医学研究生开题报告PPT课件.ppt

PVRL1基因多态性与环境交互作用和非综合征型唇腭裂的关联性研究 导师 xxx研究生 xxx2011 05 24 1 一 课题名称二 研究目的及意义三 立论依据和研究现状四 实验方法五 预期目标 2 六 已具备条件七 可行性八 研究主要阶段 进度和完成时间九 经费预算十 实验风险及前景分析 3 一 课题名称 PVRL1基因SNPs与环境交互作用和非综合征型唇腭裂的关联性研究 4 二 研究目的及意义 探讨PVRL1的SNPs在NSCL P的可能作用探讨NSCL P与环境因素的因果关系揭示基因 环境交互作用 研究目的 5 为NSCL P基因诊断提供依据为NSCL P家庭提供遗传咨询为广东人群基因数据库积累资料 研究意义 6 三 立论依据及研究现状 唇腭裂畸形是人类最常见的先天性发育缺陷之一 全世界发病率约为1 2 我国是世界上唇腭裂的高发国家之一 发病率约1 82 7 非综合征型唇腭裂 NSCL P MIM119530 是指不伴发其他系统 器官畸形的 不在某些综合征之列的唇裂 唇裂合并腭裂 及腭裂的总成 约占先天性唇腭裂70 8 目前的研究认为NSCL P是一类多因素复杂疾病 其发生是遗传和环境多种因素相互作用的结果 其遗传易感性和基因 环境交互作用是病因学研究的热点 9 10 一 环境因素 环境生物因素 孕早期微生物感染是导致NSCL P的重要危险因素之一 MetnekiJ等2005年在匈牙利的一项大规模以人群为基础的病例对照研究中表明 妇女在孕早期患普通感冒及流感显著增加了子代唇腭裂患病的危险性 OR 2 3和2 8 11 环境物理因素 环境物理因素主要包括电磁辐射 X RAY 微波 无线电波 电视 手机 电脑等 噪音等 BlaasaasKG等2002年的研究发现 孕妇每周接触50HZ电磁辐射大于24小时时 唇裂的发病风险增加 OR 1 78 12 环境化学因素 包括药物 环境污染 烟酒嗜好 孕期营养等 Ericson等2001年在对1995 1998年出生的2557例婴儿进行研究 发现母亲妊娠期间服用NASID导致唇腭裂的风险增加 OR 2 51 Chuangsuwanich等1998年在泰国的流行病学调查发现52 74 的唇裂患者母亲有孕期服药史 13 环境污染 MarcoVinceti等2001年在意大利北部铅污染地区进行了以人群为基础的病例对照研究 发现铅污染使唇腭裂发病风险增加 OR 2 28 14 烟酒嗜好 BaileyLJ等在1995年的研究中证明孕早期吸烟 产生的CO降低了胎儿的O2供应 从而促使唇腭裂的发生 HartsfieldJK等在2001年的研究中认为烟草的复合物可能影响遗传物质的合成及应用 15 孕期营养 IngridPC等2004年的研究中认为孕期增加植物蛋白 植物纤维 抗坏血酸等的摄入可降低唇腭裂发生 张思雷等2002年在对地塞米松诱导大鼠腭裂形成的研究中认为增加VitB6促进体内氨基酸和脂肪代谢等多种生命代谢 有助于胚胎修复唇腭裂畸形 增强抵抗力 降低先天性畸形的易感性 16 二 个体因素 ShawGM等1999年的研究中认为孕妇年龄 文化程度 剧烈妊娠反应及妊娠并发症与唇腭裂的发病相关 不同胎次唇腭裂的发生率有高度显著性差异 体重轻的新生儿唇腭裂患病率高 17 Spilson等2001年的研究中发现糖尿病孕妇生育唇腭裂患儿的危险性是非糖尿病孕妇的1 3倍 18 三 遗传因素 早期的遗传因素研究由于受研究方法 实验手段不够丰富所限制 学者们多通过已被证实的单基因致病的包含有唇腭裂的综合征来反推NSCL P的易感基因 19 近年来 随着人类基因组计划 HGP 的实施以及基因芯片技术的发展 对易感基因的研究及新易感基因的寻找更倾向于全基因组关联分析 GWAS 这是发现影响复杂性疾病发生的遗传特征的一种新策略 20 21 22 另外 国内外现在多认为单纯性腭裂 cleftpalateonly CPO 和唇裂伴或者不伴有腭裂 cleftlipwithorwithoutcleftpalate CL P 有不同的遗传学背景 前者倾向于单一主要基因影响 X和2号染色体 后者受多种基因影响 1 2 4 6 9 11 14 16 19号染色体均有相关基因或位点 23 CLP易感基因定位及相关文献研究CPO易感基因定位及相关文献研究 24 PVRL1 PoliovirusReceptorLike 1 位于Chr11q23 2区 编码细胞 细胞粘附受体 协同钙粘素调整上皮黏着连接形成的速度 并影响上皮细胞之间紧密连接的形成 对上皮粘附的发生和维持起重要作用 PVRL1基因 本课题研究基因 25 目前有关脊髓灰质炎病毒受体相关基因1 PVRL1 多态性与人群NSCL P的关系还不十分清楚 国内外不同研究机构对该基因研究结果报道不尽一致 甚至相互背离 这可能与基因存在种族和地区差异性 样本量 研究方法 评定原则相关 26 较早的对PVRL1和NSCL P的相关性研究是2000年美国学者SuzukiKj等在加勒比海的MargaritaIsland对CLPED1 MIM225000 MIM225060 患者研究中发现了PVRL1编码的185 TGG T G 和323 GGT GGTT 位氨基酸突变 此后在北部委内瑞拉的NSCL P患者中同样发现了PVRL1编码的185 TGG T G 位氨基酸的突变 同时 他们的研究还证实了该无义突变导致PVRL1编码的肽链的长度缩短 进而可能影响上皮粘附的发生 27 然而ScapoliL等2005年在意大利人群中并没有发现W185X的突变 但是他们发现了R199Q R210H R212H D424D这些突变 正常人中这几个氨基酸均为保守序列 28 Tseng等2006年在台湾的NSCL P患者和PVRL1的关联研究中得出的结论是185和323密码子 特别是W185X的突变 也是并不参与台湾人群的NSCL P形成 29 赵雄等2009年在对江浙地区汉族人群的PVRL1研究中 也没有发现W185X突变或者其他可信的多态性位点 得出结论是PVRL1基因exon3可能不参与江浙人群NSCL P发病 30 另外 Avila等2006年在挪威 菲律宾 南美人群中对PVRL1的研究中总共发现了25个与NSCL P相关的突变位点 其中比较有意义的S112T和T131A均出现在PVRL1V区的关键氨基酸附近 该区域之前被认为是介导细胞 细胞粘附和细胞 病毒粘附的区域 还有G361V出现在跨膜区 被认为可能影响PVRL1的结构 31 Tongkobpetch等2008年发现 泰国CL P患者的PVRL1基因第6外显子的1183G A具有杂合性 会导致395 V395M 位的缬氨酸被甲硫氨酸取代 32 然而舒申友等在2010年对PVRL1的病例对照研究中 并没有发现证据表明S112T T131A G361V和V395M参与了广东人群的NSCL P形成 33 Turhani等在2005年欧洲人群的研究中发现CLMPT1基因的内含子IVS7 10G A 外显子Gly331Gly Ala88Ala Pro309Pro的突变联合PVRL1基因的Glu441 Gly442插入Glu突变同时发生的话 可能是NSCL P的遗传因素 34 综上所述 国内外的研究机构对PVRL1基因的多态性与NSCL P的发病关联性研究中存在比较大的分歧 这样的结果一方面可以理解为人群的遗传背景不同 另一方面也与一些研究中的设计 例如样本量 纳入研究范围的样本 不同有关系 这样的原因导致统计强度不够 可能存在未被发现的多态性位点或者有意义的已知突变位点被误筛 35 四 实验方法 基于以上理论 采取可信公认的研究方法 在PVRL1基因90kbp的bases中筛查可疑的多态性位点 进而对阳性位点附近序列进行测序 而后进行病例 对照研究和家系分析两种分析方法揭示PVRL1基因单个SNP位点或单倍型与NSCL P的关系 最后揭示PVRL1基因的多态性与环境因素 流行病学调查 的交互作用与唇腭裂发病的关联 是本研究的技术路线 36 路线一 1 病例筛选 选取2008 2010年在我中心住院手术的NSCL P患者核心家庭200个 共600个个体 另外150例NSCL P患者 单纯患者 无父母参与 和350例健康志愿者对照组 提取外周静脉血10ml备用 2 提取所有研究对象共1100份基因组DNA 37 3 从人类基因组单体型计划 HapMapProject 数据库中已有的891个已知PVRL1基因的SNPs中使用软件SNPbrowser4 0 ABI 挑选出26个TagSNPs 每个可以代表4000bp碱基段 使用引物单碱基延伸 基质辅助激光解析电离飞行时间质谱 MALDI TOF 的方法行SNP分型并LD检验行单体型分析 38 单体型分析图Asix nucleotideinsertion deletionpolymorphismintheCASP8promoterisassociatedwithsusceptibilitytomultiplecancers NATUREGENETICSVOLUME39NUMBER5 MAY2007 39 40 41 42 4 运用病例对照 研究检验方法揭示单个SNP位点 或者多个SNP位点 即单体型块 与NSCL P之间的相关性 43 5 发现阳性位点之后 在阳性位点附近安排2 4轮DNA测序 Sanger法 每个反应扩增500个bp左右 若4轮反应则总共检测2000个bp左右片段 共700个样本 力求发现新的未被报道的突变位点 44 6 同样使用MALDI TOF的方法行200个核心家系父母 共400个个体 SNP分型 而后结合前述所在家庭患儿的SNP分型进行传递不平衡检验 力求发现阳性 与NSCL P有关联 的过传递位点 45 附 统计分析将使用软件 HAPLOVIER3 32软件行等位基因的HWE检验 等位基因和单倍型的关联分析等 PLINK软件行基因型和等位基因的关联分析 UNPHRASED软件行病例 对照研究 46 路线二 1 对研究对象 200个核心家庭 父母进行电话调查 具体调查项目包括儿童基本情况 父母基本情况 母亲妊娠早期情况 母亲既往史等 2 进行资料统一编码 建立数据库并录入数据 3 分析暴露因素与NSCL P发生的关系 47 技术路线图 48 五 预期目标 1 揭示PVRL1基因在广东人群中的单体型 并与NSCL P建立关联 2 发现新的SNP位点或者突变的DNA片段 并与NSCL P建立关联 3 揭示广东人群唇腭裂的环境危险因素 4 探讨环境因素和遗传因素在NSCL P发病中的交互作用 49 六 已具备条件 1 本研究前期标本 血样 收集已经完成 2 2010年在本中心的一个广东省自然基金课题中已经对PVRL1基因作了初步研究 但是样本量只选取了71患者和100个对照 样本量不够降低了统计检验的强度 3 本中心对NSCL P易感基因的研究已经积累充分经验 可提供宝贵的理论和实践指导 50 七 可行性 1 本研究样本量较大 结果真实性和可靠性较有保证 2 MALDI TOF检测方法被众多SCI杂志推荐为SNP检测方法 尽管TAQMAN探针法的特异性更高 但是相对于质谱法其成本贵 通量也不如质谱 51 八 工作主要阶段 进度和完成时间 1 实验所需血样基因组DNA已大部分提取完毕 2 TAGSNPs已选取完毕 3 已与上海邃志生物技术公司联系 洽谈委托试验 4 2011 3月开始实验 预期于2011 10月完成全部实验和结果分析 并撰写论文投稿 52 九 经费预算 1 基因组DNA提取试剂盒6盒 天根生物技术公司 约合RMB10 000 2 SNPs质谱分析部分1100个样本量约RMB100 000 3 预期发现1 4个阳性位点 若发现一个阳性位点 于位点周围安排4轮测序 每个反应RMB30 35 则总计RMB72 000 总计RMB180 000 5