第九章 基因诊断PPT参考课件.ppt

第九章基因诊断 1 第一节基因诊断的概念及常用技术 2 基因诊断 利用分子生物学技术 从DNA RNA水平检测基因的存在 分析基因的结构变异和表达状态 从而对疾病作出诊断 一 基本概念 3 二 基因诊断常用方法 核酸分子杂交 PCR DNA序列测定 DNA芯片技术 4 一 核酸杂交 基本原理 核酸变性和复性理论即双链的核酸分子在某些理化因素作用下双链解开 而在条件恢复后又可依碱基配对规律形成双链结构 因此应用已知碱基序列的单链核苷酸片段作为探针 就可检测样本中是否存在与其互补的同源核苷酸序列 5 6 核酸杂交的关键要素 probeDNAtargetDNAsignaldetection 7 核酸杂交方法分类 按作用环境大致分为固相杂交和液相杂交两种类型 固相杂交是将参加反应的一条核酸链先固定在固体支持物上 一条反应核酸游离在溶液中 液相杂交所参加反应的两条核酸链都游离在溶液中 8 固相杂交分类 Southern印记杂交Northern印记杂交斑点杂交原位杂交 9 Southernblot是最经典的基因分析方法 不但能检出特异的DNA片段 而且能进行定量和测定分子量 可用于基因的酶切图谱分析 基因突变分析等 10 Northern杂交 用于RNA的检测 能对组织细胞中总RNA或mRNA进行定性和定量分析 11 斑点杂交 Dotblot 可用基因组中特定基因及其表达的定性及定量分析 方法简单 快速灵敏 样品用量少 其缺点是不能鉴定所测基因的分子量 特异性不高 有一定比例的假阳性 12 原位杂交 Colonyinsituhybridization 可查明染色体中特定基因的位置 用于染色体疾病的诊断 原位杂交的结果是显示有关核酸序列的空间位置情况 因此可检出含核酸序列的具体细胞 细胞的具体定位 数目和类型 可检出基因和基因产物的亚细胞定位 13 二 利用PCR及结合其他技术进行基因诊断 直接采用PCR进行基因诊断采用PCR产物的限制性片段长度多态性分析 PCR RFLPs 进行基因诊断采用PCR结合等位基因特异性寡核苷酸探针 ASO 斑点杂交进行基因诊断 通过PCR产物的反相点杂交 RBD 进行基因诊断采用PCR产物的单链构象多态性 SSCP 分析进行基因诊断采用PCR技术对靶核酸进行定量分析 14 寡核苷酸杂交分析SNP和等位基因特异寡核苷酸杂交 ASO 15 三 DNA序列测定 DNA序列测定是进行基因突变检测的最直接 最准确的方法 可以确定突变的部位 突变的性质 16 四 DNA芯片技术 应用DNA芯片 可以检测基因的结构及其突变多态性 对基因表达的情况进行分析 17 二基因诊断的特点 高特异性高灵敏度获得稳定的结果早期快速适用性强 应用范围广 18 第二节遗传病的基因诊断 19 一 概述 人类的遗传病达数千种地中海贫血在意大利等国家发病率达10 镰状细胞贫血在美国黑人中发病率达14 我国常见的遗传性疾病有地中海贫血 异常血红蛋白病和血友病 有效治疗难 通过基因诊断进行携带者筛查 产前早期诊断 降低发病率 20 二 镰状细胞贫血 血红蛋白病 异常血红蛋白病 红细胞呈镰刀状 寿命短 引起溶血性贫血 患者多在成年以前死亡 21 Mst 酶切位点 CCTNAGG 5 3 正常基因 突变基因 1 15kb 1 35kb 一 镰状红细胞贫血分子机制 567 ProGluGlu CCTGAGGAG 567 ProAlaGlu CCTGTGGAG 22 二 镰状细胞贫血的基因诊断方法 限制性内切酶 Southernblot采集制备血液DNA 内切酶Mst 消化 电泳 转膜 32P标记的 珠蛋白cDNA杂交 放射自显影 23 0 2kb 1 15kb 1 35kb 正常人 突变携带着 患者 镰状红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析 24 PCR 限制性内切酶设计引物 PCR扩增 产物进行限制性内切酶酶切 电泳 EB染色 直接观察例 引物1 5 GGGCTGGGCATAAAAGTCA 3 引物2 5 AATAGACCAATAGGCAGAG 3 扩增产物294bp 镰状细胞贫血的基因诊断方法 25 引物1 CCTGAGGAG CCTGTGGAG 引物1 引物2 引物2 294bp 103bp 191bp Mst 酶切位点 CCTNAGG 26 103bp 191bp 294bp 正常人 突变携带着 患者 镰状红细胞贫血患者PCR产物的限制性酶切分析 27 RT PCR 序列分析采集制备血液RNA RT PCR 产物测序 推测氨基酸序列 进行诊断 镰状细胞贫血的基因诊断方法 28 二 地中海贫血 Thalassaemia 简写 thal或 T 珠蛋白基因突变导致该多肽链的合成大为减少 或完全缺失 0 珠蛋白合成速率降低 导致 链和 链合成的不平衡 多余的珠蛋白链沉积在红细胞膜上 改变了膜的通透性和硬度 导致溶血性贫血 高危人群地中海人 中东人 印度人 中国人 中国人群中又一广东 广西 四川 贵州等省发病率最高 缺乏有效治疗措施 29 一 地贫病的分子基础 珠蛋白基因全长2053bp 含2个内含子 IVS I和IVS II 3个外显子 目前发现突变有百余种 中国人群发现约20种 一般对特定种族来说 90 的 地贫基因仅由4 6种突变组成 30 二 地中海贫血的基因诊断 PCR ASO斑点杂交法合成2对PCR引物 扩增区段700bp和580bp 分别包含14种和1种可能突变 合成等位特异寡核苷酸 ASO 探针 4 6对 分别标记 制备DNA样品 PCR扩增 斑点印迹杂交RFLP分析法 31 三 地中海贫血的基因诊断 c 左侧缺失4 2kb 右侧缺失3 7kb b b b a 2 1 1 2N端 1C端 正常基因序列 PCR扩增法 定性分析 左侧缺失型基因序列 右侧缺失型基因序列 ac扩增0 4kbab无扩增片段 ab扩增1 2kb 32 0 4kb 1 2kb 正常人 右侧缺失患者 地中海贫血患者基因组的PCR分析 左侧缺失患者 33 四 杜氏肌营养不良症 DMD 1 DMD是常见的性连锁隐性遗传病 2 主要特征是进行性肌萎缩和肠肌假性肥大 XP21 21 21 3区抗肌萎缩蛋白基因突变形式不同 DMD多在5岁发病 10岁左右瘫痪 在20岁左右由于心力和呼吸衰竭而死亡 其发病率为活产男婴的1 3500 34 一 DMD分子基础 抗肌萎缩蛋白基因长约2900kb 含79个外显子 抗肌萎缩蛋白基因突变分为基因缺失型和非基因缺失型 1 DNA片段缺失 60 的病例 导致阅读框移码 移码实变 致DMD 整码缺失 BMD 缺失的2个热点区 该基因5 端处 45 55外显子范围内 2 非基因缺失型部分重复 病例的5 35 1 基因组探针法用XP21区分离得到的不同探针如 P20 来进行相应内切酶酶谱分析 检出率取决于探针数和酶切位点数目 2 cDNA探针法抗肌萎缩蛋白基因系列cDNA探针分析患者基因缺失 外显子拼接改变和基因内部分重复 3 多重PCR法如有人设计多对引物进行多重PCR扩增该基因的9个易发缺失 热点区 DNA片段 可检出80 有基因缺失的DMD患者 4 多态性分析法基因内及其旁侧探针进行RFLP连锁分析 5 RT PCR扩增该基因外显子 全长2 4MB 外显子起来全长c14kb 用多对引物 可检出 外显子拼接异常 联用测序 可定位基因缺失的起始和终止 36 1 苯丙酮尿症是一种常见的隐性遗传性氨基酸代谢病 2 主要特征 1 苯丙氨酸酪氨酸 多巴 儿茶酚胺苯丙酮酸酪胺黑色素 2 患儿出生后须及早得到低phe饮食治疗 否则发生不可逆大脑损害和严重智力发育障碍 五 苯丙酮尿症 PKU 37 一 PKU分子基础 1 迄今约3 4的导致中国人PKU的突变基因已被查清 它们分属11种PAH基因点突变 体外研究表明 这些突变导致PAH活力 或丧失 2 PAH第11外显子的第399密码GTA val GTT val 中性突变 不改变任何限制酶识别位点 故又称 序列多态性 这一 序列多态性 在PKU患者和正常人中存在着连锁不平衡性 故可作为一种 遗传标记 应用于产前诊断 38 PCR ASO探针法和PCR RFLP连锁分析法 PCR SSCP 直接测序法 若待诊断的PKU家系的基因突变类型尚属 未知 或无RFLP信息 二 PKU的DNA诊断 39 先合成ASO如 正常探针 TCCATTAACAGTAAGAATTT突变探针 TCCATTAACAATAAGAATTT 利用PCR ASO探针法诊断苯丙酮尿症 40 利用PCR ASO探针法诊断苯丙酮尿症 健康男性 男性携带者 男性患者 健康女性 女性携带者 女性患者 正常探针 突变探针 41 第三节肿瘤的基因诊断 42 1通过检测肿瘤染色体易位及融合基因诊断肿瘤慢粒 染色体易位 费城染色体PCR检测融合基因2检测肿瘤相关基因癌基因 ras 抑癌基因 p53 肿瘤转移基因3检测肿瘤相关病毒基因HBVHCV 肝癌EB 鼻咽癌4检测肿瘤标志物基因或mRNA肝癌 甲胎蛋白 AFP 结肠癌 癌胚抗原 CEA 肿瘤基因诊断的策略 43 肿瘤标记物基因的检测 c ablgene bcr abl融合蛋白 具PTK活性 慢性骨髓白血病 引物A 引物B 44 2癌基因和抑癌基因的检测 ras癌基因的检测ras基因中最常见的点突变是第12 13或61密码子突变检测方法 PCR ASOPCR SSCP 45 p53的检测p53基因突变主要为点突变 热点区域位于密码子130 290 以175 273 284最多见检测方法 PCR SSCPPCR 测序PCR RFLP 46 其它基因的检测PCR结合其它技术基因芯片 47 4 肿瘤标志物检测或mRNA诊断 肿瘤标志物是由肿瘤组织细胞产生的 与肿瘤形成和发展相关的物质 包括肿瘤抗原 激素 酶 同工酶等 基因标志和基因表型标志 胚胎性抗原 检测方法 PCR ASOPCR 测序PCR RFLPPCR SSCP 48 第四节感染性疾病的基因诊断 49 一 感染性疾病基因诊断的策略 针对病原体特异的核酸序列设计探针进行杂交应用PCR技术扩增病原体基因保守序列核酸杂交技术与PCR技术联合应用 50 特点 简便 特异 快捷能检测出潜在的病原体可对病原体进行分类 分型鉴定不能得知病原体进入体内后机体的反应 51 二 基因诊断的感染性疾病 一 病毒特点 分离培养 周期长 操作繁杂 制约因素多电镜观察 直观快速 但昂贵免疫学诊断 简便快速 但存在问题 不易检出潜伏期的病毒有些病毒亚型多 抗原变异性大整合进入人基因组的病毒 52 病毒核酸分析技术 HBV 包含4个开放阅读框 S C P XPCRPCR 限制性内切酶谱分析PCR 点杂交 PCR Southernblot基因芯片 53 HIV病毒基因组结构 54 ProbeTGAGTTGCAACAGATGCTGTTGCGCCTCAATAGCCCTCAG PCR 核酸杂交诊断艾滋病 55 SARS RT PCR多重PCR荧光定量PCR 56 二 细菌细菌性痢疾 志贺菌 侵袭性大肠杆菌 大质粒 PCR结核病 PCR 57 三 寄生虫重复序列探针法 寡核苷酸探针法 基因组探针法 PCR 58 第五节基因诊断策略 59 一 检测致病基因突变 基因变异致病的类型 内源基因的变异基因结构的突变点突变 插入 缺失 重排 异位基因表达异常mRNA剪接异常外源基因的插入 60 点突变的诊断 诊断已知的点突变 PCR 一对探针突变碱基置探针中央控制杂交条件结果分析 反向杂交技术 61 诊断未知的突变PCR 测序DNA芯片技术 62 分析与疾病连锁的遗传标志 对于还不清楚基因的多数基因病 可通过检测与特定染色体位点连锁的遗传标记来进行基因诊断 基本方法 PCR产物酶切产物电泳分析 基因连锁分析 PCR RFLP连锁分析法 63 三 建立多基因疾病表型克隆 一些多基因 多因素疾病 不仅涉及多个基因还涉及一些环境因素及其与基因的相互作用 表型克隆从分析正常与异常基因组的相同或差异 找到正常人与疾病患者之间的差异序列和相同序列 进而分离 鉴定与疾病相关的多个基因