第-3-次课-2-学时(1).doc

河 北 科 技 大 学 教 案 用 纸第 7 次课 2 学时上次课复习：1. -氨基酸的烃基化反应常用的二种试剂是？2. -氨基酸的茚三酮反应呈现的颜色是否都一样？3. 常用的打开二硫键的氧化剂和还原剂是什么？4. 哪三种氨基酸在280nm紫外光下有吸收峰？本次课题（或教材章节题目）：第三章蛋白质 第二节蛋白质概述第三节 肽及蛋白质的一级结构教学要求：1. 了解蛋白质的分类、形状及大小、构象和结构、生物学功能、肽与蛋白质的人工合成；2. 理解并掌握肽键、肽平面、二面角、，肽键的双键性质以及由此带来的对蛋白质肽键构象的影响；蛋白质的氨基酸序列与生物功能3. 熟记几种主要蛋白酶的作用部位和蛋白质氨基酸序列确定的方法，能根据实验推断简单多肽的一级结构。重 点：蛋白质一级结构的测定步骤；蛋白质的氨基酸序列与生物功能；蛋白质一级结构的概念；肽键的特点难 点：蛋白质一级结构的测定教学手段及教具：课堂讲授与PowerPoint演示相结合。讲授内容及时间分配：复习：5分第三章蛋白质第二节蛋白质通论一、蛋白质的化学组成与分类二、蛋白质的形状和大小三、蛋白质的构象和结构蛋白质的氨基酸序列与生物功能四、蛋白质生物学功能第三节肽及蛋白质的一级结构（15分）一、肽二、蛋白质的一级结构三、蛋白质氨基酸序列与生物功能四、肽与蛋白质的人工合成小结：5分课后作业1.蛋白质系数；单纯蛋白质；结合蛋白质；单体蛋白质；寡聚蛋白质；去污剂；多肽的等电点；肽平面、二面角2.肽键的特点；蛋白质紫外吸收特点；茚三酮反应；双缩脲反应；3.肽的酸碱特性；求某肽的pI及在某pH下所带净电荷；4.蛋白质一级结构测定序列的步骤？5.举例说明氨基酸序列与生物功能的关系？6.某肽加入测定氨基N末端的试剂后没反应。说明此肽是环肽？7.胰岛素人工合成的主要途径？195页习题：3,4,5，8参考资料生物化学科学出版社现代生物学精要速览中文版王镜岩等译蛋白质分子基础高教出版社第二版陶慰孙等第三节 蛋白质的共价结构162页l 肽l 蛋白质的一级结构及序列测定l 蛋白质的氨基酸序列与生物功能l 肽与蛋白质的人工合成一、肽l 肽和肽键的结构l 肽的两性解离l 肽的化学性质l 天然存在的活性肽1.肽和肽键的结构 肽是氨基酸的线性聚合物。l 氨基酸顺序：N端C端l 氨基酸残基；寡肽与多肽；环肽l 肽键的特点 具有部分双键特性，不能自由旋转,呈现相对的刚性和平面化。 肽键的亚氨基没有明显的解离和质子化。 除脯氨酸外多以反式结构存在。肽平面、肽单位、二面角多肽中的二硫键肽的命名开链肽都具有游离的氨基和羧基？ 有的开链肽的N端或C端的游离的氨基或羧基被别的基团结合（如烷基化、酰化等）或N端残 基自身环化（如：谷氨酸）。 脯氨酸在N端也没有游离的氨基。2.肽的两性解离 166页 具有两性解离和等电点： 多肽链中可解离功能团的pKa值）例：pH7时，所带静电荷是？pI是？是 0 pI=(4.6+7.8)/2求：三肽Lys-Lys-Lys的pI每个侧链解离后带有1/3个正电荷，此时的pH为pI。利用公式： pH = pKa + lg（碱/酸） pH = 10.2 lg（2/3/1/3） pH = 10.20.303.肽的化学反应 多肽链的水解：酸水解、碱水解、酶水解 具有旋光性 颜色反应 紫外吸收 颜色反应 茚三酮反应紫色，用于定性和定量肽。 双缩脲反应紫色或兰紫色(540nm）。 双缩脲法测定蛋白质的含量含有两个或两个以上肽键的化合物有此反应。氨基酸没有紫外吸收 具紫外吸收：在280nm处有最大吸收峰，可进行肽类定量测定。 原因是： 含Trp、Tyr、Phe 紫外吸收法测定蛋白质含量4.天然存在的重要多肽 以蛋白质形式存在:l 相对分子质量在6000以上的多肽称为蛋白质。l 多肽与蛋白质无严格的界线。 以天然活性肽形式存在：l 分子量比较小的多肽以游离状态存在。具有特殊的生理功能，常称为活性肽l 在天然活性肽中含有非蛋白质氨基酸和肽键。生物活性肽(Natural peptide) 167页 脑啡肽； 激素类多肽； 抗生素类多肽； 谷胱甘肽； 蛇毒多肽等。 脑啡肽（五肽）Leu-脑啡肽和Met-脑啡肽。 H3N-Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-COO H3N-Tyr-Gly-Gly-Phe-Met-COOl 前体物：前脑啡肽原（含267个残基）l 有和吗啡类似的镇痛作用（大脑中有吗啡受体）。l 内啡肽包括l 内啡肽（16肽）l 内啡肽（31肽）l 内啡肽（17肽） 前体物：促黑素促皮质激素原多肽类抗生素：一类具有很强抗菌能力的肽. 青霉素（二肽衍生物）： 短杆菌肽（10肽）：催产素和加压素谷胱甘肽：-谷氨酰半胱氨酰甘氨酸谷胱甘肽重要的生物功能 作为抗氧化剂维护蛋白质活性中心的巯基游离。 参与二硫化合物相互转化。 某些酶的辅酶，在体内氧化还原过程中起重要的作用。 GSH：在红细胞中作为巯基缓冲剂存在，维持血红蛋白和其他红细胞蛋白质的半胱氨酸残基处于还原态。肽的应用及发展 近年来，多肽的分离纯化、结构分析、化学合成、生物、放射免疫测定、免疫细胞化学以及遗传工程等新技术的应用，新的活性肽不断发现，对活性肽功能认识不断增长，促使这一领域迅速发展练习题 在一些天然肽中含有蛋白质中不存在的_、_等特殊结构。这些结构上的变化可使这些肽免受蛋白水解酶的作用。 蛋白质之所以出现各种内容丰富的构象是因为_键和_键能有不同程度的转动。 双缩脲反应肽、蛋白质、氨基酸都具有的反应。 在酸溶剂系统中进行纸层析分离Lys和Leu混合物，问哪种Rf大？ 用阳离子交换树脂分离PH7的氨基酸混合液Lys、Glu，问哪种先被洗脱出来？二、蛋白质的一级结构（化学结构）168页 指蛋白质分子中氨基酸的组成、排列顺序、连接方式以及多肽链的数目和关联。（主要为肽键，包括二硫键） 是蛋白质空间结构和生理功能的基础。蛋白质的一级结构测定多肽链氨基酸顺序测定要求l 样品必须是均一的。纯度在97% 以上l 知道蛋白质的分子量步骤（待测样品分成多份分别进行各步骤测定）l 测定蛋白质分子中多肽链的数目l 拆分蛋白质分子的多肽链和二硫键l 分析每一多肽链的氨基酸组成l 测定并确定多肽链的氨基酸序列l 确定原多肽链中二硫键的位置第一步：测定蛋白质分子中多肽链的数目 测定末端基（C端或N端），看蛋白质的摩尔数与末端基的摩尔数的比例？若1：1？1：2？1：3？第二步：拆分蛋白质分子的多肽链和二硫键 借助非共价相互作用缔合的（亚基之间） 采用变性剂：8mol/L尿素；6mol/L盐酸胍；SDS处理。 通过共价二硫桥（SS）交联的肽链 采用氧化剂或还原剂：将二硫键断裂。 分离、纯化多肽链：电泳、层析等方法。第三步：分析每一多肽链的氨基酸组成 待测样品经酸(6mol/L HCl)和碱(5mol/L NaOH)完全水解。 用氨基酸分析仪进行测定（强阳离子交换，茚三酮反应）。测定水解液中的氨基酸组成和比例， 氨量。第四步：测定多肽链的氨基酸序列 N末端氨基酸测定 C末端分析 多肽链的部分裂解和肽段混合物的分离纯化 确定肽段在多肽链中的次序1.N末端氨基酸测定 2,4二硝基氟苯法（ Sanger试剂，DNFB或FDNB）1945年由Sanger发明此法，曾用此方法测定了胰岛素的N -末端 PITC（苯异硫氰酸酯、Edman法） Edman （苯异硫氰酸酯法）能够不断重复循环，将肽链N-端氨基酸残基逐一进行标记和解离。一次可以连续测出80个左右的残基顺序。大的肽链测序前要化大为小，不能采用全水解。蛋白质顺序仪是以此法为原理设计的。Edman降解法的改进方法- DNS-Edman降解法 用DNS(二甲基萘磺酰氯)测定N端氨基酸l 原理DNFB法相同l 但水解后的DNS-氨基酸不需分离，可直接用电泳或层析法鉴定l 由于DNS有强烈荧光，灵敏度比DNFB法高100倍，比Edman法高几到十几倍l 可用于微量氨基酸的定量 用Edman降解法提供逐次减少一个残基的肽链l 灵敏度提高，能连续测定。 多肽顺序自动分析仪l 样品最低用量可在5pmol 氨肽酶法：从N端依次切断肽键H2NValHis-Leu-Thr-Pro-Val-GluLys COOH2.C末端分析 羧肽酶法 羧肽酶A：水解除Pro,Arg和Lys以外的所有C-末端氨基酸 羧肽酶B：只能水解 Arg和Lys为C-末端残基的肽键。 C-末端第二个是Pro时不作用 还原法 肼解法天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸被破坏不易测定出。3.多肽链部分裂解和肽段混合物的分离纯化要求：选用专一性强的、断裂点少的、反应产率高的蛋白水解酶或化学试剂进行有控制的裂解。后将所得混合物进行分离纯化。经N未端和C未端测定，确定出每一肽段的序列。酶解法（表现出专一性） 174页化学法 溴化氰水解法(CNBr):切割Met的羧基所形成的肽键。Rm=Met，形成高丝氨酸内酯。 用羟胺断裂:它断裂Asn-Gly-,但专一性不高。蛋白质中出现机率低，适于分子量大的蛋白质序列的测定。 Rm=Asn Rn=Gly4.确定肽段在多肽链中的次序 所得资料： N末端残基 HC末端残基S 第一套肽段OUSPSEOVERLAHOWT 第二套肽段SEOWTOUVERLAPS HO 借助重叠肽确定肽段次序：HOWT OUS EOVERLAPS第五步：确定原多肽链中二硫键的位置l 采用胃蛋白酶：专一性低，切点多。肽段比较小，分离、鉴定比较容易。作用pH在酸性范围。l 肽段混合物进行的对角线电泳对角线电泳巯基的保护例：有一个A肽？酸水解得到：Ala、Arg、Ser、Glu、Phe、Met；当A肽与FDNB试剂反应后得：DNP-Ala；当A肽用CNBr降解时得到：游离的Ser和一种肽 ；当A肽用胰蛋白酶降解时得到两种肽：一种含Ala、Arg，另一种含其它氨基酸当A肽用糜蛋白酶（胰凝乳蛋白酶）降解时得到两种肽：一种含Met、Ser，另一种含其它氨基酸；问A肽的氨基酸排列顺序如何？三、蛋白质的一级结构与生物功能181页 同源蛋白质的物种差异与生物进化 同源蛋白质具有共同的进化起源 血液凝固与氨基酸序列的局部断列 同种蛋白质氨基酸个体差异和分子病1.同源蛋白质的物种差异与生物进化 同源蛋白质l 可变残基l 不变残基l 序列同源细胞色素C 182页 是一类以铁卟啉为辅基的蛋白质，呼吸链的组分。不同生物体的细胞色素C序列间氨基酸差异数目的比较系统树2.同源蛋白质具有共同的进化起源 氧合血红素蛋白（序列同源，相似的生物功能） 原始珠蛋白基因 肌红蛋白（153）；血红蛋白（141,146） 丝氨酸蛋白酶类（序列同源，趋异的生物功能）祖先丝氨酸蛋白酶基因 胰蛋白酶；胰凝乳蛋白酶；凝血酶；纤溶酶 一些功能差异很大的蛋白质（序列同源，三级结构相似，不同的生物功能） 溶菌酶；-乳清蛋白3.血液凝固与氨基酸序列的局部断列185页血液凝固的生物化学机理 凝血系统 凝血因子，以无活性的前体或酶原形式存在。 纤溶系统：l 纤溶酶原单链糖蛋白l 纤溶酶原激活剂(PA) 主要是t-PAl 其他凝血酶原的结构示意图血纤蛋白原的结构示意图 分子含29个二硫键，6条多肽链由这些二硫键交联成一个整体分子。 凝血酶断裂血纤蛋白原中央球状区的4个Arg-Gly 键，释放出的肽称血纤肽。血纤蛋白原转变为软血纤蛋白块血纤蛋白单体以非共价键结合成血纤蛋白软凝块纤溶系统 t-PA激活纤溶酶原及纤溶酶降解血纤蛋白凝块。4.同种蛋白质氨基酸个体差异和分子病 同种蛋白质：来自同种生物行使同一生物功能的蛋白质 。例:镰刀形红细胞贫血病分子病 正常血红蛋白-Hb,非正常血红蛋白-HbS血红蛋白的结构 由4个多肽亚基组成，属寡聚蛋白质。成人血红蛋白主要是HbA（2 (各141肽 )，2(各146肽) ）。镰刀形红细胞贫血病的分子基础 分子基础 HbA: Val-His-Leu-Thr-Pro-Glu-Glu-LysHbS: Val-His-Leu-Thr-Pro-Val-Glu-Lys链 1 2 3 4 5 6 7 8脱氧HbS高浓度存在时，形成长纤维，使红细胞变形四、肽与蛋白质的人工合成 1958年，北大生物系在国内首次合成了具有生物活性的八肽催产素。 1965年9月，中科院生物化学研究所、有机化学研究所和北大化学系协作，在世界上首次人工合成了结晶牛胰岛素。 肽的人工合成有两种类型：l 由不同氨基酸按照一定顺序控制合成。l 由一种或两种氨基酸聚合或共聚合。 控制合成的困难：l 接肽反应所需的试剂的选择。l 接肽以前必须首先把不需参与反应的基团封闭保护。保护剂应具备两个条件在接肽时能起保护作用。在接肽以后又很容易除去，致引起肽键的断裂。 常用保护基的结构式肽键形成方法羧基活化法：氨基先保护起来，再将羧基转变成一个活泼的羧酸衍生物。偶联剂缩合法l 常用的是：N，N二环已基碳二亚胺（DCC），能够促进羧基和氨基之间的缩合反应。l DCC先与一分子氨基酸的羧基反应，生成类似酸酐的中间产物，这种不稳定的中间物能够进一步与第二分子氨基酸的氨基作用，形成肽键。l 消旋化可能性小，是多肽合成中应用最广的一种试剂。多肽的固相合成 1962年，Merrifiele R B发展起来的.此技术对分子生物学和基因工程研究具有重大影响和重要意义。 肽链的逐步延长是在不溶性聚苯乙烯脂小珠上进行，反应后通过简单的过滤回收被延长的产物，用于下一步全成。 整个合成过程可在程序控制的自动化固相合成仪上进行。 美国Merrifield等人报道，利用这种肽合成仪（peptide synthesizer)成功地合