孔中 编辑软件 设置循环条件 保存文件 运行 注意 吸取上清液中上层2ul进行加样 不要吸取到沉淀 循环条件 循环次数 温度93 2分钟93 45秒 55 60秒 10个循环93 30秒 55 45秒 30个循环 结果分析 1 2 结果读取 3 结果报告 结果的报告必须简单清楚定量测定则必须报告量的多少1 结果高于测定方法线性范围上限 可报告 多少 也可对样本稀释后再测 结果乘以稀释倍数2 结果低于方法的测定范围下限 则报告多少即可 不能报告 0 或阴性 临床意义 1 诊断早期乙型肝炎 提高HBV检测阳性率 2 判断HBV的传染性及病毒复制情况 综合血清学指标 为临