Multiple isos of immune-related genes from hemocytes and eyestalk cDNA libraries翻译.doc

通过三疣梭子蟹血细胞和眼柄cDNA文库对免疫相关基因的多个亚型进行研究关键词：、摘要表达序列标签(est)分析已被证明是一种有效的方法不仅对基因的发现,但也对基因表达谱数据的性能。两个完整的浓缩cDNA文库是通过梭子蟹属血的细胞和眼柄构建的，并分别且随机测序用以收集基因组2息和识别基因参与免疫防御反应。其中，包括64 非重复序列(6.00%的1066 unigenes)在通过血细胞文库和35非重复序列(6.86%的510 unigenes)在眼柄库标识在内的共99 unigenes被确定为免疫基因。这些基因分为六类，抗菌肽,氧化还原蛋白质,黑化作用相关的蛋白质,伴侣蛋白,凝固蛋白和其他免疫因素。在眼柄库中，免疫基因表的内容和类别眼表明眼柄可能在蟹免疫中扮演者一个未被人们认知的角色。包含多个蛋白质亚型的五种免疫基因已经被识别并各具特点,包括反垄断糖类因子(PtALF1-7)、crustin (PtCrustin1-3)、硫氧还蛋白(PtTrx1-2),夹域丝氨酸蛋白酶(PtcSP1-5)和kazal（卡扎尔）型蛋白酶抑制剂(PtKPI1-4)序列比对和进化分析显示反垄断糖类因子包含两个半胱氨酸残基,可能是由多个基因位点进行编码。PtCrustin1-3分享一致的半胱氨酸的主题,被认为是crustins1型PtTrx1拥有关键结构半胱氨酸残基Trx- 1中的C 73，而PtTrx2有Trx - 2的N-末端的线粒体易位信号。序列分析表明PtcSP1-5 ，包含一个夹域和一个部分SP催化三联域。PtKPI1 -4呈现一个典型的Kazal域，包含6个保守的半胱氨酸残基。一些蛋白异构体有组织特异性，这可能会暗示他们有不同的起源，并执行不同的功能。除PtALF1 -3和PtCrustin1 ，其他亚型还是在三疣梭子蟹这项研究中首次发现。特别是， PtTrx2首次在甲壳类动物中被发现。我们的研究将提供有用的基因组信息，有利于对蟹免疫的分子机制的了解。介绍cDNA文库构建设和表达序列标签(est)分析是有效的方法，用以收集基因信息并识别有用基因。他们起初被用于发现新的人类基因，但现在广泛用于研究重要水产养殖动物（包括鱼类、虾和螃蟹）的基因组学。EST数据库在基因表达分析上拥有丰富的资源,可以为在特定组织内的主要转录提供一个信息概览。许多组织特异的基因和表达模式特征已经成功表达,这对理解基因功能,组织生理学和转录组学都是非常有用的。这种甲壳纲动物血细胞在宿主免疫反应中起着非常重要的作用，包括识别、吞噬作用,黑化作用,细胞毒性和细胞内信号交流。来自血细胞的EST数据库已开发了许多甲壳纲动物物种,其中各种各样的免疫相关的基因已经进行了表征免疫基因中,多个蛋白质亚型已被报道在同一个生物体的血细胞内共存。例如,至少五个不同的亚型的抗脂多糖因子已确定在中国对虾中存在。几个crustins亚型已经在凡纳滨对虾和大西洋白对虾、青蟹属中证实。至少12和六kazal型蛋白酶抑制剂分别在小龙虾和斑节对虾中发现。这些蛋白亚型区分于长度和序列，并扮演者不同的生物活性。甲壳纲动物的眼柄是一个重要的神经内分泌器官复合体并有独特的能力来调节许多生理过程包括脱毛、生长和生殖19、20。EST的研究进行了几种眼柄甲壳纲动物物种包括对虾和囊对虾属。许多基因专门参与视觉和神经内分泌系统，如抑制蛋白类、甲壳纲动物高血糖的激素(CHH)、脱皮抑制激素和蝗抗利尿肽(MIH)和颜料分散激素(PDH)。然而,直到现在,很少知道眼柄还扮演免疫角色。活梭子蟹属在中国是一个重要的水产养殖物种。频繁爆发的疾病导致产量减少和经济损失。分子机制蟹免疫力的研究可能在蟹农业有利于发展更好的水产养殖管理策略。然而,三疣梭子蟹基因序列信息在公共数据库是非常有限的。当今研究主要目的的是从眼柄和血细胞中构建一个完整的cDNA库,和并执行est序列分析, 以便确定免疫基因尤其是那些在三疣梭子蟹中的的多种蛋白质亚型。材料与方法：1组织收集和RNA提取一个男性梭子蟹(305.36克)从中国青岛一个商业农场获得。这个眼柄从蟹中切割。从最后一个腿使用注射器提取血淋巴,并迅速添加到一个等体积的抗-混凝剂。血-淋巴样立即在800 g离心,4 c 10分钟，收集血细胞。血细胞和眼柄中总RNA和Trizol试剂(表达载体) 在一起被分别分隔开来，信使MRNA纯化与Oligotex工具包(试剂盒)放在一起。总RNA和信使RNA的完整性都是例行审查与1%琼脂糖凝胶电泳。2 cDNA文库构建通过姬氏和眼柄cDNA图书馆是构建的创造者智能cDNA图书馆建设工具根据厂商的协议(Clontech)。合成了第一股cDNA使用MMLV逆转录酶与智能IV寡核苷酸底漆和CDSIII / 30 pcr底漆。双-滞留cDNA(ds cDNA)合成了长途PCR(ld PCR)与50个PCR底漆和CDS III / 30 PCR底漆。ds cDNA立即被接受蛋白酶K(0.8毫克/毫升)为20分钟在45度,然后SfiI消化。消化产品,电泳分离1.0%琼脂糖凝胶。1 e3 kb碎片被凝胶纯化和克隆成pDNR-LIB向量。3 测序个体克隆是从两个cDNA库中,随机选择并放入96孔板包含1.0毫升LB培养基在37 c一夜之间及孵化。质粒DNA准备使用碱性溶菌制剂协议26。插入测序的cDNA从50端使用M13通用引物在一个ABI3730汽车交配音序器(应用生物系统)。4 EST组装、注释和生物信息学分析原始序列的est被程序Phred处理作为基础点。向量和适配器序列被交叉匹配程序隔离。est序列( 100个基点) 利用Phrap程序被组装成连续的序列(contigs)，使用的只需稍作修改默认设置为40 bp最低重叠和99%的身份(/)。单例对象(est不能组装在一起)和邻接片段受到当地BlastX和BlastN分析对非冗余(nr)蛋白质和核苷酸(nt)数据库中搜索相似。功能性类被分配根据基因本体论(去)映射提由GO网站提供(http:/ /)。此外, 固有免疫反应相关的unigenes功能基因(contigs和单例)经手工方法根据最近的EST的研究所鉴定。5肽预测,多个序列校准和系统分析推导出的免疫基因的氨基酸序列由专家蛋白质分析系统进行了分析(/)。SignalP信号肽 3.0程序是用来预测信号肽表达和位置、氨基酸序列中的切割位点。免疫基因亚型的多序列比对都使用了Clustal X的默认设置29。连续序列单位矩阵导出基于对齐的氨基酸序列BioEdit软件30。对于包含完整的开放阅读框的亚型,系谱关系却是用贝叶斯推理(BI)分析使用Mrbayes 3.1231。进化模型被ProtTest version 1.432。四个马尔可夫链是1000000代(抽样每1000代)运行，来允许充分的时间收敛。在第一个100棵树(10%)都被抛弃了燃烧在剩下的900个取样的树木被用来估算50%的少数服从多数原则共识树和贝叶斯后验概率(BPP)。结果：1、 cDNA库和est序列信息我们进行单次的50测序，每个插入随机，选取血细胞和眼柄的cDNA库中的克隆。CDNA文库的一般信息和EST数据在表1中进行总结。5143个克隆通过姬氏cDNA图书馆测序,4452个高质量的est序列(基因库加入数字:GT555584eGT560035)在修剪向量序列和消除低质量的序列后获得的。在眼柄cDNA图书馆,5361个克隆被测序，4606个est序列(基因库加入数字:GT560036e GT564641)满足高质量标准。est序列的平均长度是657和630分别在姬氏和眼柄库,长度分布的可读的est序列显示在图1 血细胞库中的4452est序列由1066 unigenes独立/功能基因包含461 叠连群contigs(43.25%)和605单一序列(56.75%)组装成的。在眼柄库,4606ESTs由510个unigenes est序列包含301 contigs(59.02%)和209单例(40.98%)组装而成。在独立基因unigenes中,大多数contigs包含2 -6 est,只有11 contigs从姬氏图书馆和15从眼柄库是由超过50个est序列(图2)。2、BLAST分析所有的unigenes从这两个库都受BlastX和BlastN程序对nr和nt数据库。1066 unigenes中的660(61.91%)是由血细胞文库中的2901ESTs组装的。510 unigenes中的365 (71.57%)是由眼柄文库中的3199ESTs组装的。与基因在公共数据库有共享高相似性(BlastX e值 105或BlastN e值 1010)。这些匹配unigenes可以分为三组,包括“已知基因”、“假定的基因”,和“未知基因”（图3）与已知的功能的蛋白质序列展现重大匹配的已知基因,包括206 unigenes(匹配unigenes的31.21%)从通过姬氏图书馆和181(49.59%)从眼柄库。假定基因, 与蛋白质共享高相似性描述为“假定”、“喜欢”或“相似”,包含376(匹配unigenes的56.97%)和125(34.25%)unigenes从通过姬氏和眼柄库，分别。未知基因,呈现了与未知功能蛋白质的高同源性,有78(11.82%的匹配unigenes)和59(16.16%)unigenes从通过姬氏和眼柄库,分别。除了匹配的unigenes,其他406 unigenes(1099unigenes的38.09%,1551est)从通过姬氏图书馆和145(28.43%,1407 est)从眼柄库，没有与公共数据库任何蛋白质序列有显著匹配，被称作非匹配基因。（图3）3、最丰富est序列的识别表2列出了在每个库中最丰富的20个est序列。在血细胞文库中，,只有六contigs叠连群被识别同调于已知蛋白质,反之14不类似于任何已知的蛋白质。已知蛋白质中, 4452 est中3.86%是线粒体蛋白,2.14%为环腺苷酸监管蛋白,1.82%是类crustin抗菌肽和0.63%是丝氨酸蛋白酶。在眼柄库,只有五contigs是假定的或未知的蛋白质,而其他15是已知的蛋白质。大多数已知蛋白质在眼柄库是视蛋白 (总4606 est的15.20%)和线粒体蛋白(7.25%),其次是肌动蛋白(4.39%),表皮蛋白(3.89%)、抗脂多糖因子(2.50%)和精氨酸激酶(2.19%)。4. est序列分类和功能注释基于基因本体论(去)分类，这两个库中匹配的非重复序列根据细胞成分、分子功能和生物进程被进一步细分 (图4)。按照细胞成分来说,这些来自血细胞和眼柄库的匹配非重复序列分别被分类成8（7）和9（8）个分类。在眼柄库，包含一个序列的胞外区” (0.3%是特殊的细胞成分。在这两个库大多数类别的细胞成分是“细胞部分”(40.8%姬氏图书馆和38.4%眼柄库),其次是“大分子复合物”(12.3%和11.9%通过姬氏图书馆眼柄库)和“细胞器”(11.8%和13.1%通过姬氏图书馆眼柄)。根据分子功能，这两个库中匹配的unigenes都被分配为11种分类,比如“抗氧化剂”、“结构分子”和“运输蛋白”。被归类为分子功能的最序列涉及到连接(58.3%和49.7%通过姬氏图书馆和眼柄库),其次是那些参与“催化活性”(43.1%和34.5%通过姬氏图书馆眼柄库)。基于生物过程,这些姬氏和眼柄库的unigenes分为15和12个分类,分别。姬氏图书馆生物过程的三个额外分类是“发展的过程”,“死亡”和“生物粘附”,分别占了0.5%, 0.2%和0.7%。最具代表性的生物过程在这两个库都是“细胞过程”(46。0%和40.8%通过姬氏图书馆眼柄库)和“代谢过程”(45.3%和35.1%通过姬氏图书馆眼柄库)。5免疫非重复序列的识别通过序列相似性和手动注释,包括姬氏库(6.00%的所有1066 unigenes)内64个非重复序列过和眼柄库(6.86%的所有510 unigenes) 内35个非重复序列在内共有99 unigenes被确定为先天免疫因子。这些免疫unigenes可分为抗菌肽,氧化还原蛋白质,黑化作用相关的蛋白质,伴侣蛋白质、凝固蛋白质和其他类,其中大部分都列在表3中。例如,氧化还原蛋白质包含谷胱甘肽过氧化物酶(est_Contig876)、硫氧还原蛋白(est2_Contig311,est_Contig839)、铜/锌超氧化物歧化酶(est_Contig821)和硒蛋白(est_Contig878)。列出的基因, 九个基因在这两个库交叉表达 (表4)。17基因被发现仅在血细胞库中存在，如伴侣蛋白质,蛋白质和pacifastin。然而，antistasin-like丝氨酸蛋白酶抑制剂 (est2_Contig189)是确定只有在眼柄库出现。这些99 unigenes是由602 est序列组装的，est包括333个通过姬氏库(所有4452个est的7.48%)和269个(所有4606个est的5.84%)在眼柄库。在血细胞文库中,1.82% est序列(81的所有4452个est)被确定为crustins,0.97% est为抗脂多糖(ALFs)(43 4452)和0.85%(38 4452)est和丝氨酸蛋白酶相似度高。眼柄文库中的免疫ESTs， 3.21%(148of4606)被确定为ALFs,0。54%(25 ，4606)作为铁蛋白ferritins,0.46%(21， 4606)作为crustins。在这两个库中反微生物肽(ALFs和crustins)是免疫相关est序列中最大的集团。此外,1.46% est序列of血细胞库和0.56% of眼柄图书馆展现了同黑化相关蛋白的高同源性。0.49% est of姬氏图书馆和0.15% of 眼柄库与氧化还原因子共享高相似性。在血细胞文库和眼柄文库中都鉴定了已存在的免疫相关ESTs的数量和百分比在表4中对比。一些基因具有更高的百分比在血细胞文库,包括crustin(1.82% / 0.46%),丝氨酸蛋白酶 (0.85% / 0.17%),kazal-type蛋白酶抑制剂(0.36% / 0.11%)和14-3-3(0.11% / 0.04%)。阿尔夫 (3.21% / 0.97%)、硫氧还蛋白(0.15% / 0.13%),serpin(0.24% / 0.02%),铁蛋白(0.54% / 0.20%)和prohibtin(0.07% / 0.02) 的比例是在眼柄图书馆更高(表4)。.6、分析免疫基因的多个亚型EST集群和系统发育分析表明, 在三疣梭子蟹血细胞库和眼柄库在内包括阿尔夫,crustin,硫氧还蛋白,夹域丝氨酸蛋白酶和kazal-type蛋白酶抑制剂在内的五种免疫基因有多个亚型。3.6.1。抗脂多糖因子由191条est序列所代表的阿尔夫同系物(PtALF1-7)的七种亚型已经在三疣梭子蟹的两个库被发现。,PtALF1、2、4和5只存在于眼柄库,PtALF7只产于通过姬氏图书馆,和PtALF3和6观察在这两个库。在眼柄库,大多数是PtALF3同等型(63 est,1.36%的4606),其次是PtALF6(52 est,1.13%的4606)和PtALF1(26 est,0.56%的4606)。在通过姬氏库,PtALF6包括25 est序列(0.56%的4452)是丰富的,而PtALF7(15 est,0.34%的4452)和PtALF3(3 est,0.07%的4452)被发现在相对较低的水平。（看英文）PtALF1-7包含完整的279、327、372、378、363、348和372个完全开放阅读框(ORFs)，用以编码92、108、123、125、120、115和123推导出的氨基酸(图5)。PtALF假定的解理网站的1、2、3和7是相同的,位于阿拉巴马州之间(A)和Gln(Q)在n终点站,而其他亚型有不同的解理站点(图5)。PtALF3氨基酸序列比对显示与PtALF1 PtALF2和PtALF分别有70.7%，87.8%和69.1%高度相似性。,分别 (表5)。序列相似性其他不同的PtALF亚型是15.8%(PtALF1和PtALF4)到59.3%(PtALF2和PtALF7)。所有PtALF亚型包含两个半胱氨酸残基可以形成一个 ？ (图5),带正电的氨基酸残基主要聚集在二硫循环。一个共识模式W(T)CPGWT(一个)也发现在所有ALFs存在(无花果。5)。图5 解释：从梭子蟹属trituberculatus(PtALF1-7) 中标ALF同系物进行多重比对的推导出的氨基酸。星号表示氨基酸身份、(,)、(,)表明氨基酸相似。假定信号肽下划线。两个保守半胱氨酸残基标记为黑色。采用贝叶斯定理，一个基于阿尔夫成员的33氨基酸序列的系统树构造成型(图6)。这棵树拓扑显示所有PtALF分为两分支。分支1包括PtALF1-3和PtALF7分支包括。首先PtALF7分组与泥浆螃蟹“锡拉”paramamosain和锯缘青蟹,形成一个妹妹3.6.2 crustin(抗菌肽的一种)然而,他们都拥有一个半胱氨酸富集区和一个WAP域。【四个半胱氨酸残留共享一个共同基序如C -(X3)-C -(X8-12)-C-C】的情况被发现在PtCrustin1-3的半胱氨酸富裕地区都存在。WAP域C端包含8个半胱氨酸残基C1到C8，形成四二硫化物核心(4-dsc)。这个4 dsc域特征为C1 -(Xn)eC2 -(Xn)eC3(X5)eC4 -(X5)e C5eC6 -(X3e5)eC7 -(X3e4)eC833,也发现在PtCrustin1-3与C7 -(X3e4)c8代替C7 -(X5)eC8(图7)。基于20 crustin氨基酸序列的进化树如图8所示。两个不同的组,I型和II型分离在树上。I型是由螃蟹,龙虾和小龙虾crustins,而II型包括对虾crustins。在类型1中,PtCrustin1是首先与mub蟹“锡拉”paramamosain3.6.3两个不同的亚型的硫氧还蛋白(PtTrx1和PtTrx2)识别出眼柄和通过姬氏图书馆,分别。通过PRO -网站程序,潜在的Trx硫氧还原蛋白家族元