7药理学实验技术-王逸平.doc

药理学实验技术一. 药理学及实验技术概述药物（drugs）：是指影响机体器官功能及代谢活动并用于治疗、诊断和预防疾病的化学物质。主要包括，天然药物（中草药、植物药）、化学药品（植物中分离、提取活性成分，如罂粟 吗啡；麻黄 麻黄碱；化学全合成或半合成的化合物）、生物制品（促红细胞生成素；干扰素）。神经氨酸酶存在于甲型及乙型流感病毒的表面，在病毒的生命周期中起着极其重要的作用。一旦病毒侵入宿主细胞并开始复制，新生病毒颗粒就会呈芽状突出于细胞表面，但仍与细胞相连。流感病毒中神经氨酸酶的作用就是将病毒和细胞连接的血凝素唾液酸结合键断裂。一旦与细胞表面脱离，新生的病毒颗粒就会自由扩散，感染其他宿主细胞。药理学（pharmacology）是研究药物与机体相互作用及其规律的学科。包括药物效应动力学（pharmacodynamic，简称药效学）和药物代谢动力学（pharmacokinetics，简称药动学）。药理学研究的目的：（1）阐明药物作用、作用机制（2）为临床合理用药提供理论依据（提高疗效，减少不良反应）（3）新药的开发研制（4）探索细胞生理、生化、病理过程药效学主要研究药物对机体的作用，包括药物的药理效应、作用机制及临床应用等。靶点：药物与受体、药物与酶药效：药物的治疗作用构效关系（structure activity relationship,SAR）：药物化学结构与效应关系（或药物的结构与药理活性或毒性之间的关系）量效关系（Dose-response relationship）：药物剂量与效应关系（或药物的药理效应与其剂量或血药浓度呈一定关系）阈剂量：是指能引起效应的最小药物剂量或最小药物浓度。效能：药物药理效应的最大值效价：反应药物效应与药物剂量的关系，为药理效应相同的药物之间等效剂量的比较。半数有效量（ED50）：引起50%最大反应强度的药物剂量或引起50%实验对象出现有效（或阳性）反应的药物剂量。半数致死量（LD50）:引起50%实验对象死亡的药物剂量。反应药物的急性毒性大小。治疗指数（TI）：LD50/ED50,表示药物的安全性。治疗指数越大越安全。安全范围：有人用LD5ED95之间的距离表示药物的安全性，称为安全范围。药动学主要研究机体对药物的作用，即药物的体内过程，包括药物的吸收、分布、代谢及排泄过程，特别是研究血药浓度随时间变化的规律，影响药物疗效的因素。峰值(Cmax)：药物在体内达到的最大血药浓度，一般当药物吸收与消除的速度相等时达到峰值。 达峰时间(Tpeak)：血药浓度达到峰值所需的时间。时量关系曲线：给药后随着时间的改变血药浓度随之不断变化，以时间为横坐标，药物浓度（或对数浓度）为纵坐标绘制的图形，称为时量关系曲线，也称为药物浓度-时间曲线图。血浆半衰期(t1/2)：血浆中血药浓度下降一半所需的时间。曲线下面积(AUC)：由时量曲线与坐标横轴围成的面积称为曲线下面积，它与药物吸收的总量成正比。受体是细胞在进化过程中形成的细胞蛋白组分，能识别周围环境中某种微量化学物质，首先与之结合，并通过中介的信息转导与放大系统，触发随后的生理反应或药理效应受体类型：门控离子通道型受体G蛋白偶联型受体具有酪氨酸激酶活性受体细胞内受体受体特性：蛋白质 存在于细胞膜、胞浆、细胞核配体 a)内源性：激素、神经递质、血管活性物质 b)外源性：药物特异性：对配体具有高度选择性饱和性：与其配体的结合能力有限可逆性；可解离，可置换高亲和性：极高的识别能力生物学效应受体激动药对相应受体有较强的亲和力，也有较强的内在活性，达100%。受体拮抗药虽然也有较强的亲和力，但缺乏内在活性，=0,本身不能引起效应，却占据一定量受体，拮抗激动药的作用。竞争性拮抗药(competitive antagonist)能与激动药互相竞争与受体结合，这种结合是可逆性的。实验设计的原则重复 精确可靠实验结果在同样条件下可重复随机 实验对象接受处理的机会（概率）应相等对照 对照是比较的基础，必须平行对照 实验方案（Protocol）要点1、实验名称2、研究背景，目的意义3、试验设计 (1)实验对象（动物、组织器官、细胞、受体或酶）；(2)实验分组； (3)试验周期；(4)实验方法和主要的研究指标和参数；(5)试验设计 的说明（预试验；确定药物的剂量或浓度；给药途径）4、预期结果5、实验预期完成时间6、参考文献 实验药理学的相关技术模型制备与应用放射配基受体结合测定法电泳技术在药理学研究中的应用细胞生物学方法在药理学中的应用药理学研究中常用的分子生物学技术免疫细胞组织化学技术实验方法膜片钳技术原理及方法高效液相色谱生物核磁技术的应用与研究进展转录调控研究方法在药理学中的应用内钙测定的研究方法和技术二. 药理学实验技术的应用新药研究中的重要技术环节 高通量筛选（HTS，High Throughput Screening)的近年发展的新技术。当前HTS技术的发展注意简化筛选过程和降低筛选成本。HTS可以根据待测样品的合成路线分为液相和固相筛选, 也可以根据筛选目标物分为纯蛋白受体亲合性筛选, 酶活性筛选, 细胞活性筛选等。 高通量筛选的特点快速、微量、经济、有效 遥测实验系统（Telemetry System）Telemetry技术，是能够保证在动物清醒状态下进行安全性药理试验的新技术。在动物无干扰的条件下，实时检测各种生理指标，如心电、血压、呼吸、体温，从而可获得更可靠的试验数据激光扫描共聚焦显微镜测定技术激光扫描共聚焦显微镜是在荧光显微镜成像的基础上加装了激光扫描装置，利用计算机进行图像处理，使用紫外光或激光激发荧光探针，从而得到细胞或组织内部微细结构的荧光图像，观察细胞的形态变化或生理功能的改变，可进行荧光定性、定量和定位，实时动态的细胞分子和离子监测，系列光学切片，三维图像重组，激光显微切割，细胞光活化作用和细胞分选等。这项技术是形态学、分子细胞生物学、神经科学、药理学和遗传学等领域中新的有力研究工具。三. 新药研究（一）临床前药学研究：原料药工艺路线、理化性质、质量标准、稳定性；制剂处方、质量标准、稳定性（二）临床前药理毒理学研究药理药效学研究安全性药理研究毒理学研究药代动力学（三）临床研究：I 期临床、II 期临床、III 期临床、IV期临床四 实例1、抗心律失常新药硫酸舒欣啶机理：钠通道、钙通道和钾通道复合型离子通道抑制剂2、丹参乙酸镁及丹参多酚酸盐机理：电压依赖性调控心肌钙通道的作用；清除自由基和抑制脂质过氧化；抑制 ICAM-1 表达和细胞凋亡，减轻缺氧复氧引起血管内皮细胞损伤；抑制血小板聚集。1、抗心律失常新药硫酸舒欣啶机理：钠通道、钙通道和钾通道复合型离子通道抑制剂2、丹参乙酸镁及丹参多酚酸盐机理：电压依赖性调控心肌钙通道的作用；清除自由基和抑制脂质过氧化；抑制 ICAM-1 表达和细胞凋亡，减轻缺氧复氧引起血管内皮细胞损伤；抑制血小板聚集。五 往年试题1、简述受体的功能与特性，以及放射配体受体结合试验的应用（04）简述受体的特点，并举例说明受体与配体结合试验的测定方法。（05）答：1）概念：受体是细胞在进化过程中形成的细胞蛋白组分，是一种能够识别和选择性结合某种配体（信号分子，周围环境中某种微量化学物质）的大分子，通过信号转导作用与放大系统，将胞外信号转换为胞内化学或物理的信号，触发随后的生理反应或药理效应，即表现为生物学效应。受体存在于细胞膜、胞浆、细胞核中，类型包括：门控离子通道型受体，G蛋白偶联型受体，具有酪氨酸激酶活性受体和细胞内受体等。受体与配体的结合是化学性的，二者通过范德华力、离子键、氢键等分子间的吸引力结合。2）特点：受体一般至少包括两个功能区域，与配体结合区域及产生效应区域，分别具有结合特异性和效应特异性。其特点有1特异性：对配体具有高度选择性，这种选择性是由分子的几何形状决定的，与其在空间结构上互补，但并不是简单的一对一关系，不同细胞对同种配体可能具有不同受体。2饱和性：受体在生物体内的数量是有限的，与其配体的结合能力有限。受体配体结合曲线（Scatchard曲线）为矩形双曲线，增加配体浓度，可使受体饱和。3可逆性：受体与配体结合后可解离，可置换。4高亲和性和敏感性：受体具有极高的识别能力。5特定的作用模式：受体在细胞内分布，从数量到种类，均有组织特异性，并有特定的作用模式，提示某受体与配体结合后，能引起特定的生理效应。3）功能：1识别和结合2信号转导3产生相应的生理功能放射配体受体结合试验：原理：药物与受体结合位点间的相互作用，遵守质量作用定律。利用不同浓度的放射性配基与一定量的受体结合，即可以用数学作图推导出受体含量，并计算出解离常数作为受体与配基亲和力的一个指标。如果放射性配基浓度足够大，受体全部被其结合，这时的放射性配基的结合量即反映出受点含量，我们将其称为最大结合量，以Bmax表示。若以B代表与受体结合的配基量，F代表配基浓度，KD代表解离常数，根据Clark受体理论：BBmaxF/(FKD) B与F作用是一条直角双曲线将BBmaxF/(FKD)变形得：B/FBmax/ KDB/ KD从图中可以读出Bmax，即受体的最大结合量，以及KD解离常数2、简述衡量一个新药效果及安全性的指标有哪些答：药效、阈剂量、效能、效价、半数有效量（ED50）、半数致死量（LD50）3、简述一个新药产生的流程，举例说明答：见上“二”。举例可以举他讲的两个例子4、先导化合物的优化的目的是什么？主要有哪些方法，请举例说明答：提高先导物对靶点的专一性，优化化合物的药物动力学特性和生物利用度，在动物身上进行化合物的药效学试验。例子：神经氨酸酶抑制剂的设计，具体见课件。药理学属于基础医学，是与临床医学的桥梁药理学研究的目的：（1）阐明药物作用、作用机制（2）为临床合理用药提供理论依据（提高疗效，减少不良反应）（3）新药的开发研制（4）探索细胞生理、生化、病理过程4）受体与配体结合试验的测定方法1受体与配体结合试验常用放射性配体结合法(RBA)进行测定，放射配体结合法原理为：利用受体和配体结合的高度特异性以及放射性核素测量的高灵敏度的特点, 用放射性核素标记配体, 在一定的条件下, 使其与受体结合, 形成受体-配体复合物, 通过测量此受体-配体复合物的放射活性, 达到了解受体结合活性的目的。2近年来新出现的一种研究受体-配体相互作用的方法是亲和磁共振法（affinity NMR），它的基本前提是当配体与受体结合时,该低分子量配体的扩散速率发生明显的变化,其结果是结合和非结合配体的扩散系数明显不同,从而允许采用PFG实验（PFG实验常用于测定分子的扩散系数），从该配体和众多与靶蛋白无结合作用的分子的混合物中对该配体进行识别。该方法已经成为研究小分子配体和生物大分子相互作用的一种非常重要的手段。可检测小分子配体信号在作用过程中的变化以识别药物分子，是核磁共振进行药物筛选的主要方法之一。但与其他技术相比，NMR 方法在筛选混合物中的应用受到其相对不灵敏的限制。3还有一种测定受体-配体作用是通过测量其作用力来完成的，是原子力显微技术（atomic force microscopy,AFM）。该技术可提供在内力及外力影响下受体-配体之间相互作用的动态变化信息。AFM是作为一种成像工具而设计的，还能以力扫描方式进行操作。在这种力模式下，它能以10-12牛顿的精度测量两相对表面之间的作用力。在受体-配体间作用力的研究中，配体被偶连于的AFM弹性悬臂表面，受体则被固