烟草维生素B6代谢.doc

分类号： 单位代码： 10364 密 级： 学 号： s08083201272 安徽农业大学学位论文烟草体内维生素B6的代谢研究Metabolic Research of Vitamin B6 in Tobacco Plant研 究 生: 曾海彬 指导教师： 黄龙全 教授 合作指导教师： 申请学位门类级别： 农学 专业名称： 食品科学 研究方向： 食品科学 所在学院： 茶与食品科技学院 答 辩 委 员 会 主 席： 二零一一年 五 月摘要维生素B6（VB6）是一类化合物的总称。近年来研究发现VB6在植物体内发挥抗逆作用。烟草作为模式植物其体内VB6的存在形态还未见报道。本研究采用高效液相色谱荧光检测技术对烟草体内VB6的存在形态进行了分析。结果表示：土壤栽培烟草叶、茎和根中VB6的含量依次为2.9、1.7、3.0 g/g鲜重；组培烟草叶片的VB6含量为3.9 g/g鲜重，构成比为磷酸吡哆胺（PMP）7%、吡哆胺（PM）14%、磷酸吡哆醛（PLP）19%、吡哆醛（PL）29%、吡哆醇（PN）30%；组培烟草在连续3周的检测过程中，PLP 和PL含量下降、PN含量上升，VB6总量保持相对稳定。研究结果有助于以烟草为材料，进一步开展植物体内VB6代谢机制和特殊生理机的研究。本文通过构建组织培养模型，为在组织水平上探讨植物体内的代谢机制。采取在MS培养基上外源添加VB6（PM，PL，PN）干涉植物的生理环境，采用组培和应答分析的方式，系统分析VB6的存在形态和取烟草叶片组织加液氮研磨，提取液得到粗酶液，测定相关代谢酶的酶活，分析VB6相关代谢酶酶活变化为应答分析提供实验依据。外源添加PM后叶片中PM显著增加。外源添加PL后叶片组织中PL的量有所增加，PN增加更为显著。外源添加PN后叶片中PN的量显著增加。以上三种不同处理并未引起PMP、PLP量得变化。VB6的总量都显著变化。为了分析植物吸收VB6的方式，通过在MS培养基中设置不同的梯度，分析添加量和吸收量直接的关系，发现烟草吸收VB6的方式为自由扩散。植物吸收VB6以后，在体内进行了相应的代谢，本实验通过摸索与VB6代谢相关代谢酶的酶反应最适条件，发现PL激酶最适ph 5.5 反应时间3h，PNP/PMP氧化酶最适pH 9.0反应时间2h，PLP-磷酸酶最适pH 5.5 反应时间10min，PL还原酶最适pH 7.0 反应时间2h，PM-丙酮酸转氨酶最适pH 11，反应时间2小时。反应温度都为37在上述最适的酶反应条件下测得各酶的酶活分别为PL激酶 0.03 0.01nmol/min/g鲜重，PNP/PMP氧化酶 0.12 0.01 nmol/min/g鲜重，PLP-磷酸酶179.71 41.46 nmol/min/g鲜重，PL还原酶0.78 0.04 nmol/min/g鲜重，PM-丙酮酸转氨酶2.14 0.15 nmol/min/g鲜重。VB6进入植物体内，引起体内VB6量的迅速增加外，同时也引起了相关酶活性的变化，三种处理都会引起PLP-磷酸酶活性的增加；PL激酶活性的降低，PNP/PMP氧化酶的增加，PL还原酶活性的增加仅见于PL添加组。PM-丙酮酸转氨酶都有所增加。AbstractVitamin B6 (VB6) is the general term for a kind of chemical compounds .VB6 exists in several forms, and has been linked to stress responses in plants. Until now no reports about the distribution of B6 vitamers in tobacco plants have been observed. In our experiment, the determination of VB6 vitamers in tobacco plants was described by using high performance liquid chromatography with fluorescence detector. The results indicated that, the contents of VB6 in leaves, tender stem and roots were 2.9, 1.7 and 3.0 g/g fresh weight, respectively. Leaves of tobacco plants grown on MS basal media exhibited a high content of 3.9 g/g fresh weight. The constituent ratio of B6 vitamers were as follows: pyridoxamine 5-phosphate (PMP) 7%, pyridoxamine (PM) 14%, pyridoxal 5-phosphate (PLP) 19%, pyridoxal (PL) 29% and pyridoxine (PN) 30%. During the determination period of three weeks, the contents of PLP and PL decreased, and that of PN increased. The amount of VB6 was relatively constant. Our results are favorable for further study on the metabolic mechanism and special physiological mechanism in tobacco plants.目录AbstractII1.文献综述11.1维生素B6（Vitamin B6 ，VB6）简介11.2VB6在植物体内的生理功能11.3植物体内VB6的存在形态和含量的研究进展21.4VB6的生物合成31.4.1 VB6的从头合成途径31.4.2 VB6的补救合成途径41.5.相关代谢酶的研究进展41.5.1 PL激酶的研究进展51.5.2 PNP/PMP氧化酶的研究进展51.5.3 PL还原酶的研究进展51.5.4PLP-磷酸酶的研究进展6 1.5.5 PM-丙酮酸转氨酶的研究进展71.5.6烟草的组织培养和烟草体内VB6的研究72引言72.1论文研究的目的和意义72.2 研究内容72.2.1 建立烟草的组织培养体系72.2.2 组培和土培烟草体内VB6的存在形态和含量72.2.3 外源添加VB6后监测烟草体内VB6的动态变化 2.2.4 VB6代谢酶的酶活测定条件及其酶活性测定 2.2.5 外源添加VB6后所引起的相关代谢酶活变化 2.2.6 烟草VB6的吸收机制 3 材料与方法 83.1材料83.2主要仪器83.3主要试剂83.4方法83.4.1烟草的组织培养83.4.2烟草的栽培83.4.3烟草的处理93.4.4 VB6标准试剂的配制93.4.5VB6的色谱分析93.4.6烟草组织中VB6的提取93.4.7烟草中相关代谢酶的酶活测定 4.结果与分析 104.1烟草的组织培养104.2烟草体内的VB6存在形态和含量4.2.1 设定条件下标准VB6化合物的检出104.2.2 采用所述方法对烟草植物组织的分析结果104.3外源添加VB6后体内VB6的动态变化 4.3.1外源添加PM后体内VB6的变化114.3.2外源添加PL后体内VB6的变化124.3.3外源添加PN后体内VB6的变化124.4烟草中相关代谢酶的酶活性测定 4.4.1PL激酶的最适PH和时间曲线134.4.2 PMP/PNP氧化酶的最适PH和时间曲线144.4.3PLP-磷酸酶的最适PH和时间曲线144.4.4PL还原酶的PH和时间曲线154.4.5 PM-丙酮酸转氨酶的PH和时间曲线164.4.6烟草相关代谢酶的酶活测定184.5烟草处理后引起相关代谢酶活性的变化情况 4.6VB6吸收机制研究 5.讨论5.1高效液相色谱技术在检测VB6的应用 5.2 高效液相色谱技术检测烟草体内V6205.3烟草体内相关代谢酶的提取205.4烟草体内相关代谢酶最适酶反应条件建立 205.5外源添加VB6后植物体内VB6的变化 205.6外源添加VB6后植物体内相关代谢酶活性的变化 5.7烟草吸收VB6的机制 6. 结论226.1烟草组培体系的建立6.2组培和土壤栽培烟草体内VB6的存在形态和含量6.3外源添加VB6后烟草体内VB6的动态变化6.4 VB6代谢酶的酶活测定条件并对其酶活进行测定6.5外源添加VB6后引起的相关代谢酶活性的变化6.6烟草对VB6机制的吸收7.参考文献238致谢269个人简介2710 在读期间发表的学术论文271文献综述1.1维生素B6（Vitamin B6 ，VB6）简介维生素B6（VB6）是一类吡啶化合物的总称，2-甲基-3-羟基-5-羟甲基吡啶是它们共同的母体，吡啶环第四碳位被羟甲基、氨甲基、甲酰基取代后分别形成吡哆醇（Pyridoxine， PN）、吡哆胺（Pyridoxine， PM）和吡哆醛（Pyridoxal， PL），三者相应磷酸酯形式为磷酸吡哆醇（Pyridoxine-5-phosphate， PNP）、磷酸吡哆胺（Pyridoxine-5-phosphate， PMP）和磷酸吡哆醛（Pyridoxal-5-phosphate， PLP）（各分子结构式见图1-1）。图1-1：VB6化合物的分子结构式Fig1-1 Molecular structure of vitamin B61.2 VB6在植物体内的生理功能VB6广泛存在于自然界中，PLP和PMP是其主要形式，作为多种酶的辅酶，参加催化涉及氨基酸的各种代谢反应，包括转氨基作用、脱羧作用、消除作用、消旋作用和羟醛反应等1，在各种合成和代谢的反应中发挥重要的作用。研究发现VB6可以作为生长调节剂来刺激植物的生长发育。汪本2凡等在杜氏盐藻的培养结果表明VB6浓度为0-20g/L时，藻细胞比生长速率与VB6浓度呈正相关。唐瑞3等用含有VB6的培养基处理小麦，能显著提高根系的总吸收面积和活跃吸收面积。分枝增多，发根作用明显，同时较大程度地提高小麦叶片叶绿素含量、净光合强度和小麦植株的干物重；提高小麦叶片的细胞色素氧化酶的活性Robbin4等研究纯糖和粗糖对马铃薯块茎干物质的影响时，表明粗糖对马铃薯的干物质增长效果显著主要是因为其中含有VB6。何虹桦5试验结果表明，PN经磷酸化后并氧化形成PLP，可促进氨基酸和钾进入细胞的速率。其次，PLP作为辅酶还参与多种代谢反应。PLP可以提高水稻和烟草幼苗对不良环境的适应能力，提高其抗寒性，对水稻和烟草的生长具有改善的作用，促进根系发育，增加不定根的数量，提高植株对养分离子的吸收利用。近年来的研究也发现对突变体施加外源性VB6能特异的改善突变体的表型使之根增长，同时保护植物免受高盐、紫外线、渗透压、氧化等环境胁迫的影响6，7，在植物根的发育中，PLP还可通过调节离子泵的活性来平衡体内K+、Na+的浓度，保护植物免受高盐、渗透压等一些环境胁迫因子的影响8。1.3植物体内VB6的存在形态和含量的研究进展 在植物中VB6多以非磷酸酯形式存在。温其标9研究结果发现小麦、大麦、玉米、小米和高粱等谷物中所含VB6的主要形式是游离的PN，PLP和PMP含量甚微，其中小麦和玉米的VB6含量为3.0 mg/kg，高粱仅有0.5 mg/kg；然而大麦中PN的比例高达85%，其它谷物中则以生理活性的PN葡萄糖苷为主（比VB6的非葡萄糖形式较难被人体吸收利用）。吕岱竹10等热带水果中VB6的含量进行分析，结果在龙眼和莲雾中未检测出VB6.Sharma11等分析结果表明花椰菜中VB6的总量6.22 nmol/g，以PMP的含量最高，高达2.176 nmol/g，约占了总量的1/3，其次为PLP 1.69 nmol/g，花椰菜VB6的存在形态与动物体内的相似，以磷酸酯的形式为主。蒋守花12等采用高效液相色谱技术对茶树叶片等组织中VB6的存在形态进行了分析。结果表明：叶片、嫩茎和根中VB6的含量依次为3.36、1.27、0.18g/g鲜重：叶片组织中各型VB6的构成比为：PN 21%、PL2.4%、PM19.3%、PLP40.8%和PMP17.9%；叶片中VB6的含量随叶片的成熟而增加，因叶老化而降低。1.4 VB6的生物合成1.4.1 VB6的从头合成途径微生物和植物拥有VB6从头合成途径（de novo pathway），自然界存在两种VB6从头合成途径，一种首次合成PNP，PLP。每种VB6自养生物只具有其中一种合成途径。pdxA和 pdxJ相关PLP合成途径只存在真细菌生物中，PDX1和PDX2相关PLP合成途径广泛存在于古细菌，真核生物和部分真细菌中13。PLP的一条涉及pdxA和 pdxJ基因的从头合成吡啶环途径存在于真细菌中。大肠杆菌中的此条合成途径已比较清楚。PNP是大肠杆菌合成的第一个VB6化合物，由1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸（DXP）和4-羟基磷酸-L-苏氨酸（4PHT）在基因pdxA和 pdxJ产物的催化下环化形成14-16。图1-2：VB6合成pdxA和pdxJ途径Fig1-2 Synthesis of vitamin B6 by the pdxA pdxJ wayPDX1和PDX2相关途径是近年来首先从酵母中发现的另一条广泛存在的PLP从头合成途径。PDX1和PDX2在大肠杆菌中均没有相应同源基因17， 18，所以酵母中的PLP合成完全不同于大肠杆菌。枯草杆菌、酿酒酵母、恶性疟原虫中的PDX2均表现谷氨酰胺酶活性19-22，但需要PDX1的存在，PDX1与PDX2紧密结合成异二聚体可被共纯化23， 24。现在基本可以确定，PDX1和PDX2分别构成PLP合成酶的合酶与谷氨酰胺酶两个功能域24， 25。在有氨存在下，PDX1表现出异常多态的合成能力，可以催化一组复杂反应，包括戊糖和丙糖的异构化、亚胺的形成、加氨反应、羟醛缩合反应、环化反应、芳构化反应等，催化C3和C5前体物形成PLP23。 图1-2：VB6合成Pdx1和Pdx2途径Fig1-2 Synthesis of vitamin B6 by the Pdx1 and Pdx2 way2005年，从烟草、拟南芥鉴定出PDX1和PDX2同源功能基因，发现改变结构后的PDX2成为阻碍胚芽发育的致死因子26。PDX1在拟南芥的各部分表达，在细胞旺盛分裂的根尖后部高度表达。2008年，从银杏植物也鉴定出PDX1基因，采用拟南芥突变体进行了功能性验证27。1.4.2 VB6的补救合成途径哺乳动物没有PLP从头合成途径，需从食物中获得VB6前体（PL，PM，PN）通过补救途径（salvage pathway）合成PLP。实际上，在细菌和真核生物细胞中都普遍存在一条相似的PLP的补救合成途径，这条补救代谢途径涉及不同VB6化合物间的相互转变，吡哆醛激酶（Pyridoxal kinase，PL激酶）、磷酸吡哆醛氧化酶（Pyridoxine -5-phosphate oxidase，PNP/PMP氧化酶）、吡哆醛还原酶（Pyridoxal reductase，PL还原酶）及VB6磷酸酶在此途径中其重要作用。在Zn+2和ATP存在下，PL激酶催化PN，PM，PL的各自磷酸化，生成PNP，PMP，PLP。在FMN和氧气存在下，PNP/PMP氧化酶催化PNP或PMPd的氧化反应，生成PLP。图1-3: VB6化合物间的相互转换Fig.1-3The mutual transformation between compounds of VB6 植物体体内PLP的浓度维持在一个较低的水平，根据生理需要维持PLP浓度的动态平衡。当体内积累的PLP浓度过高时，磷酸酶可以将PLP水解为PL。另外PL还原酶也被纳入补救合成途径的范畴之内，在NADPH存在下，PL还原酶催化PL生成PN28。另外假单胞菌MA利用PM-丙酮酸转氨酶可以将PM转化为PL29，然后在一系列相关代谢酶的作用下将PL分解排除体外。1.5 相关代谢酶的研究进展1.5.1 PL激酶的研究进展PL激酶是VB6代谢途径中的关键酶之一，但是目前有关植物体内PL激酶的信息却很有限，关于植物体内PL激酶的酶学催化性质在拟南芥中研究比较透彻。2002年，Lum30等首次从拟南芥中克隆出PL激酶基因，重组所得蛋白质采用亲和层析法进行纯化并对其酶学性质进行了研究。结果表明显示拟南芥PL激酶也由两个相同的单体亚基形成具有活性的二聚体，每个亚基的分子量大约在35 KD，其氨基酸序列和哺乳动物具有40%的同一性；此酶的最适PH为6.0，和哺乳动物的PL激酶一样，在Zn+2存在时催化活性最高；在最适反应条件下测定该酶对反应底物ATP和PL的Km值分别为98 mol/L和688 mol/L。对拟南芥盐过敏感性突变体的研究证明，PL激酶是一个新的盐耐受因子，对植物体内Na+和K+离子的动态平衡具有调节作用。2004年克隆出小麦的PL激酶基因 31；编码氨基酸序列与拟楠芥具有78%的同一性。印迹分析表示，小麦基因组中PL激酶基因的拷贝数至少为二；采用RT-PCR方法，从根、茎、穗、花粉囊中检出了PL激酶转录产物。2007年，Gonzlez32等分析了PL激酶基因变异对植物生长发育的影响。结果发现PL激酶基因变异植株基因明显白化、矮小、对蔗糖和食盐高度敏感，而VB6总体水平是野生型的3.7倍，其中PM和PN增加2倍，PLP增加9倍。2009年，李雅轩33等以拟南芥吡哆醛激酶基因的蛋白质序列信息设计引物，克隆与表达了大豆中的吡哆醛激酶基因。结果表明大豆PL激酶基因的表达不受光照时间长短的调控，同时结果还显示PL激酶基因在大豆根，叶，茎中均有表达，且表达量没有多大差异。钮甜甜34等从茶鲜叶中直接提取含PL激酶的粗酶液，经过硫酸铵沉淀，透析处理后，采用苯肼衍生化方法检测定PL激酶活性，并对其基本酶学性质进行分析。结果表明，提取时加入100茶鲜重的PVPP，效果最佳。纯化后的茶鲜叶PL激酶比活力为0.737 nmol/（minmg），纯化倍数为4.0；当有二价金属离子存在时，PL激酶才具有催化活性，其中Zn2+对其催化作用最强。该酶的最适反应温度为60 ；在pH6.0左右酶活力最高。在最适反应条件下，测得反应底物ATP和PL的Km值分别为19.3 pmol/L和53 pmol/L。张平平35等构建家蚕PL激酶基因融合表达质粒，转化大肠杆菌E s c h e r i c h i a c o l i 诱导表达， 经亲和层析纯化后，对融合蛋白的催化活性进行分析。纯化后的家蚕重组的PL激酶经 S D S -P A G E鉴定为单一条带，比活力为 1800 U /m g ，纯化倍数为4.0倍。在底物过量的条件下，该重组酶的体外最适反应温度是50 ；最适 pH为 5 .56 ；Z n+2是酶促反应有效的激活剂。1.5.2 PNP/PMP氧化酶的研究进展PNP/PMP氧化酶是仅有的可以将氨基酸或者醇基氧化成醛基的黄素蛋白氧化酶36，1975年Kazarinoff采用离子交换层析（DEAE-50和磷酸钙凝胶）和凝胶过滤层析葡聚糖凝胶G-100首先从兔肝中就其纯化出来，并对酶学性质进行了分析 37-40：该酶由两个相同的单聚体形成具有活性的二聚体，每个单体的分子量为27 KD；酶活力在较宽的pH范围内稳定；动力学研究表明，酶氧化底物PNP，PMP的米氏常数（Km）分别是30 mol/L、10 mol/L，FMN的解离常数为20 nmol/L。拟楠芥At5g49970基因与许多生物，包括啤酒酵母的PDX3（PNP/PMP氧化酶）基因具有同源性。2007年，Sang等人根据At5g49970的起、终点序列设计引物，使用RT-PCR方法从拟楠芥克隆出相应cDNA41。编码蛋白含有530个氨基酸残基，推测由三个独特部分构成。N端为64个氨基酸残基的叶绿体转运肽，中部为未知功能的Yjef_N区域，C端为PNP/PMP氧化酶区域。利用大肠杆菌表达C端区域和没有转运肽的基因片段，重组蛋白具有PNP/PMP氧化酶酶活性。近些年来，PNP/PMP氧化酶常通过基因重组技术获得。1998年，Disalvo42利用羧甲基葡聚糖凝胶（CM-Sephadex）和羟基磷灰石（Hydroxyapatite，Hap）纯化并分析了大肠杆菌重组PNP/PMP氧化酶，研究表明大肠杆菌PNP/PMP氧化酶氧化PNP的Km为2 mol/L（37），Kcat为0.2时，氧化PMP时分别为105 mol/L;底物为PNP，酶活力较宽范围保持稳定，但是活力较低。李艳霞43等采用液氮研磨、Tris-HCI+KP04缓冲液（pH8.5）浸提法和硫酸铵沉淀法从茶树鲜叶中提取磷酸毗哆醇氧化酶（PNP/PMP氧化酶）粗酶液，并通过苯肼法研究其酶学性质结果表明，以磷酸吡哆胺（PMP）为底物，PNP/PMP氧化酶催化反应的最佳时间为30 min，最适温度为50，最适pH6.5在pH6.09.0，温度l040的条件下此酶稳定。在最适条件下测得反应底物PMP的Km值为2.34 mmol/L PNP/PMP氧化酶是VB6代谢的关键酶。王振44等采用重组质粒pET32a（+）PNP/PMP氧化酶原核表达家蚕（Bombyxmori）PNP/PMP氧化酶，经Ni+亲和层析纯化后对其基本酶学性质进行分析。结果表明，纯化后的家蚕重组PNP/PMP氧化酶经SDSPAGE鉴定为单一条带，比活力为52981nmol/（minmg）蛋白，纯化倍数为7.1倍；该酶的最适反应温度为40，在50以下稳定；在pH 8.09.0之间酶活力最高，pH 6.010.0之间活力保持稳定。1.5.3 PL还原酶的研究进展PL还原酶在裂殖酵母中的研究较多，其早期的理化性质也多集中如此。1999年Mitsuhiro Nakano45等采用疏水层析（Butyl-Toyopearl）、亲和层析（Orange A）及离子交换层析（DEAE-Toyopearl）等首次从酵母中纯化出PL还原酶，并对你酶学性质进行了相关研究。研究发现此酶促反应是可逆反应，在NADPH和PL做底物时可以催化正反应PL生成PN，在NADP和PN做底物时可以催化逆反应PN生成PL。同时对其酶学性质研究表明，该酶的正反应的最适pH是6.5-7.5，酵母PL还原酶在pH 5.0时酶会失活，pH为8.5时只有最大活性的18%。该酶的逆反应最适pH为7.5-8.5，在pH 6.5酶没有活性，在pH 10.0时只有最大活性的18%。其动力学研究表明，该酶正反应对底物NADPH和PL的米氏常数（Km）分别是16 0.8 mM，0.909 0.080 mM。如果用NADH代替NADPH，NAD代替NADP作为辅酶，酶将没有活性。研究揭示该酶为单体蛋白，其分子量为41 KDa。在对纯化的酶进行光谱性质研究时发现，PL还原酶酶液（10 mM MOPS/KOH （pH 7.5） 含1.0 mM EDTA， 0.1 mM，PMSF， 0.01% 2-mercaptoethanol， and 0.005% Tween 40）在250-700 nm进行扫描，PL还原酶在280 nm下有最大的单一吸收峰。PL还原酶在280 nm 下被激发，最大发射波长为330 nm 。在有NADPH存在的情况下，它的荧光强度也会随之降低，分析可能是PL还原酶里面的色氨酸残基跟NADPH相互作用的结果。酵母中PL还原酶跟来自于其它物种（枯草芽孢杆菌，拟南芥，S. pombe）的AKRs（酮醛还原酶）进行序列比对时发现其同源性都不高于20%。虽然裂殖酵母中PL还原酶跟其它物种的AKRs的一级结果相似度很低，但是用Genetyx 软件分析发现它的二级结构跟来自人体的醛还原酶有很高的相似度。2000，Toshiharu Y46等从Aureobacterium luteolum中提取PN脱氢酶（Pyridoxine dehydrogenises），并通过 DEAE-cellulose，Gigapite HQ （HPLC） ，Gel ltration HPLC）等步骤纯化，经SDSPAGE鉴定为单一条带，分子量为50-60 KDa。此酶在纯化的过程中非常的不稳定。添加0.0050.02 mM FAD， 10% 甘油， 0.11.0%巯基乙醇在缓冲液中有利于防止酶失活。PN脱氢酶催化4-或5-羟基的氧化，此酶在氧化过程中必须要FAD作为其辅酶。图1-3：根据S. pombe PL还原酶的CDNA推测的氨基酸序列图Fig1-3 Nucleotide sequence of cDNA encoding pyridoxal reductase of S. pombeand its deduced amino acid sequence1.5.4 PLP-磷酸酶的研究进展PLP是重要的功能型VB6，含有强活泼性的醛基，能与细胞中多数亲核物质和蛋白质形成复合体，PLP水平的紊乱必然损害植物的正常生理机能。PL激酶/PNP/PMP氧化酶是将其它形态的VB6转化为PLP的关键性酶，保证了PLP的来源的畅通。同时受磷酸酶的作用，生物体内游离存在的PLP浓度通常维持在一个较低的水平。在PLP生物合成中，为了防止与其他亲核集团或者蛋白质形成非细胞所需的复合体，PLP活泼性醛基必须受到保护。在哺乳动物体内已经证据显示，细胞内PL激酶或者PNP/PMP氧化酶催化生成的PLP并不是被直接释放于细胞中，而是与PLP依赖性酶发生特异相互作用通道，把PLP传递给PLP依赖性酶。PLP-磷酸酶在动物体的研究较多，其早期理化性质研究多集中于哺乳动物。1992年Margaret 47，48采用硫酸铵盐析、透析及离子交换层析（DEAE-Sephadex，HA），排阻层析（sephacryl G-200 ）和亲和层析（reactive yellow 86-agarose）从人体红细胞中纯化出磷酸酶，并对其酶学性质进行了分析。研究结果表明人体内的磷酸酶的为碱性磷酸酶，它只能水解磷酸酯型的VB6化合物并且具有很高的催化效率。对PLP的米氏常数（Km）为1.5 M，Kmax为3.2 mol/min/mg，这个值比其它报道的PLP的Km低10倍。PLP-磷酸酶的pH活性范围为6-8，其最适pH为7.4，需要Mg2+作为必需金属离子，金属离子Zn2+ 和EDTA也能显著的抑制其活性。该酶为二聚体结构，分子量为64 KD。从研究的分子量，最适pH，底物特异性和必需金属离子等结果表明PLP-磷酸酶不同于其它的磷酸酶。碱性磷酸酶可以水解PLP和PMP，并且很多碱性磷酸酶对磷酸单酯形式的化合物具有宽泛的特异性。研究显示人脑中的碱性磷酸酶清除PLP的能力比其它形式的磷酸酯型化合物高。已经发现肝脏和肾中的非特异性磷酸酶可以水解PLP。酸性磷酸酶可能对磷酸酯型的VB6化合物显示出特异性。但是目前从老鼠肝脏的细胞核中提取出来的酸性磷酸酶只进行了部分的纯化，对其性质的研究很少。PLP-磷酸酶在人体红细胞内将PLP水解为PL中发挥重要的作用，生成的PL进入血浆中，然后被其它组织吸收利用。通过对人体内的红细胞磷酸酶的测定结果发现该酶不仅能催化PLP生成PL，同时可以催化PNP生成PN，对磷酸酯型的化合物有催化活性，而非专一性的PLP磷酸水解酶。通过对PLP-磷酸酶活性位点研究发现精氨酸和组氨酸是其活性位点，这与其它已报道的磷酸酶结果相符。在精氨酸和组氨酸附近的氨基酸也高度保守。磷酸酶的半胱酰胺残基具有亲核性，它与底物结合催化很多底物的磷酸化。同时半胱酰胺残基也参与很多磷酸酶的催化作用。初步的研究结果表明，二硫试剂对VB6特异性磷酸酶有保护作用，但是经过修饰的二硫试剂可以使酶失活。1.5.5 PATT的研究进展PM-丙酮酸转氨酶（吡哆胺-丙酮酸转氨酶）涉及到PN的降解途径49。PM-丙酮酸转氨酶是PLP非依赖性转氨酶，它转氨基的逆反应，以PM和丙酮酸做底物生成PL和L-丙氨酸，编码此酶的基因已经被鉴定、克隆和表征50，51。通过对野生型酶的吸收光谱、CD光谱分析及其点突变表明Lys197是酶活性必不可少的氨基酸残基，Lys残基可以利用PL生成希夫碱，Lys附近的半胱氨酸对酶活性来说也是很重要的氨基酸残基52。现在我们根据氨基酸序列或二级和三级结构的相似性将PLP-依赖性氨基酸代谢酶分为四大类，虽然PLP-依赖性酶很多，但是能够像PLP-依赖性酶一样催化反应的PLP-非依赖性酶却是很少。组氨酸脱羧酶（EC 4.1.1.22），天门冬氨酸脱羧酶（EC 4.1.1.11）和S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶（EC 4.1.1.50、丙酮酰酶、 L -丝氨酸脱水酶（EC4.2.1.17）、谷氨酸消旋酶（EC 5.1.1.3）、天门冬氨酸消旋酶（EC 5.1.1.13）。这些酶都有一个活性位点半胱氨酸残基。这些PLP-非依赖性酶跟PLP-依赖性酶的同源性很低。在其众多的PLP非依赖性酶中只有两个酶，PM-丙酮酸转氨酶和吡哆胺- 5-磷酸-酮戊二酸转氨酶（EC 2.6.1.54）它们利用VB6的化合物作为反应的底物，而不是作为辅酶。Hodsdon53等检索发现M.loti 染色体基因的内部序列为Ala-Asp-Ile-Tyr-Val-Thr-Gly-Pro-Asx-Lys-Cys-Leu（Pro2，Gly2，Ala2，Met）（Thr，Leu2）Gly-Val-Ser-Glu-Arg。这跟编码天冬氨酸转氨酶的mlr6806基因同源性很高。图1-3：根据emlr6806 cDNA推测的氨基酸序列图Fig1-3 Nucleotide sequence of cDNA encoding pyridoxaminepyruvate aminotransferase and its deduced amino acid sequence2006年，Yu52等将重组的PM-丙酮酸转氨酶基因导入Mesorhizobium loti细胞表达，超声破碎得到粗酶液，经过3070%（NH4）2SO4盐析、透析、离子交换层析（QA52 column）、疏水层析（butyl-Toyopearl column）等步骤对酶进行纯化，并对其动力学进行了研究，研究发现PM-丙酮酸转氨酶对底物PM和丙酮酸的米氏常数（Km）分别是0.044 0.004mM，0.34 0.02 mM。1.6 烟草的组织培养和烟草体内VB6的研究进展组织培养把高等植物细胞全能性表达与遗传操作相结合，在农业生产中具有巨大潜力，可以为常规的植物改良程序提供一种新的手段，从而使很多传统方法难以解决的问题迎刃而解，更多、更快、更好地创造出各种农作物和园艺植物的新品种、新类型和新种质。在组织培养技术研究迅速发展的今天，在利用原生质体培养、原生质体融合成体细胞杂种、花药培养育种等方面，烟草一直是重要的实验材料。在长期研究中，对烟草髓组织、叶组织及其愈伤组织的器官分化，已经积累了大量资料54。作为一种理想的实验材料，烟草已经在植物改良中发挥了重要作用，而且随着组织培养技术的不断进步，必将能发挥更大作用。朱生伟55等将5 mm5 mm左右的烟草叶片接种到2/3 MS+BA 05 mg/L+IAA 01 mg/L的培养基中培养2周，从外植体的边缘产生芽点，4周后分化出大量丛生芽，继续培养到6周后，当芽长2-3 cm时，转移到2/3MS+BA 0.1 mg/L+NAA 1 mg/L的培养基中分化出根，形成完整的再生植株。王煜56等:在一定的培养条件下，将无菌苗叶块接种在含有0.5 mg/L NAA的MS基本培养基上，可诱导出愈伤组织;在0.05 mg/L NAA+1.5 mg/L 6-BA的MS培养基上能分化出芽;在0.1 mg/L IAA的MS培养基中能形成根. 施和平57等烟草叶片外植体在MS+2，4-D 0.5 mg/L+6-BA1.0 mg/L的培养基上培养15 d后，产生絮状疏松的浅黄绿色的愈伤组织，30 d后开始从愈伤组织表面分化产生幼芽，60 d后平均每块愈伤组织产生30棵幼芽。将幼芽转至含0.2 mg/L NAA的MS培养基上形成根，并得到完整植株烟草是一种经济作物，在国民经济发展中起着重要的作用。同时它也是研究细胞脱分化和再分化的较好材料，因而学者们对其进行了不少研究。由于这些研究多取材于自然条件下生长的烟草，因而对离体培养条件适应性较差，致使完成细胞脱分化和再分化形成再生植株的时间较长，频率较低，故寻找更为合适的生长和培养条件就显得十分必要了.加之它又是目前国内外公认的四大模式植物之一，已广泛应用于生物学的研究，因此在非豆科植物的人工诱发固氮方面，它也可能是一种较为理想的材料。VB6是一种潜在的单线态氧的淬灭剂，它的淬灭能力可比VC和VE，甚至比后两者更高58，在1995年，一篇报告指出：用水杨酸和乙烯利处理橡胶树后，化学剂诱导植物导致植物抗病防御反应59，导致植物体内的PDX1基因拷贝数增加，这表明VB6可能在植物的防御机制中发挥重要的作用。植物在遭受病原体攻击时，植物自身将产生活性态氧（AOS），例如超氧阴离子，过氧化氢，羟基自由基，一氧化氮等。活性氧在植物遭受病原体攻击时发挥重要作用。这些活性氧扮演着作为抗菌剂，在构建细胞壁保护墙作为底物，作为激活防御体系信号传导分子的角色。但是活性态氧（AOS）的产生必须受到严格的控制，因为过度的积累会导致细胞的死亡60，61。因此AOS需要维持在一定的水平以抵挡病原体在感染部位的侵袭和刺激植物产生防御反应。然而保持活性氧水平较低的地区不受病原体侵害来保持组织完整性和生存能力。为了让这种植物的微调发挥作用，植物利用AOS来调控相关酶的活性。用水杨酸和茉莉酮酸酯处理烟草或者烟草受到病原体侵害时，其VB6合成基因随之发生调控，在烟草发生防御应答的过程中，烟草体内的PN含量增加。2引言2.1论文研究的目的和意义虽然植物是自然界VB6的主要制造者，但是植物体内VB6的研究开展较晚，VB6的代谢机制和特殊生理机制还有待研究。烟草作为一种模式植物，也成为VB6研究的实验材料。2005年Denslow等率先从烟草克隆出编码PLP合成酶的PDX1和PDX2基因，还发现烟草遭遇病原体侵染后体内的VB6含量增加62。另一方面，烟草体内VB6的存在型态还未见报道。VB6的基本类型有PN、PM和PL，磷酸酯型有PNP、PMP和PLP，在植物体内还发现有数种PN的糖和氨基酸衍生物。目前还缺乏植物体内各种VB6化合物存在形态和动态变化的研究报道。烟草植物的根、茎、叶等组织中各种VB6化合物的存在形态和动态变化是其代谢途径、生理机制研究的重要基础。对哺乳动物而言，细胞中游离存在的PLP池被维持在一个较低的水平，PL激酶和PNP/PMP氧化酶受到调控，以致在细胞需要时，PLP能够及时产生。这是因为PLP含有强活泼性的醛基，几乎能与细胞中所有的亲核试剂和蛋白质形成复合体。VB6是一种潜在的生物抗氧化剂，可以保护植物免受多种环境胁迫因子的影响，其作用机制就成为一个很重要的问题。受环境胁迫因子的作用后，植物体内VB6化合物（特别是PLP）的抗逆性应答分析有助于揭示植物体内VB6的抗逆作用机制。另外有关植物体内相关代谢途径的还有待进一步研究，有利于阐述植物的的抗逆应答。2.2研究内容2.2.1建立烟草的组织培养体系2.2.2通过高效液相技术分析组培和土壤栽培烟草体内VB6的存在形态和含量2.2.3外源添加VB6后监测烟草体内VB6的动态变化2.2.4建立相应VB6代谢酶的酶活测定条件并对其酶活进行测定2.2.5外源添加VB6后所引起的相关代谢酶酶活变化2.2.6烟草吸收VB6的吸收机制研究2.3课题来源 安徽省教育厅自然科学重点研究项目（KJ2010A116）3材料与方法3.1材料烟草品种为云烟21，在营养土上生长的烟草，MS培养基上组培的烟草。3.2主要仪器高效液相色谱：Waters 600配有2475荧光检测器色谱柱：H&E XP ODS-A 5 120A（250x4.6mm）精密电子天平：瑞士梅特勒-托利多公司高速冷冻离心机：长沙湘仪离心机仪器有限公司超声波清洗机：昆山市超声仪器有限公司涡旋器：上海沪西分析仪器厂有限公司PHS-4CT型酸度计：上海康仪仪器有限公司恒温振荡水槽：上海智城分析仪器有限公司APU-1-75-G-型超纯水机 艾科浦，重庆颐洋3.3主要试剂盐酸吡哆醇（PN-HCl）、盐酸吡哆醛（PL-HCl）、盐酸吡哆胺（PM-2HCl）、磷酸吡哆胺盐酸盐（PMP-HCl）和PLP购于美国Sigma公司。高氯酸钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾和磷酸和MS培养基的构成试剂2，4-D、6-苄氨基腺嘌呤（6-BA）、萘乙酸（NAA）、蔗糖、琼脂粉等均为国产分析纯。色谱级纯乙腈、甲醇购自美国Tedia公司；水为超纯水，其它试剂均为国产分析纯。3.4方法3.4.1烟草的组织培养3.4.1.1 MS培养基的配制母液的配置：MS培养基由大量元素，微量元素，铁盐，有机成分，生长素和激素类以及提供碳源的蔗糖和起凝固作用的琼脂粉组成，本实验用的配方如下：表1 MS培养基的配方母液名称化合物名称配方规定量（mg/L）贮备液的倍数配置母液称取量/mg母液体积/ml配一升培养基时取母液量/ml大量元素NH4NO31650.002033000.00 100050KNO31900.0038000.00CaCl2.2H2O440.008800.00MgSO4.7H2O370.007400.00KH2PO4170.003400.00微量元素KI0.83200166.0010005H3BO36.21240.00MnSO4.4H2O22.34460.00ZnSO4.7H2O8.61720.00Na2MoO4.2H2O0.2550.00CuSO4.5H2O0.0255.00CoCl2.6H2O0.0255.00铁盐FeSO4.7H2O28.7200556.00100 5Na2.EDTA.2H2O37.3746.00有机成分肌醇100.002002000.00100 5烟酸0.5100.001000盐酸吡哆醇0.5100.00盐酸硫胺素0.120.00甘氨酸2.0400.00生长素与激素类2，4-D2.05010100206BA0.5200105蔗糖30000琼脂粉7500配置各母液时的注意以下几点：1大量元素母液配置时，CaCl2.2H2O与MgSO4.7H2O要分开来，以免产生CaSO4沉淀2有机成分母液时，肌醇要单独配置，因为它不易溶解铁盐，生长素与激素类母液要保存于棕色瓶中32，4-D与6BA的配置方法时先将其溶于少量的乙醇中，再用纯水定容（2）照配方中的量将各母液加到大烧杯中，然后用纯水定容（3）加蔗糖：称好蔗糖，加到溶液中，溶解（4）调pH值：用pH计将液的pH调到5.8左右（5）分装溶液：将溶液分装到500毫升的锥形瓶中，