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FACScompensation JamesTung DavidParks WayneMoore HerzenbergLaboratory andStanfordSharedFACSFacility 1 Fluorescencecompensation 2 12 colorFACSSpectraofdyes 3 Factorsthataffectcompensation MachineStandardization CalibrationDigital linearvs Analog LogAmpElectronicsAnaloghardwarecompensationLogdisplayforsamplesDifferentlotsoftandomdyes 4 FLCalibrationAria 5 Cy7PECalibrationAria BeadMFI1400010000780059004500 Stainedunstainedbeadscellscells 6 Digitalelectronicsvs Analogelectronics Diva FlasherII 7 Fluorescencecompensation Uncompensated FITCfluorescenceinthePEchannel Compensated FITCspectraloverlapsubtractedfromPE FITC B220 fluorescenceintheFITCchannel Properlycompensatedvaluesdistributesymmetricallyaroundthemedianofthenegativepopulation butlogdisplayonlyshowsvaluesabovezero 8 Cellswithnoorverylowfluorescencepileuponthelowestpointinthelogdisplay NormalDataDisplayedonLogaxis NormalData 9 Logicleaxeshaveashort linear regionthatissymmetricalaroundzero Logiclevisualization Logvisualization 10 FunctionconstructedforFACSdatadisplay Startwiththesinhfunction sinh x ex e x 2Wegeneralizedthisasabiexponentialfunction v x a b c d k aebx ce dx kOurspecificationsandconstraints VandV 0atx 0 leadto V a ex p2e x p p2 1 whereVisthedatavaluetobeplottedatdisplaypositionxintheplot aisascalingfactorandpisthestrengthofthelinearization Wehavecalledthisthe Logicle function WayneA Moore DavidR Parks drparks stanford edu October2002 11 12 FITC B220 fluorescenceintheFITCchannel Diagrammaticrepresentationofcompensationstatusofsubsetsviewedwithlogicleaxes FITCfluorescenceinthePEchannel FITCfluorescenceinthePEchannel Logiclevisualization 13 WaystoimproveFACSanalyses Collectdatawithouthardwarecompensation hardwarecompensationdoesn tcompensateacrosslasers 14 Cross lasercompensationisnotpossiblewithanalogyelectroniccircuitryandCellQuestsoftware 15 WaystoimproveFACSanalyses Collectdatawithouthardwarecompensation hardwarecompensationdoesn tcompensateacrosslasers Collectdataoncompensationsamples singlestains ViewcompensateddataonLogicleaxis 16 WaystoimproveFACSanalyses Titratefluorochrome conjugatedantibodies 17 FSC AntibodyTitrations FSc CD4 1 12 5 1 25 1 50 1 400 1 200 1 100 18 WaystoimproveFACSanalyses Titratefluorochrome conjugatedantibodiesIfdifferentlotsofthetandemdyesareused collectcompensationsampleforeachlot 19 Cy7APCfluorescenceintheCy7APCchannel Differentlotsoftandemdyeshavedifferentfluorescenceproperties Cy7APCspectraloverlapintheAPCchannel 20 WaystoimproveFACSanalyses Titratefluorochrome conjugatedantibodiesIfdifferentlotsofthetandemdyesareused collectcompensationsampleforeachlotCollectdataonFMO fluorescence minus one samplestodeterminebackgroundfluorescenceforeachpopulation 21 Anti B220onlivesize gatedB220 peritonealcells Fluoresce
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