DAPI标记的原理.doc

DAPI标记的原理，应用以及优缺点一、DAPI的特性DAPI荧光染料是由Dann等人于1971年合成的，共化学名称为4,6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride (DAPI) 的中文名称是4，6-联脒-2-苯基吲哚，其结构式为 是一种常用的荧光染料，分子量为3503这种二价阳离于的荧光染料是一种黄色晶体易镕于水，最大溶解度为25可按高浓度的两价或高价阴离于(硫酸盐离子和磷酸盐离子)所沉淀，其作用机理与溴化乙锭等染色剂的机理类似：DAPI具有与各种来源的、富古AT碱基对的DNA专一结合的特点DAPI与DNA形成的复合物发出志强度的浅蓝色荧光共最大的激发波长为372nm，最大的发射波长为454nm，其荧光可按适当浓度的SO42加强 DAPI最初是作为一种杀锥虫剂合成的，以后用于DNA的检测Brunk等和Coleman等人证明了DAPI荧光强度与细胞内的DNA含量呈正比，并指出，在pH48范围内，DAPIDNA 复合物的荧光强度不受pH变化的影响用DAPI染色法可以测出2x1016g DNA。近年来，DAPI多用于细胞生物学和细胞遗传学的研究，由于死、活细胞的细胞膜对DAPI的通透性不同，极低浓度(0.5ugml)的DAPI就可与死亡细胞的DNA结合，产生明亮而稳定的荧光，所以人们开始把这一理想的话体荧光染科用于微生物、植物和动物细胞的细胞生物学和生物化学的研究。作为一种新型的DNA荧光染科，它具有专一性强、灵敏度高、稳定性好等特点，而且迄今尚来见到DAPI致癌。致畸等毒性报告有文献称之为无毒性荧光染料(Renard，1982)利用DAPI能与细胞DNA稳定结合这一特性，最近被人们用于干细胞的体内示踪。如造血干细胞和间充质干细胞的体内移植。DAPI是一种标记细胞核的荧光染料，因其与dsDNA有高度的亲和力，与DNA结合后会发出强烈的荧光。DAPI对活细胞无毒性，不改变细胞器的超微结构，荧光保持时间较长。文献显示DAPI标记的肌卫星细胞移植到宿主心肌2月后仍然可以看到。但DAPI在电镜下没有显示，若进行超微结构追踪观察需结合其它特殊的抗体标记。二、方法Cells主任介绍了利用DAPI染色标记细胞核的方法：实验用具及材料 试剂：PBS, 胎牛血清（FBS）,固定液, DAPI染色液, DMEM培养基, 胰酶（Trypsin）器材：培养皿, 15ml离心管, 试剂瓶, 微量移液器, 脱色摇床, 锡箔, 荧光显微镜和CCD溶液配制（1）固定液：将4g多聚甲醛加入80mlPBS中，搅拌过夜或者搅拌过程中微热直至固体全部溶解，定容至100ml就成为4的多聚甲醛固定液。 （2）DAPI染色液：在500ml水中加入8.5gNaCl和1.2gTris碱，用盐酸调pH值至7.4，再加入4ml 500mM的CaCl2和44ml 500mM的MgCl2以及0.05g的BSA；最后加入10mg的DAPI和100ml的DMSO，定容至1L，4度保存。实验步骤（1）转染两天后的细胞吸取培养基后，PBS洗一次。 （2）用4%的多聚甲醛PBS在室温固定15分钟。 （3）用PBS在室温漂洗三次，每次10分钟。 （4）用含0.5%Triton-X-100的PBS在室温穿孔15分钟 （5）用PBS在室温漂洗三次，每次10分钟。 （6）加入DAPI染色液室温作用15分钟以上，此后用锡箔包裹。 （7）用PBS在室温漂洗三次，每次10分钟。 （8）再荧光显微镜下观察，用UV波段激发，照相保存实验结果。Cells主任由介绍了MSC的标记方法：MSC-DAPI 标记（心肌细胞）: 将无菌的DAPI 储存液(美国Sigma 公司) 加入培养的MSC 上清中,至终浓度为50 mg/ L ,37 孵育染色至少30 min。细胞至少用Hanks 平衡盐溶液冲洗6 遍以除去未结合的DAPI。离心收集细胞,用无血清的DMEM 悬浮至移植所需浓度,置于冰上至少1 h 备用。贴张图，比较形象生动。 摘自：中华医学杂志2003 年11 月25 日第83 卷第22 期骨髓间充质干细胞在激光损伤大鼠视网膜下分化的观察。 DAPI为半通透性，用于常规固定细胞的染色。储存液用蒸馏水配成1mg/ml的浓度，使用终浓度一般为0.5 1mg/ml。三、不足但DAPI也有一定的不足：1、DAPI除与DNA双链结合外，还可与细胞浆中的微管蛋白结合，故胞浆也着蓝色。DAPI标记细胞的很大不足就是当标记细胞死亡后，就可以释放出DAPI，将周围未标记的细胞标记，从而产生假阳性，这也是我们用这类荧光染料标记细胞时必须考虑的问题。 文献报道骨髓间充质干细胞可以用绿色荧光蛋白（GFP）来标记，但具体方法操作起来比较复杂，也有用DAPI来标记的，但是假阳性率较高。参考文献DAPI荧光技术在动物生产中的应用 东北农学院学报 第23卷 第2期 1992年6月DAPI标记细胞也存在随细胞分裂荧光减弱的现象，DNA结合型荧光染料标记的方法，有一个难以克服的问题：细胞在受体内是否存活难以证明，因为这些经过荧光染料标记的细胞被巨噬细胞吞噬后，细胞碎片在巨噬细胞内也可以有荧光表达的。Y染色体原所以，仅使用这样的标记方法是很难在国际杂志发表论文的。比较可信的标记方法是位杂交和转基因标记，如果大家准备研究干细胞移植，就应当首先建立这样的技术平台，否则，最后的实验结果可能不被接受！注意：DAPI能维持时间的长短与被标记细胞分裂周期有关，分裂的次数越多持续时间越短，细胞死了当然另算了。体外培养, DAPI会缓慢排出体外，一般在1-2个月左右。如果是对心肌细胞染色，进入体内移植，可以持续2-3个月。常规干细胞跟踪技术1.遗传性地改变细胞的基因，使其表达特异性的标志物。（1） 绿色荧光蛋白（GFP）及增强GRP报告基因的转染。（2） 半乳糖苷酶（-Gal、LacZ）基因转染细胞标记技术。这是目前鉴定移植心肌细胞最常用的方法。将携带有半乳糖苷酶基因的质粒载体、逆转录病毒载体或腺病毒载体转染待移植的EG细胞，通过检测受体心肌或其他组织中的半乳糖苷酶活性，可以对移植的EG细胞进行定性和定位观察。2.选用雌性供体和雄性宿主，利用W染色体作为标志物。鸡染色体组成是雌杂合型(ZW型)：雌性个体性染色体组成为ZW,雄性个体性染色体组成为ZZ。移植后，通过检测雄性宿主不同组织中的W染色体出现的情况，来判定外源性的EG细胞在宿主体内的分布。3.利用染料标记细胞。用hochst33342标记胚胎生殖瘠细胞。将染料与EG细胞孵育。优点：标记率高，95%以上的细胞可被标记。操作简单，不需要进行染色等操作。标记时间长，有报道称细胞染色后体内移植，结果半年后取细胞检测，仍有hochst阳性。缺点：主要是不能观察细胞的形态，只能用于定位。4.移植前用5溴-2脱氧尿苷（BrdU）或氚标记去氧胸腺嘧啶核苷来标记正在分裂的细胞。用BrdU标记骨髓干细胞的优点是：简单、快速、安全，检测的敏感性好；在免疫细胞化学技术中，可产生一种对比度高的标记，且在低倍镜中亦可见，因此，适合于大块组织的快速检查，尤适于定量研究；BrdU既可用于活体标记，亦可用于细胞或组织细胞增殖、分化的标记。在石蜡包埋的组织或冰冻组织切片中，均可被显示，背景低、阳性和阴性易区分。使用BrdU对活体动物无任何副作用。此方法的缺点为标记时间较短。 5.DAPI染色标记示踪技术DAPI 为一种荧光染料,能与细胞核中的双链DNA结合而发挥标记的作用,在紫外光激发下,DAPI 在波长为345nm 的条件下荧光强度最高, 镜下可以看到显蓝色荧光的细胞,荧光显微镜观察细胞标记的效率高(几乎为100 %) ,且对活细胞无毒副作用。在细胞移植前,将DAPI 以一定的浓度加入培养基中,与细胞共同孵育过夜,用PBS 缓冲液漂洗至少6 次以洗掉未结合的DAPI , 在用酶消化后离心收集细胞, 加入DMEM 培养基制成细胞悬液以备用。 就细胞死后释放DAPI的问题：我们做过相关实验，将细胞DAPI标记后“杀死”，加入没有标记的细胞，过一段时间后观察，发现后加入的细胞被染上的程度极轻，与细胞移植的心脏切片中观察到的标记细胞有明显不同（明亮的兰色荧光）（有时间我会上传一些图片）。同时做HE染色，在1000倍下面观察，并与荧光相片做同一视野的对照，发现标记细胞核浆比很大，胞浆很少，稍嗜碱性，与心肌细胞有明显的差异（1000倍）。显然兰色荧光来自移植细胞。如果要求100%把握，可以将细胞做双标。hoechst只能标记出核，细胞的形态看不见，就是说只能定位用，不能用于观察细胞了。我用hochst33342（SIGMA)标记的神经干细胞。效果很好。细胞核在荧光下很清晰。hochst33342用PBS配成10UG/ML，将细胞PBS洗上2-3遍后，加入hochst33342，37度孵育30min，然后再用pbs洗2-3遍，就可镜下观察了。我觉得优点很明显：