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微生物工程（Microorganism Engineering）绪论微生物工程定义 利用微生物的特定性状和机能，通过现代化工程技术，生产有用物质或直接应用于工业化生产的技术体系；是将传统发酵与现代基因工程、细胞工程、代谢工程、生物信息工程和计算机控制等新技术结合并迅速发展起来的现代发酵技术。初级代谢产物（primary metabolite）是指微生物通过代谢活动所产生的、自身生长和繁殖所必需的物质，如氨基酸、核苷酸、多糖、脂类、维生素等。通过初级代谢，能使营养物转化为结构物质、具生理活性物质或为生长提供能量，因此初级代谢产物，通常都是机体生存必不可少的物质，只要在这些物质的合成过程的某个环节上发生障碍，轻则引起生长停止，重则导致机体发生突变或死亡，是一种基本代谢类型。 次级代谢产物（secondary metabolite） 是指微生物生长到一定阶段才产生的化学结构十分复杂、对该生物无明显生理功能，或并非是微生物生长和繁殖所必需的物质，如抗生素、毒素、激素、色素等。不同种类的微生物所产生的次级代谢产物不相同，他们可能积累在细胞内，也可能排到外环境中。微生物工程发展的几个阶段1、传统的微生物发酵技术天然发酵2、第一代微生物发酵技术纯培养技术3、第二代微生物发酵技术深层培养技术4、第三代微生物发酵技术代谢调控技术5、第四代发酵技术微生物工程工业微生物-微生物工业用菌种1.工业微生物的定义从来源于自然界大量的微生物中分离并筛选出有用菌种，再加以改良，贮存待用于生产的微生物称为工业微生物。主要的工业微生物 ：细菌、放线菌、酵母菌、霉菌最具有发展前景的工业微生物 ：基因工程菌理想的工业微生物需要满足的条件1发酵产品是高浓度、高转化率和高产率的，同时是分泌型菌株。（高效）2菌株能利用常用的碳源，并可进行连续发酵。（低成本）3菌株不是致病株，也不产内毒素。（安全）4代谢控制容易进行。（易于控制）5能进行适当的DNA重组，并且稳定，重组的DNA不易脱落。（稳定）4.基因工程菌相对于传统工业微生物的区别与优势.u 前者含有带外源基因的重组载体;而后者是单一的微生物细胞;u 前者需要发酵条件满足外源基因的表达，后者则只需要满足细菌本身的生长和代谢需要u 要获得高水平的产品，基因工程菌生产过程中往往使用高密度发酵u 基因工程菌发酵问题中最重要的两个问题是菌体的高密度发酵和诱导条件的确定。 第三章-发酵机制1.什么是发酵机制？其研究内容包括哪些方面？ 发酵机制是微生物通过其代谢活动、利用基质合成人们所需要的产物的内在规律。研究内容包括：l 生物合成各种代谢产物的途径和代谢调节机制l 环境因素对代谢方向如何影响l 改变微生物代谢方向的措施2.糖酵解途径有哪些特点？ 糖酵解途径广泛存在于各种细胞内，反应不需要氧 糖酵解分为两个阶段 糖酵解过程由酶催化进行 其它糖类要先转化为葡萄糖或糖酵解的中间产物 辅酶的均衡3.什么是巴斯德效应？ 1861年巴斯德(L. Pasteur)在研究酵母的酒精发酵量和氧分压之间的关系中发现在厌氧条件下,向高速发酵的培养基中通入氧气,则葡萄糖消耗减少,抑制发酵产物积累的现象称为巴斯德效应。即呼吸抑制发酵的作用。在好氧条件下，酵母发酵能力下降。4.酒精、甘油和乳酸的发酵机制如何？乳酸发酵有哪些类型？酒精的发酵机制：甘油发酵机制：乳酸发酵类型：同型乳酸发酵(Homofermentation of lactic acid patheay)异型乳酸发酵Heterofermentation of lactic acid patheay 双歧途径Bifidum patheay 第四章-柠檬酸发酵机制1.柠檬酸发酵过程中有哪几个控制要点，如何控制？（1）控制Mn2+、NH4+浓度，解除柠檬酸对PFK的抑制，使EMP畅通无阻。（2）控制溶氧，防止侧系呼吸链失活。（3）控制培养基中的Fe2+ 的浓度，使顺乌头酸水合酶失活。2.氧如何对柠檬酸积累的产生重要影响的？ 乙酰CoA和草酰乙酸结合生成柠檬酸过程中要引进一个氧原子，因此氧也可以看作为柠檬酸生物合成底物。它对柠檬酸发酵的作用为：(1)氧是发酵过程生成的NADH2重新氧化的氢受体。(2)近来的研究发现，黑曲霉中除了具有一条标准呼吸链以外，还有一条侧系呼吸链。 当缺氧时，只要很短时间中断供氧，就会导致此侧系呼吸链的不可逆失活，而导致柠檬酸产酸急剧下降。 3.柠檬酸的积累机制有哪几个方面，发酵过程中的控制关键点有哪些？Mn2+缺乏抑制蛋白合成NH4+，形成一条呼吸活动强的不产生ATP的侧呼吸链，解除磷酸果糖激酶的代谢调节，促进EMP途径畅通。丙酮酸羧化酶是组成型酶，不被调节控制，草酰乙酸合成有保证。丙酮酸氧化脱羧生成乙酰CoA和CO2的固定两个反应的平衡，以及柠檬酸合成酶不被调节，增强了合成柠檬酸的能力。顺乌头酸水合酶在催化时建立了以下平衡：柠檬酸：顺乌头酸：异柠檬酸=90：3：7，同时控制Fe2+含量时，顺乌头酸酶活力降低，使柠檬酸积累。随着柠檬酸积累，pH降低到一定程度时，使顺乌头酸酶和异柠檬酸脱氢酶失活，更有利于柠檬酸的积累。发酵过程中的控制关键点有：l PEK能调节酵解过程，此酶为EMP途径第一调节点。l 磷酸果糖激酶（PFK） l 柠檬酸合成酶l 顺乌头酸水合酶l NAD和NADP-异柠檬酸脱氢酶l -酮戊二酸脱氢酶l 氧第五章-氨基酸发酵机制1.谷氨酸发酵机制及其调节机制。2.如何选育谷氨酸发酵菌种？生物素缺陷型阻断不饱和脂肪酸的合成磷脂含量减少，影响细胞膜的合成影响细胞膜的合成阻断脂肪酸的合成饱和脂肪酸表面活性剂对生物素有拮抗在对数生长期添加青霉素抑制细胞壁合成细胞膜损伤甘油缺陷型磷脂的合成受阻影响细胞膜的合成油酸缺陷型阻断不饱和脂肪酸的合成影响细胞膜的合成3.赖氨酸发酵机制及其调节机制？4.如何选育赖氨酸发酵菌种？出发菌株的选择：代谢调节比较简单的细菌（如黄色短杆菌、谷氨酸棒杆菌、乳糖发酵短杆菌等）1、优先合成的转换：渗漏缺陷型的选育2、切断支路代谢：营养缺陷型的选育3、抗结构类似物突变株（代谢调节突变株）4、解除代谢互锁5、增加前体物的合成和阻塞副产物的生成6、改善细胞膜的透过性7、选育温度敏感突变株8、应用细胞工程和遗传工程育种9、防止高产菌株回复突变第七章+抗生素的发酵机制1.什么是初级代谢产物？什么是次级代谢产物？两者有何关系？l 菌体代谢方面：次级代谢产物的合成途径并不是独立存在的，而是与初级代谢产物合成途径间存在着紧密的联系。次级代谢产物往往都是以初级代谢产物为母体衍生而来的，而且催化特殊次级代谢产物合成反应的酶也可以从那些初级代谢途径的酶演化而来。因此，微生物的初级代谢对次级代谢具有调节作用。l 从遗传方面分析：初级产物和次级产物同样都受到核内DNA的调节控制的。所不同的是次级代谢产物还受到“与初级代谢产物合成无关的遗传物质”的控制，即受核内遗传物质（染色体遗传物质）和核外遗传物质（质粒）的控制。有一部分代谢产物的形成，取决于由质粒信息产生的酶所控制的代谢途径，这类物质称为质粒产物。由于这类物质的形成直接或间接受质粒遗传物质的控制,因而产生了质粒遗传的观点。2.次级代谢产物有何特征？l 次级代谢产物是由微生物产生，不参与微生物的生长与繁殖。l 它的生产大多数是基于菌种的特异性来完成的。l 次级代谢产物发酵经历两个阶段，即营养增殖期和产物形成期。l 一般都同时产生结构上相类似的多种副组分。l 生产能力受微量金属离子（Fe2+、 Fe3+、Mn2+、Co2+、Zn2+）和磷酸盐等无机离子的影响。l 在多数条件下，增加前体是有效的。l 次级代谢酶的底物特异性在某种程度上说是比较广的。若提供底物结构类似物，则可得到与天然物不同的次级代谢物。l 培养温度过高或菌种移植次数过多，使抗生素生产能力下降，可能的原因是参与抗生素合成的菌种的质粒脱落。l 一种产物可由多种中间体和途径来取得。3.影响抗生素形成的主要调节机制有哪几个方面？请简单说明？ (1) 细胞生长期到抗生素产生期的过渡 次级代谢产物的形成出现较迟，这也许是抗生素产生菌避免自杀的主要机制之一。产物的形成是在某些营养成分从培养基中耗竭时开始的。易利用的糖、氨（NH3）或磷酸盐的消失使次级代谢物阻遏作用的解除。(2) 酶的诱导作用 在抗生素合成期,参与次级代谢的有些酶是诱导酶。需要底物或底物的结构类似物(外 源和内源诱导剂)。(3) 分解代谢产物的调节控制碳、氮分解代谢产物(如葡萄糖)阻遏和抑制作用,抑制抗生素合成。葡萄糖效应在抗生素发酵过程中，若供给高浓度的无机氨态氮或其他容易被利用的氮源，会促进菌体生长，强烈抑制抗生素的合成。(4) 磷酸盐的调节抗生素只有在磷酸盐含量控制在生长的“亚适量”时才能合成。磷酸盐抑制抗生素合成的机制可能有以下方面： A.抑制或阻遏抗生素生物合成途径中有关酶的活力和合成。 B.改变代谢途径。(HMPEMP，减少抗生素的芳香族前体合成 C.磷酸盐可调节细胞内ATP的形成。 (5) 初级代谢产物的调节A.有一条共同的合成途径,当初级代谢产物积累时,反馈抑制了某一步反应的进行,而最终抑制了次级代谢产物的合成。B.初级代谢产物直接参与次级代谢产物的生物合成,反馈抑制了它自身的合成时,必然也同时影响了次级代谢产物的合成。如缬氨酸是合成青霉素的前体，其生物合成受到反馈调节，必然对青霉素的合成有影响。(6) 次级代谢产物的自身反馈调节抗生素本身的过量积累，存在着与初级代谢相似的反馈调节现象。如氯霉素、卡那霉素、泰乐菌素、制霉菌素、瑞斯托霉素等抗生素都对本身的合成有抑制作用。 产生菌抗生素的生产能力与自身抑制所需抗生素浓度呈正相关性。因此要选育生产能力强的抗反馈调节的突变菌株。(7) 细胞膜透性的调节细胞膜的运输影响胞内合成及代谢物分泌和发酵产物收获。 在青霉素发酵中,生产菌细胞膜输入硫化物能力的大小影响青霉素发酵单位的高低。诱变选育出来的青霉素高产菌株中，改变了细胞膜的通透性，使硫酸盐更容易透过细胞膜，提高了胞内硫酸盐浓度，进而促进了青霉素前体物半胱氨酸的合成，最终提高了青霉素的产量。(8) 次级代谢的能荷调节A.能荷调节机制对次级代谢途径的控制是有效的。B.抗生素生产菌株的ATP含量在生长期中迅速增加,而在抗生素形成期ATP含量迅速下降,并保持在较低的水平上。低产菌株的ATP量始终比高产菌株大24倍。C.高浓度的磷酸盐可增加细胞内ATP的形成。 (9) 金属离子和溶解氧的调节 在多数情况下，微量的金属离子是参与次级代谢产物合成酶的活化因子，甚至有时在转录和转译水平上起作用。如，Mg2+可增加卡那霉素合成中的卡那霉素乙酰化酶、乙酰卡那霉素胺基化酶和弗氏链霉菌的碱性磷酸酶的活力，促进这些酶的合成。有些金属离子（如Mg2+和Ca2+等）可解除产生菌（卡那霉素、新生霉素和链霉素等产生菌）对所产抗生素的特异性吸附作用，使抗生素从菌丝上游离下来，促进产物分泌。还有一些金属离子（如Mg2+）可增加产生菌对所产抗生素的抗性。次级代谢产物的发酵过程需要适量的溶解氧，溶解氧的降低影响次级代谢产物的生物合成。第八章 发酵动力学1.什么是发酵动力学？其研究的主要内容有哪些？发酵动力学：发酵过程中菌体生长、基质消耗、产物生成的动态平衡及其内在的规律。研究内容：微生物生长过程中的质量和能量平衡，发酵过程中菌体生长速率、基质消耗速率和产物生成速率的相互关系，环境因素对三者的影响以及影响反应速度的条件。2. 发酵的类型有哪些？各种类型之间有哪些异同点？3. 什么是生长速率？其与什么因素相关？dt: 生长速率, g/(Lh) x: 细胞浓度，g/L S: 限制性基质浓度，g/L I: 抑制剂浓度g/L4. 什么是比生长速率？比生长速率：单位菌体的生长速率，时间的倒数一般以1/h表示。与多种因素有关，随温度、pH、基质浓度等条件改变5. 什么是Monod方程？6. 底物饱和常数的物理意义是什么？KS为比生长速率等于最大比生长速率的一半时的底物浓度KS的大小反映了比生长速率对底物浓度的敏感性。当KS较大时，值变化小，微生物对基质的敏感性小当KS较小时，值变化大，微生物对基质的敏感性大 同一微生物菌体，对不同的基质具有不同的饱和常数KS，而具有最小KS值的底物为微生物生长的天然底物。7. 产物生成速率与哪些因素相关？对于生长联系型，比生长速率与比生产速率成正比对于非生长联系型，比生长速率与比生产速率无关8. 什么是生长得率和产物得率？ 生长得率: 消耗每单位数量的基质所得到的菌体量 产物得率: 消耗每单位数量的基质所得到的产物量9. 什么是理论得率和表观得率？它们之间有何区别？ 理论得率: 只考虑细胞合成时细胞对底物的得率叫做生长的理论得率。表观得率: 既考虑合成又考虑细胞维持时细胞对底物的得率叫做生长的表观得率。理论得率只取决于细胞的组成与合成途径与生长速率无关，表观得率与生长速率及培养条件有关在生长速率较高时，生长速率很低时，表观得率可在培养过程中随时测定，而理论得率不能直接测定10. 发酵培养方法有哪些？有何区别？ 培养基: 固体发酵 是将微生物接种到经过处理的固体发酵基质上，或将发酵原料及菌体吸附在疏松的固体支撑物上，通过微生物的代谢活动，使发酵原料转化成发酵产品。液体发酵 是把菌种接种到发酵罐中，使菌体细胞游离悬浮在液体培养基中，并进行生长和将原料转化为产物的发酵方法。深层液体发酵一般需要通入空气并进行搅拌，是传统的微生物发酵培养方法。 a.浅层发酵 b.深层发酵l 分批发酵l 补料分批发酵l 连续发酵11. 液体深层发酵有哪些方法？区别何在？分批发酵 在一个密闭系统内投入有限数量的营养物质后，接入少量的微生物菌种进行培养，使微生物生长繁殖，在特定的条件下只完成一个生长周期的微生物培养方法。补料分批发酵 先将一定量的培养液装入反应器中，在适宜的条件下接种细胞，进行培养，细胞不断生长，产物也不断形成。随着细胞对营养物质的不断消耗，向反应器中不断补充新的营养成分，使细胞进一步生长代谢，到反应终止时取出整个反应系。连续发酵 以一定的速度向培养系统内添加新鲜的培养基，同时以相同的速度流出培养液，从而使培养系统内培养液的量维持恒定，使微生物细胞能在近似恒定状态下生长的微生物发酵方式第十章 发酵过程的控制1.影响发酵过程的主要因素有哪些？是如何影响的？n 温度 对微生物生长的影响在其最适生长范围内，生长速度随温度升高而加快不同生长阶段微生物对温度的反应不一样 对发酵的影响发酵温度升高产物提前合成，发酵周期缩短，减少产量温度影响产物合成的方向生长温度和产物积累温度通常不同温度对发酵液的物理性质产生影响n pHpH对发酵的影响：(1)影响酶的活性，从而影响细胞的代谢作用。(2)影响细胞膜的带电性，改变细胞膜的通透性。(3)培养基中某些组分的解离(4)对代谢产物的影响。n 溶解氧 临界溶氧浓度（C临界） 满足微生物呼吸的最低氧浓度叫临界溶氧浓度，占饱和浓度的125 溶氧大小对菌体生长和产物的形成及产量都会产生不同的影响 在发酵过程中保持最适溶氧浓度1. 供氧要求充足：Glu,Gln,Arg,Pro2. 供氧要求不严格：Ile,Lys,Thr,Asp3. 供氧受限Leu,Val,Phe 培养液中溶氧浓度的变化可以反映菌体的生长生理状况n 菌体浓度和基质浓度 种龄：种子培养期应取菌种的对数生长期为宜，菌种过嫩或过老，不但延长发酵周期，而且会降低产量。 接种量：接种量的大小直接影响发酵周期。碳源对发酵的影响及控制 迅速利用的碳源和缓慢利用的碳源氮源对发酵的影响及控制磷酸盐对发酵的影响及控制n 二氧化碳和呼吸商二氧化碳对发酵的影响1. CO2是呼吸和分解代谢的终产物2. CO2也可一作为重要的基质3. CO2对氨基酸、抗生素等发酵有抑制或刺激作用4. CO2对细胞的作用是影响细胞膜的结构呼吸商（RQ）: 菌体释放CO2的速率（CRR）与菌体的摄氧速率（OUR）之比 酵母发酵过程中 RQ=1 糖代谢进行有氧分解代谢途径，仅供生长，无产物形成 RQ1 进行无氧发酵途径，生成乙醇 RQ1 生成柠檬酸实际生产中RQ值要低于理论值，说明发酵过程中存在着不完全氧化的中间代谢物和葡萄糖以外的碳源。n 泡沫泡沫的影响：(1)降低装料系数(2)增加菌群的非均一性(3)影响微生物对氧的吸收。(4)妨碍二氧化碳的排除，不利于代谢的正常进行。(5)由于泡沫大量生成，致使培养液的容量一般只有罐容量的一半左右，影响设备的利用率，甚至发生跑料，招致染菌。(6)消泡剂的添加给下游提取工序带来麻烦2.如何判断发酵终点，应考虑哪些因素？ 终点判断经济效益、产品的质量和特殊因素 体积生产率：每升发酵液每小时形成的产物量。 总发酵产率:放罐时的发酵单位除以总的发酵时间 放罐时机对下游工序的影响 判断放罐指标产物浓度、过滤速度、菌丝形态、氨基氮含量、残糖含量、pH值、发酵液的黏度和外观等第十一章 工业发酵染菌的防治1.发酵异常会出现哪些现象？ 菌体生长差 pH过高或过低 溶解氧水平和CO2排放水平异常 泡沫过多 菌体浓度过高或过低2.目前常用的染菌检查方法有哪些？ 显微镜检查法 肉汤培养法 平板划线培养或斜面培养法 发酵过程的异常观察法3.什么是发酵染菌率？发酵总染菌率是指一年内发酵染菌的批数与总投料发酵批数之比4.发酵染菌的主要原因有哪些？ 种子包括发酵罐接种前在菌种室阶段染菌 培养基和设备灭菌不彻底 空气净化环节 设备渗漏 操作失误和技术管理环节5. 发酵过程中染菌的拯救处理有哪些方法？ 种子培养基染菌的处理 发酵前期染菌的处理 发酵中、后期染菌处理 染菌后对设备的处理废水的生物处理1.活性污泥法的原理和流程 原理：菌胶团作为絮状物悬浮于废水中，具有很强的吸附、凝聚和氧化、分解有机物的能力。 流程：其净化废水的过程分吸附和分解两个阶段。与天然沉淀净水过程类似。 第一阶段：污水中的大分子有机物粘附于活性污泥团的表面，并且在细菌胞外酶的作用下分解成小分子。 第二阶段：微生物在氧气充足的条件下，吸收这些有机物，并氧化分解，形成二氧化碳和水。 2.厌氧生物处理法的流程和原理 原理：废水厌氧生物处理是指在无氧条件下通过厌氧微生物（包括兼氧微生物）的作用，将废水中的各种复杂有机物分解转化成甲烷和二氧化碳等物质的过程，也称为厌氧消化. 厌氧消化过程划分为三个连续的阶段：即水解酸化阶段、产氢产乙酸阶段和产甲烷阶段。3.如何理解BOD、COD (1) BOD生化需氧量 表示在有氧情况下，由于微生物活动可降解有机物使其稳定化需要的氧量。其值越大，有机物污染越严重BOD浓度的高低可表示生物可分解有机物的多少，表示有机废水的污染强度。若废水BOD浓度高，排入河川后，易造成缺氧状况。 (2)化学需氧量（COD） 表示废水中有机物在化学氧化过程中所消耗氧的量。COD越高，表示废水中有机物越多。 COD常