HPLC测留兰香油中主要成分.doc

高效液相色谱法分析留兰香油中主要成分彭丽娟，张瑞伦（烟台大学化学与化工学院，山东 烟台 264000）摘要：考查留兰香油的理化性质，用高效液相色谱法（HPLC）测定其主要成分香芹酮和柠檬烯含量。方法采用ODS C18（250mm4.6mm,5m）色谱柱；以甲醇:水（75:25）为流动相梯度洗脱；流速为1mlmin-1；柱温为20；检测波长为200nm。结果香芹酮和柠檬烯线性范围均在01.4mgml-1和1.44.0mgml-1内，线性关系良好（R20.997），精密度、重复性和稳定性很好，为留兰香油质量综合评价提供了简单、准确、可行的分析方法。 关键词：高校液相色谱; 留兰香油; 流动相Determination of basic compositions purityin spearmint oil with HPLCPENG Lijuan，ZHANG Ruilun (School of Chemistry and Chemical Engineering，Yantai University，Yantai 264000，Shangdong，China)Abstract：HPLC is an analysis method which has been widely used. Carvone and limonene are the two basic compositions in spearmint oil .Checking the properties of spearmint oil ,and establish the method to determine the basic compositionscarvone and limonene in it with HPLC ,and choose the best measuring wavelength and mobile phase. Adopt ODS C18（250mm4.6mm,5m）chromatographic column with column temperature 20,when the wavelength is 200nm and mobile phase is methanol to H2O with a ratio 75:25, peak area of carvone and limonene has good linearity with their concentration（R20.997）. Both of them are between zero to 1.4mgml-1 and 1.44.0mgml-1.The method is simple and easy, has great sensitive、precision and stabilization. It can be a way to determine the basic compositionscarvone and limonene in spearmint oil and evaluate the quality of it.Key words: HPLC; spearmint oil; mobile phase 引 言留兰香油作为一种植物香料，在“崇尚自然、回归自然”为口号的今天，日益显现出巨大的魅力。它无论是在日用品工业还是食品工业，甚至医药工业均有大量应用，通常用香芹酮含量作为其主要的质量指标1。在现代分析方法中，气相色谱（GC)、高效液相色谱（HPLC)、质谱（MS)、核磁共振谱（NMR)、红外光谱（IR)、紫外分光光谱法（UV)都比较简便安全，其中气相色谱和液相色谱应用最为广泛2-7。气相色谱只能分析挥发性物质，不能用于热不稳定性物质的分析，高效液相色谱可以解决这两个难题。高效液相色谱只要求试样能制成溶液，而不需要气化，因此不受试样挥发性的限制10,11。它的分离效能高 、检测灵敏度高、 分析速度快，广泛应用于分离、分析高沸点、热稳定性差、有生理活性及相对分子量比较大的物质。由于留兰香油沸点达到230且为热不稳定性物质，用高效液相色谱作为分析方法是非常合适的。本实验即是研究了在既有HPLC条件下如何准确有效的分析留兰香油中的主要成分-香芹酮和柠檬烯，并给出了一定浓度范围内的标准曲线，可用来测定浓度和评定质量9-11。1 实验材料和方法1.1 材料留兰香油、甲醇、乙腈、乙醇和四氢呋喃，天津市科密欧化学试剂有限公司提供，除留兰香油纯度未知外其余均为色谱纯。标准品柠檬烯和香芹酮，购于上海安普科学仪器有限公司。实验用水为杭州娃哈哈集团有限公司生产的纯净水。1.2 装置和仪器 Waters1525高效液相色谱仪，美国Waters公司。电子精密天平，AR2130 ，奥豪斯（上海）公司。普通分析天平。KQ-100E型超声波清洗器。UV-2501 PC紫外可见光分光光度计，日本岛津公司。WZZ-I 自动指示旋光仪，上海光学仪器修理厂。1.3 色谱条件的确定实验固定条件:高效液相色谱仪Waters-1525，紫外检测器(Dual Absorbance Detector),色谱柱 ODS C18（250mm4.6mm,5m）,流动相流速 1ml/min,柱温 20。（1）检测波长的确定12：分别制备一定质量浓度的香芹酮-甲醇溶液、柠檬烯-甲醇溶液，经紫外分光光度法进行190400nm全波长扫描。(2) 流动相的选择：在固定条件和检测波长200nm下，换取下列不同的流动相（均为体积比）对留兰香油进行液相色谱分析。甲醇:水（70:30，75:25，80:20）乙腈:水（40:60，60:40，70:30，80:20）甲醇:乙腈:水（40:40:20，45:45:30，50:50:20）四氢呋喃:水（70:30，75:25）。 1.4 标准曲线的绘制实验取0.1ml样品，用甲醇定容稀释至25ml容量瓶。分别精密称取不同质量的香芹酮、柠檬烯标准品，均由甲醇定容，制备一系列浓度的香芹酮-甲醇、柠檬烯-甲醇标准品溶液。在如下色谱条件下：色谱柱ODS C18（250mm4.6mm,5m），检测波长200nm,柱温20，流动相甲醇:水(75:25),流速1ml/min，取配制好的标准品溶液，分别进样20L，取3次的平均值，以香芹酮（柠檬烯）的质量浓度为纵坐标，其对应的峰面积为横坐标，线性回归得回归方程10-13。1.5 精密度实验在1.4所述色谱条件下，对0.392mg/ml香芹酮标准品和0.9472mg/ml柠檬烯标准品进行色谱分析。分别每隔两小时连续进样5次，计算日内标准偏差；每天进样一次，连续五次，计算日间标准偏差。1.6 重复性实验在1.4所述色谱条件下，对同一批样品进行色谱分析，连续进样，测定10次，记录峰面积，计算RSD值。1.7 稳定性实验在1.4所述色谱条件下对0.098mg/ml香芹酮标准品溶液和0.646mg/ml柠檬烯标准品溶液进行色谱分析。分别在5h之内，间隔1h进样一次，记录峰面积，计算RSD值。2 实验结果与讨论2.1 色谱条件的确定2.1.1 检测波长图1香芹酮标准品-紫外可见扫描Fig.1 Uv-vis scanning of carvol reference substance图2柠檬烯标准品-紫外可见扫描Fig.2 Uv-vis scanning of limonene reference substance由扫描曲线图可以看出，香芹酮在235nm处有最大吸收，柠檬烯在200nm左右有最大吸收，实验过程中为了同时检测出这两种物质，选择检测波长为200nm。2.1.2 流动相图3 流动相为甲醇:水（70:25）时的色谱图 Fig.3 Chromatogram of mobile phase methanol to H2O with a ratio 75:25经实验在一个小时内，当流动相为甲醇:水时，70:30只能检测到香芹酮，80:20以及75:25可以将两种物质同时检测出。虽然80:20出峰时间比较短，在20分钟内便可，但是对香芹酮附近的物质分离效果不是很好。75:25基线分离，峰形尖锐。当流动相为乙腈:水时，40:60只能检测到香芹酮，其余四种可以将两种物质同时检测出。但是80:20在香芹酮附近连峰，基线未完全分离开。相对于70:30，60:40出峰时间较长。70:30可以在短时间内有效检测出香芹酮和柠檬烯，且效果良好。当流动相为甲醇:乙腈:水时，45:45:30只能检测到香芹酮，其余两种虽可将两种物质同时检测出，但基线未完全分离开，均出现连峰情况，不适合来分析留兰香油主要成分。当流动相为四氢呋喃:水时，70:30和75:25都只能检测都香芹酮，不适合来分析留兰香油主要成分。综合各流动相，甲醇:水（75:25）和乙腈:水（70:30）检测效果是最好的。考虑到两者的经济成本等因素14，最终选择甲醇:水（75:25）作为流动相。2.2 标准曲线的绘制 以香芹酮（柠檬烯）的质量浓度为纵坐标，其对应的峰面积为横坐标，作标准曲线。图4 柠檬烯标准曲线Fig.4.Standard curve of limonene图5 香芹酮标准曲线Fig.5.Standard curve of carvol在选定的实验条件下，香芹酮在低浓度01.4mg/ml范围内，回归方程Y=0.056X-0.055,R2=0.997；在高浓度1.44mg/ml范围内，回归方程Y=0.266X-5.655，R2=0.997。柠檬烯在低浓度01.4mg/ml范围内，回归方程Y=0.019X-0.021,R2=0.999；在高浓度1.44mg/ml范围内，回归方程Y=0.057X-2.827，R2=0.995。实验定量准确，在一定浓度范围内，香芹酮和柠檬烯的TUV响应与其浓度线性相关，相关系数高，线性关系良好，可以作为留兰香油中主成分的测定依据15。2.3 精密度香芹酮连续进样五次RSD=0.22%,日内RSD=0.36%日间RSD=1.90%；柠檬烯连续进样五次RSD=0.72%,日内RSD=0.42%日间RSD=0.95%。2.4 重复性连续进样十次，香芹酮RSD=0.87%;柠檬烯RSD=0.65%。2.5 稳定性标准品溶液在5h之内，间隔1h进样一次，香芹酮RSD=0.13%，柠檬烯RSD=0.24%。3 结 论（1）所测留兰香油理化性质结果符合国际留兰香油标准16。其主要成分为香芹酮和柠檬烯，确定高效液相色谱检测条件为色谱柱ODS C18（250mm4.6mm,5m），检测波长200nm,柱温20，流动相甲醇:水(75:25),流速1ml/min。（2）以峰面积为横坐标，浓度为纵坐标的标准曲线：香芹酮Y=0.056X-0.055,R2=0.997（01.4mg/ml）Y=0.266X-5.655，R2=0.997（1.44.0mg/ml）柠檬烯Y=0.019X-0.021,R2=0.999（01.4mg/ml）Y=0.057X-2.827，R2=0.995（1.44.0mg/ml）。（3）精密度、重复性、稳定性等都比较好。References1 Adams RP. 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