SDS-PAGE原理、方法详解.doc

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）一、 材料准备（1）丙烯酰胺单体（Arc）：在交联剂作用下形成聚丙烯酰胺（2）N，N-甲叉双丙烯酰胺（Bis）：交联剂（3）10%十二烷基硫酸钠（SDS）：阴离子去污剂，可与蛋白质结合，形成SDS-蛋白质复合物。由于SDS带有大量负电荷，当与蛋白质形成复合物后好比蛋白质穿上带负电的“外衣”，蛋白质本身带有的电荷则被掩盖，即消除了蛋白质分子之间电荷差异。配制方法：10g SDS，用双蒸水溶解并定容至100ml，室温保存。（4）10%过硫酸铵（Ap）：引发剂。配制方法：0.1 g过硫酸铵溶解于 1ml双蒸水中。过硫酸铵会缓慢分解，应新鲜配制。（5）N、N、N、N四甲基乙二胺（TEMED）：其碱基催化AP产生氧自由基，激活单体形成自由基，发生聚合。配制方法：原液使用。应使用电泳级TEMED。（6）30%丙烯酰胺凝胶贮液（Arc-Bis贮液）配制方法（50mL体系）：14.55 g丙烯酰胺0.45 g N，N-甲叉双丙烯酰胺，先用40ml双蒸水溶解，搅拌，直到溶液变成透明，再用双蒸水稀释至50 ml，0.45m滤膜过滤。用棕色瓶储存于4（丙烯酰胺单体贮液在储存过程中因光和碱催化发生脱氨反应，会缓慢转化成丙烯酸和双丙烯酸，储存液应测定pH值不超过7.0。丙烯酰胺单体贮液应在暗色瓶中保存，每隔数月须重新配制。丙烯酰胺具有很强的神经毒性和致癌性，并可通过皮肤吸收，其作用具有累积性。称量时必须戴手套和面具。）（7）分离胶缓冲液（pH8.8的Tris-HCl缓冲液）：1.5M Tris-HCl，pH8.8。配制方法：9.08 g Tris溶解在40ml 双蒸水中，用4 mol/L盐酸调节pH值8.8，再用双蒸水加至50ml。4保存。（8）浓缩胶缓冲液（pH6.7的Tris-HCl缓冲液）：1.0M Tris-HCl，pH6.8。配制方法：6.06 g Tris溶解在40 ml双蒸水中，用4 mol/L盐酸调节pH值6.8，再用双蒸水加至50 ml。4保存。（9）5Tris-甘氨酸电泳缓冲液：125mM Tris，1.25M甘氨酸，0.1% (m/v) SDS，pH8.3。配制方法：在900 ml去离子水中溶解15.1g Tris和94 g甘氨酸（电泳级）（pH8.0），然后加入50 ml 10% SDS（电泳级）或5g SDS，用去离子水补至1000 ml。（10）1SDS样品缓冲液：50mM Tris-Cl（pH6.8），100mM DTT，2（m/v）SDS，0.1（m/v）溴酚蓝，10%（v/v）甘油。不含DTT的1SDS样品缓冲液可在室温保存。DTT配成1M 的贮存液，临用前加入。（5SDS样品缓冲液：250mM Tris-HCl (pH6.8)，500mM DTT，10 (m/v) SDS，0.5(m/v) 溴酚蓝，50%（v/v）甘油。不含DTT的5SDS样品缓冲液可在室温保存。DTT配成1M 的贮存液，临用前加入。）（11）考马斯亮蓝染色液：将0.25 g考马斯亮蓝（Coomassie Brilliant Blue）R-250溶解在90ml甲醇：水（1:1，v/v）和10ml冰乙酸中，用滤纸过滤，室温保存。（12）脱色液配制方法：90ml甲醇：水（1:1）溶液和10ml冰醋酸的混合液。（13）蛋白质分子量标准物（marker）二、 原理三、 步骤（1） 按产品说明将制胶玻璃板装配到制胶器上。（2） 装配好后，可加水检查是否密封，防止漏胶。（3） 确定凝胶浓度体积，按附注1.配制分离胶溶液。按表中成分顺序加入烧杯中。（4） 小心将分离胶注入准备好的玻璃板间隙中，灌到距短玻璃板顶端约3cm处。注意：为浓缩胶留有足够空间（分离胶面距加样孔底1cm，即梳齿长再加1 cm。）（5） 轻轻在顶层加入几毫升覆盖物（无水乙醇、去离子水或正丁醇），以阻止空气氧对凝胶聚合的抑制作用。（6） 分离胶充分聚合。时间约3060min，聚合后在覆盖层和凝胶的界面间有一清晰的折光线。（7） 倒掉覆盖层，用无离子水洗凝胶上部数次，尽可能用吸水纸吸干凝胶顶端的残存的液体。（8） 按附注2.配制5%浓缩胶，并注入分离胶上端，插入梳子。插入梳子时要小心避免梳子顶端留有气泡。（9） 浓缩胶充分聚合，时间3060min。（10） 浓缩胶聚合好后，将制胶装置从基座上取下，放如电泳槽中。（11） 上下槽均加入新鲜Tris-甘氨酸电极缓冲液（至少负极槽使用新鲜电泳缓冲液）。（12） 小心拔出梳子，若孔间隔离凝胶条倾斜，用小号注射器针头扶正。（13） 用电泳缓冲液冲洗梳孔。（14） 样品准备：样品中加入50100l 1SDS样品缓冲液使之溶解，使浓度为0.51mg/mL，并沸水浴35min，室温下冷却。同样准备蛋白质分子量标准物。（15） 上样。用微量注射器小心将15l蛋白样品加到样品槽底部。电极缓冲液为Tris-甘氨酸电泳缓冲液。留一孔加Marker。加样时间要尽量短，避免样品扩散及边缘效应。（16） 电泳。开始时电压为8V/cm凝胶，染料进入分离胶后，将电压增加到15V/cm凝胶，继续电泳，直到溴芬蓝染料带抵达分离胶底部1cm距离，断开电源。（17） 染色。取下凝胶，用至少5倍体积的考马斯亮蓝染色液浸泡凝胶，放摇床上室温缓慢旋转4h以上。回收染色液。（18） 脱色：将凝胶浸泡在脱色液中，缓慢摇动48小时脱色。其间换脱色液34次。直到脱色充