分子生物学检查7版.ppt

分子生物学检查 南方医院实验诊断学教研室温淑娟 1基因诊断 2流式细胞术及其临床应用 3染色体检测 1基因诊断 一 基因诊断在实验诊断中的位置二 基因诊断在临床诊断中的必要性三 基因诊断的原理 途径四 基因诊断在临床医学中的应用 临床医学实验诊断技术的发展 细胞形态学技术 细胞形态和 或数量 生化检验技术 生物化学代谢产物和酶 免疫学诊断技术 识别特定蛋白质分子的差异 分子诊断技术 DNA RNA和蛋白质 基因诊断的检测对象和其在诊断中的位置 转录翻译分泌和表达DNA核膜mRNA蛋白细胞膜功临床能性产物表现核酸诊断生化诊断血清学诊断临床诊断 基因诊断 酶法测定 血清蛋白 基因诊断可以更早 更本质地反映生理 病理状况 基因诊断的实验诊断对象 先天遗传性疾患后天基因突变引起的疾病外源基因侵入致病 基因诊断的原理运用现代分子生物学和分子遗传学方法检查基因的结构及其表达功能是否正常 从而对疾病作出诊断的方法 基因诊断的途径基因突变的检测 基因连锁分析 基因表达分析基因诊断的优点病因诊断 针对性强 快速 灵敏 特异性高基因诊断的必要性 不可替代 基因诊断的常用技术 一 聚合酶链式反应二 DNA测序三 核酸分子杂交技术四 单链构象多态性分析五 单核苷酸多态性分析六 连接酶链式反应七 基因芯片技术 聚合酶链式反应 PCR PCR PCR的原理PCR的技术特点 反转录PCR荧光PCR PCR在临床医学中的应用 PCR PolymeraseChainReaction 聚合酶链式反应 是模拟DNA体内复制过程 在DNA聚合酶作用下 进行特定DNA片段的体外复制 PCR扩增原理 引物 延伸 延伸 5 5 3 3 变性 复性 变性 复性 PCR的技术特点 特异性强 几乎没有方法学的假阳性 灵敏度高简便快速对样品要求低PCR的局限性 RT PCR 反转录 PCR reversetranscription PCR 模板选用的是RNA通过逆转录酶聚合而成的cDNA模板cDNA是一条单链 在反义引物的引导下合成第二链模板DNA 此时才开始常规的PCR扩增在RT PCR中 模板量及所抽提的RNA极其重要可进行一步RT PCR或两步RT PCR 巢式或半巢式 病原体 DNA RNA PCR 裂解抽提 扩增产物检测 核酸纯化 PCR检测流程 RT PCR 凝胶电泳 酶切分析 杂交 核酸序列分析 PCR扩增及产物分析 PCR产物电泳图 p 1234Marker 270bp 荧光PCR Oligo1 Fluorescein Oligo2 LCRed640 荧光共振能量传递 FRETProbe 双标记探针 TaqmanProbe FQ PCR反应原理 特异性荧光双标记探针Taq酶5 3 外切酶活性 荧光PCR仪 FQ PCR实时动力学曲线 FQ PCR的技术特点 封闭状态下检测 避免了扩增产物污染而致的假阳性可定量检测 扩展了临床应用空间光谱技术进一步提高了灵敏度 可检测单拷贝基因荧光探针杂交 进一步提高了特异性扩增与自动分析一体化 检测更加简便快速 PCR在临床医学中的应用 早期诊断病情评估和预后判断抗病毒药物疗效的观察 指导新药验证输血源的筛选母婴传播的控制与观察遗传疾病的诊断肿瘤的诊断 核酸分子杂交技术 核酸分子杂交 常用的核酸分子杂交技术及应用 常用的核酸分子杂交技术及应用 Southern印迹杂交 DNA印迹 Northern印迹杂交 研究RNA的方法 斑点杂交 狭缝杂交 DNA RNA均可检测 原位杂交 检测DNA或RNA同时还可对其进行细胞及基因组内定位 单核苷酸多态性 singlenucleotidepolymorphism SNP 指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性 SNP在人类基因组中广泛存在 是人类可遗传的变异中最常见的一种 基因芯片技术逐步应用于SNP检测 使大规模进行SNP检测成为可能 SNP的意义和应用 疾病连锁分析和未知致病基因的定位疾病的关联分析复杂疾病或过程的基因定位法医学应用 疾病发生的分子遗传机制的阐明环境因子易感基因的检出药物基因组学研究器官移植配型和物种进化的研究 基因芯片GeneChip 原理 是将大量寡核苷酸分子固定于支持物上 然后与标记的样品进行杂交 通过检测杂交信号的强弱进而判断样品中靶分子的数量 基因芯片技术的应用 优生方面 避免许多遗传病的发生疾病诊断方面 器官移植 组织移植 细胞移植方面的基因配型病原体诊断 2流式细胞术及其临床应用 流式细胞术流式细胞仪组成及其工作原理流式细胞术的临床应用 流式细胞技术 流式细胞技术是在流体状态下观察细胞状态的一种技术能够对细胞或微球的物理 生理 生化 免疫 遗传 分子生物学性状及功能状态等进行定性或定量检测分类收集细胞 流式细胞仪 流动室和液流系统激光源和光学系统光电管和检测系统计算机和分析系统细胞分离纯化系统 有细胞分选功能时 流式细胞技术工作示意图 流式细胞仪 流式细胞术的临床应用 免疫学 免疫活性细胞的分型与纯化 淋巴细胞亚群与疾病关系的分析 免疫缺陷病的诊断 器官移植后的免疫学监测血液学 白血病的免疫分型已成为诊断血液恶性肿瘤不可缺少的重要标准之一肿瘤学 鉴别良恶性肿瘤 预测预后 评估化疗药疗效分子生物学 可在单细胞水平进行基因的表达 调控及功能研究 3染色体检查 染色体检查在临床医学上的意义1 判定男女 3染色体检查 染色体检查在临床医学上的意义1 判定男女2 诊断遗传病3 优生优育4 有助于白血病的诊断和分型 正常女性核型图 染色体检查的基本步骤 取材 主要采取外周血白细胞 皮肤组织 绒毛组织 羊水细胞 骨髓细胞培养 加入丝裂原获分裂细胞 制成染色体标本显微镜下进行初步的染色体观察和分析照相并进行核型分析讨论分析结果并作出诊断报告 染色体图象分析系统 人类染色体数目或结构畸变导致的遗传性疾病称染色体病 共同的临床特征 先天性多发畸形 智力低下 生长发育迟缓和