病毒感染的分子诊断.ppt

病毒感染的分子诊断 刘映乐 病毒学国家重点实验室 武汉大学 2018 4 23 病毒感染的分子诊断 利用分子生物学方法对病毒进行检测分子生物学方法包括核酸扩增 核酸杂交 等温反应 质谱 普通测序 二代测序等检测对象主要是病毒核酸 病毒感染的核酸检测 普通PCR real timePCR 巢式PCR 多重PCRFISH一代测序高通量测序 PCR KaryB MullisUSA 美国教授KaryB Mullis于1983年发明了PCR技术 他因此获得了1993年诺贝尔奖 PCR PCR优缺点及应用 优点灵敏度高 特异性强操作简单设备要求低缺点PCR产物分析较繁琐 容易出现人为判读错误只能进行定性检测 无法实现定量分析应用病毒鉴定联合测序用于病毒分型和病毒耐药突变位点分析 Real timePCR 2020 3 20 Real timePCR Real timePCR的优缺点及应用 优点灵敏度极高 特异性极强机器分析判读结果 减少人工判读失误可实现高通量检测缺点易出现污染 对人员操作要求高要求房间分区 对场地硬件条件要求较高不同种属病毒之间没有相似核酸序列 多种病毒同时检测较难实现应用几乎应用于所有病毒感染的检测 且在不同国家地区应用最为广泛 诺如病毒荧光探针法检测试剂盒 全国首家获批诺如病毒核酸检测试剂盒 诺如病毒核酸检测试剂盒 国械注准20153400293 核酸类国内空白 人鼻病毒核酸检测试剂盒 国械注准20153400295 国内空白 人博卡病毒核酸检测试剂盒 国械注准20153400294 国际空白 眼部病毒感染多重real timePCR检测试剂盒 一个反应管中可同时检测肠道病毒 腺病毒 单纯疱疹病毒探针分别用FAM HEX CY3和CY5四种荧光标记的探针有内参 构建好了标准品 可进行绝对定量加入了UNG酶 可有效控制污染检出限可达1 10copies ml成本仅为市售试剂盒的1 10效益成本比 TAKARA Roche Bio Rad Thermo FluorescenceInSituHybridization FISH CarloForestaetal PLOSONE 2011 ClareConnor Nature 2008 HPV感染 FISH的优缺点及应用 优点直接检测病变组织细胞标本 对疾病的诊断意义更大可检测病毒是否整合到人基因组缺点操作繁琐 对人员素质要求高需要单独的细胞培养间应用HPV EBV 登革热病毒 HIV 基于转录的扩增 种酶 逆转录酶 酶 和 聚合酶 条特别设计的寡核苷酸引物恒温反应 不需要PCR仪能将病原体RNA扩增109倍 比常规PCR高 个数量级 基于转录的扩增的优缺点及应用 优点扩增时间短 恒温反应条件 不需要PCR仪在等温条件下 快速降解的RNA可极大减少扩增过程中污染的可能性缺点缺点是不能用于DNA病毒的检测以及多种酶混合体系的不稳定性应用在临床上应用于HCV HIV 肠道病毒和呼吸道RNA病毒的检测 loop mediatedisothermalamplification LAMP LAMP的优缺点及应用 优点等温扩增 不需PCR仪 可实现床旁或野外环境灵敏度和特异性均较高缺点引物设计极为复杂 研发门槛高 获批检测试剂盒少应用目前仅结核分枝杆菌获得CFDA认证 病毒检测尚处于研发阶段 数字PCR 数字PCR的优缺点及应用 优点无需标准品 可直接进行绝对定量对标本中的抑制剂有较高耐受性为跨实验室比较提供绝对参照标准缺点样品分散技术的稳定性有待提高 且成本较高通量较低 目前通常能检测的信号为FAM和VIC应用目前仅用于科研 但在临床病毒检测和定量方面极具应用前景 Sanger测序 Sanger测序的优缺点及应用 优点能对病毒进行分型 突变分析为病毒的传播路径等流行病学提供信息缺点通量低 一个反应体系只能分析一种病毒应用HBV HCV HIV HSV CMV VZV EBV 流感病毒等的抗病毒药物适用性分析 深度测序 深度测序的优缺点及应用 优点不需要对标本中的病毒有预期判断 可以发现新发病毒感染通量高 可检测到标本中含量少的病毒对于无菌体液中发现的病毒诊断价值高缺点海量数据 分析有难度部分标本中发现的病毒不一定与疾病相关应用重症感染及新发突发传染病疫情 比如埃博拉病毒 寨卡病毒 H7N9均是通过深度测序被诊断发现 法国梅里埃公司FilmArray 病原体全自动多重real timePCR检测系统 终点熔解曲线分析 法国梅里埃公司FilmArray 病原体全自动多重real timePCR技术原理 FilmArray 呼吸道病原体检测组套 美国FDA认证一个反应板能能同时检测呼吸道相关的17种病毒和3种细菌仅需2分钟将样本加入反应管中 剩下的病原体核酸提取 PCR和结果判断均为全自动操作1小时出结果但费用高昂 病毒 腺病毒冠状病毒229E冠状病毒HKU1冠状病毒OC43冠状病毒NL63人偏肺病毒人鼻病毒 肠道病毒甲型流感病毒甲型流感病毒H1亚型甲型流感病毒H1 2009亚型甲型流感病毒H3亚型乙型流感病毒副流感病毒1型副流感病毒2型副流感病毒3型副流感病毒4型呼吸道合胞病毒 细菌 百日咳杆菌肺炎支原体肺炎衣原体 FilmArray 腹泻病原体检测组套 美国FDA认证一个反应板能能同时检测腹泻相关的5种病毒 6种细菌 6种致泻性大肠杆菌和4种寄生虫仅需2分钟将样本加入反应管中 剩下的病原体核酸提取 PCR和结果判断均为全自动操作1小时出结果但费用高昂 细菌 弯曲杆菌艰难梭菌类志贺邻单胞菌沙门氏菌小肠结肠炎耶尔森氏菌弧菌 病毒 腺病毒F40 F41亚型星状病毒诺如病毒GI GII亚型轮状病毒札如病毒 致泻性大肠杆菌 EAECEPECETECSTECO157EIEC 寄生虫 隐孢子虫环孢子虫溶组织内阿米巴兰氏贾第鞭毛虫 FilmArray 脑炎脑膜炎病原体检测组套 美国FDA认证一个反应板能能同时检测腹泻相关的7种病毒 6种细菌 1种真菌仅需2分钟将样本加入反应管中 剩下的病原体核酸提取 PCR和结果判断均为全自动操作1小时出结果但费用高昂 真菌 隐球菌 新型隐球菌 病毒 巨细胞病毒肠道病毒单纯疱疹病毒1型单纯疱疹病毒2型人疱疹病毒6型人细小病毒水痘带状疱疹病毒 细菌 大肠杆菌K1流感嗜血杆菌产单核细胞李斯特菌脑膜炎奈瑟氏菌无乳链球菌肺炎链球菌 美国Luminex公司xTAG 多重PCR微球探针检测系统 20mins 1hr 2 5hrs 45mins 美国Luminex公司xTAG 多重PCR微球探针检测技术原理 病毒核酸提取 美国Luminex公司xTAG 多重PCR微球探针检测技术原理 MultiplexRT PCRusingtarget specificTAGgedprimers biotinylatedprimers GGCTACCGAT TAG1 3 5 B Bdsbiotinylated TAGgedTS PCRproduct CCGATGGCTA 3 TAG1 5 GGCTA TAG1 CCGAT 3 TAG2 5 B 5 TARGETPRESENT TARGETABSENT 病毒核酸扩增 TAGgedproductsarecapturedbytheircomplementaryAnti TAGsequence Streptavidin phycoerythrinreporter SA PE moleculeusedtodetectbiotinylatedprimer UniversalarraymadeupofdifferentbeadpopulationswithSA PEreporterpresent Anti TAG2 TAG2 Anti TAG1 B PE Region29 SA TAG1 Region34 美国Luminex公司xTAG 多重PCR微球探针检测技术原理 扩增的病毒核酸与固定有特异性探针的纳米微球杂交并检测 美国Luminex公司xTAG 多重PCR微球探针检测技术原理 Luminex100 200 xMAPTechnologybasedonflowcytometry RedLaser APDs classifyanti TAGcoupledbeads GreenLaser PMT quantifiesreporter representingspecifichybridizationevents MAGPIXxMAPTechnologyusingLEDsandCCD RedLED CCDcamera classifyanti TAGcoupledbeads GreenLED CCDcamera quantifiesreporter representingspecifichybridizationevents ReadonLuminex 200 orMAGPIX 信号数据获取并分析 美国FDA认证一个反应板能能同时检测呼吸道相关的19种病毒 3种细菌需要进行病原体核酸提取 PCR 杂交和结果判断需要手工加样 扩增产物的人工转移5小时出结果费用相对Flimarray较为经济 细菌 肺炎衣原体肺炎衣原体军团菌 病毒 腺病毒冠状病毒229E冠状病毒HKU1冠状病毒OC43冠状病毒NL63人博卡病毒人偏肺病毒人鼻病毒 肠道病毒甲型流感病毒甲型流感病毒H1亚型甲型流感病毒H1 2009亚型甲型流感病毒H3亚型乙型流感病毒副流感病毒1型副流感病毒2型副流感病毒3型副流感病毒4型呼吸道合胞病毒A型呼吸道合胞病毒B型 xTAG 呼吸道病原体检测组套 美国FDA认证一个反应板能能同时检测腹泻相关的3种病毒 6种细菌 3种致泻性大肠杆菌和3种寄生虫需要进行病原体核酸提取 PCR 杂交和结果判断需要手工加样 扩增产物的人工转移5小时出结果费用相对Flimarray较为经济 细菌 弯曲杆菌艰难梭菌志贺菌沙门氏菌小肠结肠炎耶尔森氏菌霍乱弧菌 病毒 腺病毒F40 F41亚型诺如病毒GI GII亚型轮状病毒A型 致泻性大肠杆菌 ETECO157EIEC 寄生虫 隐孢子虫溶组织内阿米巴兰氏贾第鞭毛虫 xTAG 腹泻病原体检测组套 美国赛沛公司的Xpert 病原体全自动real time检测系统 美国赛沛公司的Xpert 病原体全自动real time检测技术原理 高度集成化 自动化在一个反应杯里实现了标本病原体核酸的提取 PCR 检测和数据分析 Xpert 病原体检测项目 美国FDA认证一个反应管仅能检测1 2种病原体仅需2分钟将样本加入反应管中 剩下的病原体核酸提取 PCR和结果判断均为全自动操作1 2小时出结果 可检测的病毒 甲型流感病毒 乙型流感病毒呼吸道合胞病毒肠道病毒HIV 1病毒载量定量HCV病毒载量定量诺如病毒人乳头瘤病毒埃博拉病毒 可检测的细菌 艰难梭菌MRSACRE 美国GeneMark公司eSensor 探针 传感器分子检测系统 多重RT PCR之后用探针杂交再用伏安法电子传感器检测探针并分析信号 eSensor 呼吸道病毒检测组套 美国FDA认证能同时检测8种呼吸道病毒腺病毒 B C和E组冠状病毒 229E HKU1 OC43和NL63型甲型流感病毒 检测并分型乙型流感病毒人偏肺病毒副流感病毒 1 2 3和4型呼吸道合胞病毒 A和B组人鼻病毒需要进行病原体核酸提取 PCR 杂交和结果判断需要手工或机器提取核酸 扩增产物的人工转移4 5小时出结果 美国雅培公司Plex id PCR 质谱串联分子检测系统 多重RT PCR利用电喷雾电离质谱分析产物 美国FDA认证同时检测influenzaA和Bvirus需要进行病原体核酸提取 多重PCR 质谱分析6 8小时出结果 Plex id 流感病毒检测试剂盒 传染病长效防控能力的提升和网络实验室持续竞争力的增强 在 十一五 十二五 基础上 进一步完善监测技术体系 大幅推动监测技术普及下沉 全面提升病原发现鉴定能力和新发传染病的识别能力 最终提高对传染病暴发疫情监测预警的敏感度和有效应对国内外重大传染病疫情的处置能力 较为完善的监测技术体系和质控管理体系较为丰富的重大疫情监测实战经验较为高效的检测技术平台运转和团队协作机制 国家科技重大专项牵头建设单位 常规监测从30种扩大为98种全覆盖覆盖样本数15000份 扩大病原体监测范围 五大症候群扩大监测范围病原体 病原体变异变迁研究 综合利用三个五年计划的数据 深度解析中部地区重要病原进化变异与疫情暴发和临床重症发病之间的关系 生物信息学分析方法 体内体外评估技术 环境因子分析 对30种以上五大症候群传染病重要病原的变异变迁特征进行深入研究 分子时钟进化基因重组重配核苷酸变异速率阴阳性选择突变多肽极性分析蛋白结构模拟 毒力抗原性组织细胞嗜性耐药性 地域传播路径宿主传播链易感人群 病原体变异变迁研究 对重要病原的重组株和变异株的流行特征 抗原性 复制力和环境抵抗力等特性进行密切跟踪 及时预警散发尤其是暴发疫情 全基因水平扫描重要病原基因重组片断和重组断裂点 重组变异的病毒蛋白预测分析 优化重要病原的常见型别与未