DNA的琼脂糖凝胶电泳.ppt

实验十 DNA的琼脂糖凝胶电泳 实验目的 掌握琼脂糖凝胶电泳检测DNA的原理和方法 一 实验原理 DNA分子在pH值高于其等电点的溶液中带负电荷 在电场中向阳极移动 DNA分子在电场中通过琼脂糖凝胶而泳动 除了电荷效应以外 还有分子筛效应 由于DNA分子可片段的相对分子质量不同 移动速度也不同 所以可将相对分子质量不同或构象不同的DNA分离 0 6 1 4 琼脂糖凝胶适用于3 106 11 106相对分子质量的DNA分子或片段的分离 所需DNA样品量为0 5 1 0ug 琼脂糖凝胶电泳分离后的DNA可用溴化乙啶染色 溴化乙啶分子可插入DNA双螺旋结构的两个碱基之间 形成一种荧光络合物 在254nm波长紫外光照射下 呈现橙黄色的荧光 用溴化乙啶检测DNA 可检出10 9g以上的DNA含量 二 试剂与器材 1 6 上样缓冲液 含0 25 溴酚蓝 0 25 二甲苯青 30 甘油的TBE缓冲液 2 5 TBE电泳缓冲液 0 45mol LTris 硼酸 0 01mol LEDTA PK 8 3 称取54gTris碱 27 5g硼酸 3 7gEDTA Na2溶于800ml蒸馏水中 定容至1000ml使用时用蒸馏水稀释10倍成为0 5 TBE电泳缓冲液 3丶琼脂糖4 溴化乙锭 EB 10mg mL 取EB0 10g 完全溶解于10mL水中 避免温室保存 5丶DNA分子量标准品 DNAMarker 6丶DNA样品液 三 操作方法 琼脂糖胶液的制备 称取0 6g琼脂糖 置于锥形瓶中 加入60ml0 5 TBE电泳缓冲液 置于微波炉或水浴中加热融化 取出摇匀即为1 琼脂糖凝胶液 待凝胶液冷却却至60 后加入溴化乙锭3 L 使其终浓度为0 5 g mL 胶板的制备在制胶槽内插入样品梳 将凝胶液倒入制胶槽中 待胶凝固后 取出梳子 讲内槽放入电泳槽内 加入0 5 TBE电泳缓冲液至电泳槽中 使其没过凝胶表面1 2mm 排除加样孔中的气泡 加样用移液器将DNA样品液5 L与6 上样缓冲液1 L混匀后加入加样孔 记录点样顺序 其中一个加样孔中加入DNA分子量标准品6 电泳加样完毕 将靠近样品槽一端连接负极 另一端连接正极 千万不要搞错 接通电源 开始电泳 在样品进胶前可用略高电压 防上样品扩散 样品进胶后 应控制电压降不高于5V cm 电压值V 电泳板两极之间距离比 当染料条带移动到距离凝胶前沿约lcm时 停止电泳 观察与拍照小心地取出凝胶置托盘上 并用水轻轻冲洗胶表面的溴化乙锭溶液 然后再将胶板推至预先浸湿并铺在紫外灯观察台上的玻璃纸内 在波长254nm紫外灯下进行观察 DNA存在的位置呈现橘红色荧光 肉眼可观察到清晰的条带 荧光在4 6小时后减弱 因此 初步观察后 应立即拍照记录下电泳图谱 观察时应戴上防护眼镜或有机玻璃防护面罩 避免紫外光对眼睛的伤害 拍照时 照相机加上近摄圈和红色滤光铺头 用全色胶卷 56光圈 曝光时间根据条带 荧光的强弱进行选择 10 60s 将电泳图谱底片适当放大为照片 四 注意事项 溴乙锭是DNA诱变剂 配制和使用EB染色液时 应戴乳胶手套 并且不要将该溶液洒在桌面或地面上 凡是沾污过溴乙锭的器皿或物品 必须经专门处理后 才能进行清洗或弃去 为使DNA完全酶解 需加入适量 足够的酶 太少反应不完全 太多则很费 由于每次购进的酶浓度不可能相同 因此酶和DNA加入的体积不能固定 合适的酶量应该通过预试验来定 DNA酶解过程中 使用的器具都应干净 并经消毒 配制试剂需用灭菌的双蒸水还要防止限制性内切酶被污染 加样量的多少决定于加样槽最大容积 可以采用大小不同样品糟模板以形成容积不同的加样槽 加人样品的体积应略少于加样槽容积 为此 对于较稀的样品液应设法调整其浓度或加以浓缩 五 思考题 1 琼脂糖与琼脂有什么不同 本次实验为何选琼脂糖作为电泳介质 2 上样缓冲液由哪些成分组成 各有何作用 3 常用的DNA琼脂糖凝胶电泳缓冲液有哪些 为何在这些电泳缓冲液中要加入EDTA 琼脂和琼脂糖 琼脂是由琼脂糖和琼脂果胶组成的 琼脂糖是线性的多聚物 基本结构是1 3连结的 D 半乳呋喃糖和1 4连结的3 6 脱水 L 半乳呋喃糖 琼脂果胶是由许多更小的分子组成的异质混合物 它们的结构相似 但带硫酸根和羧基组分 凝胶能力差 琼脂糖具有亲水性 并几乎完全不存在带电基团 对敏感的生物大分子极少引起变性和吸附 是理想的惰性载体 在琼脂糖制备过程中需要把琼脂果胶尽量去除 否则琼脂糖有可能存在极微量硫酸根和丙酮酸取代电离基团 就会造成电内渗 EEO 电内渗对质点的移动产生影响 质量较好的琼脂糖硫酸根含量比较低 通常在0 2 以下 电内渗比较小 通常在0 13以下 这也就是琼脂糖比琼脂贵那么多的原因了 上样缓冲液 含0 25 溴酚蓝 指示剂0 25 二甲苯青 示踪染料30 甘油的TBE缓冲液 增加密度 电泳缓冲液 电泳缓冲液在电泳过程中的一个作用是维持合适的pH 电泳时正极与负极都会发生电解反应 正极发生的是氧化反应 4OH 4e 2H2O O2 负极发生的是还原反应 4H 4e 2H2 长时间的电泳将使正极变酸 负极变碱 一个好的缓冲系统应有较强的缓冲能力 是溶液两极的pH保持基本不变 电泳缓冲液的另一个作用是使溶液具有一定的导电性 以利于DNA分子的迁移 TAE是使用最广泛的缓冲系统 其特点是超螺旋在其中电泳时更符合实际相对分子质量 TBE中电泳时测出的相对分子质量会大于实际分子质量 且双链线状DNA在其中的迁移率较其他两种缓冲液快约10 电泳大于13kb的片段时用TAE缓冲液将取得更好的分离效果 此外 回收DNA片段时也易用TAE缓冲系统进行电泳 TAE的缺点是缓冲容量小 长时间电泳 如过夜 不可选用 除非有循环装置使两极的缓冲液得到交换 EDTA 电泳缓冲液还有一个组分是EDTA 加入浓度为1 2mmol L 目的是螯合Mg2 等离子 防止电泳时激活DNA酶 此外还可防止Mg2 离子与核酸生成沉淀 常用电泳缓冲液 Tris 硼酸 TBE 使用液 0 5X 0 045mol LTris 硼酸 0 001mol LEDTA储存液 5X 54gTris碱 2