到期许多道路：小分子RNA生物合成途径及其调控.doc

成熟的多种途径：微RNA生物合成途径及其调控微RNA是基因表达的重要调节物，控制生理和如生长和癌症的病理过程。虽然他们的行动模式已引起高度重视，但是，对控制它们表达和起作用的原理的研究才刚刚开始出现。最近的研究提出了在理解微RNA合成的途径的一个典型的转变，这是过去所认为的要普遍对所有微RNA。针对个别微RNA的成熟的步骤已经被发现，这些提供了调控方案后，微RNA的加工效率，将影响多种蛋白质转录。在这里，我们回顾了微RNA的生物合成途径知识的最新进展，并讨论其影响转录后肿瘤的发展过程中微RNA调控。微RNA（miRNAs）是短的（20 - 23 -核苷酸），内源性调节基因表达的单链RNA分子。成熟的miRNAs与Argonaute（Ago）蛋白形成RNA诱导沉默复合物（RISC的），它是一种调节转录后基因沉默的核糖核蛋白复合体。miRNA的互补碱基对引导RISC的信使RNA，这是降解，不稳定或翻译后由Ago蛋白抑制配对。蛋白质组研究最近发现了一项关于对成百上千的靶mRNA。许多细胞途径都受到了miRNA的调节功能，其中最突出的途径是控制生长和致癌过程。值得注意的是，miRNA的加工缺陷，也提高癌变的可能性。虽然对miRNAs的调控职能的研究已开始出现，对miRNA的表达和活性的调控更是知之甚少的。最近，miRNA的后转录控制活动的证据正在积累。相对于线性miRNA的加工途径，最初认为是对所有成熟的miRNA的生物合成普遍（图1），许多发现有助于承认miRNA的特定差异打开过多的规章办法来表达和处理单个miRNA的差异。在这里，我们回顾最近取得的阐明miRNA的处理和转录后调控的复杂性的。虽然我们把重点主要放在哺乳动物系统，相关信息从其他模式系统，其中包括果蝇果蝇的线虫和拟南芥的植物也将获得适当情况下适用。早期步骤：核中微RNA加工过程前体RNA的转录。miRNA基因在RNA聚合酶II或RNA聚合酶III介导下转录为初级miRNA（PRI - miRNA的）。许多前体miRNA被加PloyA尾和帽子结构聚合酶II转录的标志。他们的转录是敏感的治疗与聚合酶II抑制剂-鹅膏蕈碱，和聚合酶II启动子序列结合上游和平号，第23a /miR-27a/miR-24-2 簇。相比之下，被最大的人类miRNA的集群C19MC编码的miRNA是由转录聚合酶III。 RNA聚合酶是两个不同的调控和识别特定的启动子和终止元素，促进了多种调控选项。选定的miRNA的表达是受例如c - Myc基因或p53（参17，19），或依赖它们的促进序列甲基化的转录因子的控制。此外，它已表明，位于相同的基因簇的每个miRNA的可以被独立地转录和调控。然而，miRNA的转录步骤控制不一定通用，并在转录水平调控机制超出了本次审查的范围。微RNA编辑。初级转录RNA的编辑由ADARs（腺苷deaminases作用于RNA）的修改腺苷（甲）为inosine（一）。由于肌苷的性质碱基配对类似鸟苷（G），脱氨基miRNA的A改为I的编辑可能会改变他们的序列、碱基配对和结构特性，可以影响他们的深加工以及他们的目标识别能力。有几个编辑的miRNA的加工介导的调控的例子。pri-miRNA被Drosha - DGCR8微处理器复合物切割。pri-miRNA，在邻近内核处由核糖核酸酶III酶Drosha（RNASEN）和DGCR8蛋白质形成的核微处理器复合物（也称为Pasha（Drosha的合作伙伴）在D. melanogaster和长线虫）（图2a）的。 DGCR8 /Pasha包含两个双链RNA结合域，对miRNA加工所有有机体起着至关重要的作用。平均人类的pri-miRNA包含33个碱基对，终端环路和两个单链侧翼区的上游和下游的发夹干。双链茎和未成对侧翼地区对DGCR8的结合和Drosha切割起着至关重要的重用，但是环区域或特定的序列对这个发夹结构而言是次重要的。一个miRNA的前体干单核苷酸多态性可以阻止Drosha 的活动。然而，许多畸变的miRNA序列在人类肿瘤发现改变二级结构不影响加工，揭示微处理器结构的灵活性。Drosha的两个酶活性区域旨在切割发夹结构的3和 5端，而DGCR8与pri-miRNA直接和稳定的相互作用及功能作为一个分子标尺来决定精确的切割位点。 Drosha切开远离单链RNA /双链在发夹RNA的交界处基部的11个碱基对。 Drosha的pri-miRNA介导的切割发生miRNA的合作之前转录和拼接的蛋白编码或非编码宿主RNA的包含miRNA的。拼接不是被Drosha介导的切割所抑制，因为拼接并不要求有持续的内含子。微RNA的微处理器复合物的精确调控。Drosha介导的pri-miRNA 的加工最近证明须经miRNA的精确调控。Drosha形成的两个不同的复合物，小型微处理器复合物的仅包含Drosha和DGCR8，用来加工许多pri-miRNA和更大的复合物，其中，它包含核糖核酸解旋酶，双链RNA结合蛋白，异构核核糖和尤文氏肉瘤蛋白。RNA解旋酶p72和p68是大型Drosha复合物的一部分，并有可能作为特殊性因素，加工pri-miRNA的一个子集。几个miRNAs的表达水平在纯p68 - /减少-或p72 - / -基因敲除小鼠，而其他miRNA的仍然无影响。 Drosha介导的切割也可以调节单个miRNA：异构核核糖A1（核蛋白格A1）特异性地结合到pri-miRNA-18a，便于其加工。A1的核蛋白损失削弱了大量成熟了miR - 18A条（图2C型），但核蛋白格A1没有其他miRNA的是在同一位置了miR - 17基因组的影响，表明了miR特别特异性18a生物特异性 。核蛋白格A1结合到pri-miRNA保守环路改变了发夹结构的形成，创造一个更有利的Drosha切割位点。约14的人pri-miRNA的保守环是不同的物种之间，可提供类似的规管机制的定位点。转化生长因子-（转化生长因子-）和骨形成因素（骨形成蛋白）诱导调节微处理器活动成熟了miR - 21。转化生长因子-和BMP实现配体召集特定信号转导（即Smad蛋白）到primiR与RNA解旋酶DDX5（p68）。因此，Drosha介导的pri-miRNA加工和miR- 21强烈加强，大量成熟了miR - 21的增加，最终导致血管平滑肌细胞收缩表型。Mirtrons：剪接取代Drosha切割。令人惊讶的是，Drosha介导的将pri-miRNA加工为Pre-DNA的加工不是强制性的。内含子衍生的miRNA由拼接后的副本释放的。如果造成的内含子的剪接机制的行动和套索脱支酶具有适当的规模，形成发夹类似前的miRNA，它绕过Drosha切割，并进一步由Dicer的细胞质处理这些miRNA的，所谓mirtrons，已发现包括哺乳动物，D. melanogaster和几种线虫。Lin- 28调节let - 7的处理和前体的稳定Lin- 28是一种干细胞特异性调节的let 7的调节物，运用多种机制。Lin-28被发现对阻止微处理器介导的切割的pri_miRNA是充分必要的（图3a）。成熟的let-7克在胚胎干细胞分化时增加，但对PRI - miRNA的水平保持不变的指示，增加后成熟转录调节。重组Lin-28的pri_miRNA的加工，Lin- 28促进了成熟的let - 7的（参见54）的表达。在miRNA的竞争对手的Drosha结合位点Lin- 28映射到的pri_miRNA在终端环保护基部let - 7的（参56，57）。耐人寻味的是，虽然环区被认为是可有可无的微处理器行动，有许多miRNA的进化保守环可能含有调控信息。转录后的自我微处理器复合物的自我调控。 miRNA的加工的因素也被后转录或翻译后所调控。例如，在两个组成部分微处理器复杂的相互调节。 DGCR8稳定通过保守之间的羧基端与Drosha中域相互作用Drosha。反过来，Drosha切开5非编码区两个发夹结构和Dgcr8 mRNA编码序列。表达的Dgcr8然后退化，在负反馈的表达减少Dgcr8足够时可以用微处理器复合物活动（图4b）循环造成的。Drosha可以直接切割mRNA的发夹结构中这一发现也指出，这两个Drosha复合物在细胞mRNA的独立调节的miRNAs的可能性。Exportin - 5 Ran-GTP调节pri_-miRNA的输出。核加工后，前miRNA的是由Exportin - 5（XPO5）与Ran-GTP结合的复合物介导由核内输出到胞质中。Exportin 5的损伤导致了大量成熟的miRNA含量的下降而不是核内积累的miRNA，表明Exportin - 5还可以保护pri_-miRNA不受核消化的影响。 Exportin 5识别pri_-miRNA的特异性序列或环状结构。一个双链茎的长度和3悬对成功结合到Exportin 5起重要作用，确保只有正确加工的pri_-miRNA才能输出。未来年龄：微RNA在细胞质中成熟RISC的装载物（RLC）：Dicer，TRBP及PACT加入Ago2。 RISC的是miRNA的途径细胞质效应机，包含一个单链miRNA,指导它的目标mRNA的。细胞质miRNA的加工由RISC集会介导加载复杂的RISC（RLC）（图5A）。RLC是一个多蛋白质复合体的核糖核酸酶Dicer酶的双链RNA结合结构域蛋白的TRBP（焦油RNA结合蛋白组成）及PACT（BKR蛋白激活剂），以及也介导mRNA靶标RISC的核心部件Argonaarte- 2（Ago2）。TRBP及PACT不一定要切酶介导的前裂解的miRNA（见下文），但他们推动这一进程，并TRBP稳定Dicer。TRBP或PACT的损耗会降低后转录基因沉默的效率，都可能有重叠的职能的miRNA和小干扰RNA（siRNA）途径。尽管他们都参加Ago2召集，在体外激活的RISC复合物的形成独立启动的ATP水解由Dicer酶，TRBP和Ago2组装，出口的发夹才加入后，RLC复合物变形成。通过Ago2介导的前miRNA的剪切：在交流前的miRNA。对于miRNA的显示的互补性沿发夹干，增加内核分裂步骤高度发生：在切酶介导的切割的发夹3胳膊Ago2劈开切片机活动准乘客链中间-生成一个缺口的发夹，产生Ago2裂前体miRNA的或AC -前的miRNA（图5b中）72。 Dicer酶可以像pri-miRNA一样有效地加工这个前体。在Ago2介导的一步，很可能有助于在以后的类似的方式链分解和RISC激活，在siRNA的pathway73其功能- 77。因此，miRNA的另一个例子，具体的加工，前miRNA的进行两次核出口后，不同的命运。这种miRNA的加工Ago2早期功能也许可以解释为何它在pri-miRNA前与RLC联合和证实了有关其他物种的更早期发现：Ago蛋白在miRNA生物活性中扮演了积极分子的作用。由Dicer切割的发夹到一个的复式。核糖核酸酶IIIDicer的切开关闭前环的miRNA或ac-pre前miRNA和产生具有两个突出的悬在每个3末端核苷酸一约22核苷酸miRNA的复式。这种切割是必不可少的对miRNA的加工和描述了许多有机体包括线虫，D. melanogaster和哺乳动物。删除的Dicer酶减少或废除成熟miRNAs的产物。在小鼠，这种进化上保守的内切酶缺失在早期发育中式致命性的，一种可以与它在miRNA的加工关键作用的影响。 Dicer酶的编码基因的数量从在拟南芥中的10变化到脊椎动物中的1。在Dicer酶在哺乳动物基因组单拷贝可以解释其在miRNA的生物合成的重要作用。Dicer酶切割活性的调节几种模式进行了描述。氨基末端DExD / H-Box，Dicer的解旋酶域抑制其分裂活动TRBP结合本地区，并通过改变构想来激活Dicer酶。 Dicer酶也是被它的产物let 7调控，let-7的靶酶Dicer mRNA，创造一个反馈环。额外的机制来调节Dicer的活动可能存在的：Pre-miR - 138的表达无处不在，但其成熟的形式仅限于某些类型的细胞，表明miRNA只对特异组织加工。Lin- 28的双行为。除了其影响核微处理器的活动，Lin- 28也调控let 7前体在胞质中的成熟。值得注意的是，Lin- 28可以抑制体外Dicer酶切割。重要的是，对第三个行动模式Lin- 28介导的抑制let - 7的成熟的特点已被详细归纳。Lin-28与胞质let 7前体相联合的，诱惑的3端的Poly A尾是一个身份不明的末端尿苷转移酶（TUTase），通过还未清楚的核酸活动来引导它的讲解。在拟南芥，尿苷化是众所周知的加速成熟miRNA的衰退，以及Hen1 miRNA的甲基化被Hen1保护它们不受尿苷化和降解。只有let - 7的家族成员受Lin- 28介导的抑制或尿苷化，而人类其他的miRNA则不会受到影响，表明这些效应的特异性强。Lin- 28有助于后转录的调控let - 7在生长和癌症中表达。解开微RNA双链为指南链和乘客链。经过Dicer酶介导的切割，切酶及其效应物TRBP或PACT从miRNA双链解离。从而形成活化的RISC来执行基因沉默，双链全双工需要纳入功能指南链，这是相辅相成的目标分离，乘客链，这是后来退化。虽然多解旋酶均与该miRNA的途径，普遍旋酶个放松复式负责尚未确定。与RISC的形成或活动有关的解旋酶包括p68，p72，RNA解旋酶甲（RHA），RCK/p54，TNRC6B，Gemin3 / 4和人类Mov10或果蝇的同源基因Armitage。在小鼠中，p68被发现与let 7组成的复合物，可以解开它。对RCK/p54消耗导致miRNA介导的RNA干扰（RNAi）减少，但不影响siRNA介导的RNAi。这些结果表明，特定的解旋酶可以调节miRNA的差异。然而，在结果的RISC装载和重建试验ATP的情况下表明，解旋酶可能不是一般普遍需要的。例如，Ago2有利于解链和通过切割siRNA和miRNA前体的乘客链的RISC活性。指南链的选择，不对称和小RNA排序。原则上，miRNA的复式可能引起两种不同的成熟miRNA的。但是，对siRNA双链以同样的方式，只有一个链通常是纳入RISC和指导靶标mRNA的复杂，另一条链则降解。这个功能不对称取决于在双链末端的碱基对的热力学稳定性，miRNA链和在双链5末端缺少稳定性的碱基对的热力学稳定性。在果蝇中，miRNAs与siRNAs的共同参与排序的步骤，分区到他们效应物不同Ago蛋白，充分互补的双链siRNAs是成为Ago2 - RISC的，而一个独特的，不明身份的机制，整合互补miRNA的部分，纳入Ago1 - RISC的。在苍蝇中，精确的长度和指南链及乘客链5末端位置在Ago2定位后增加，进一步确保与指定种子序列正确的miRNA的形成。而在D.果蝇中，分选取决于双链的互补性，5端核苷酸是A.thalina。至于在哺乳动物中实现排序则仍有待解决。Argonaute蛋白质：调控者和效应物。Ago在发挥多种功能的miRNA途径：他们在参加由miRNA的加工产生的AC 前体miRNA，他们RISC的效应蛋白介导的mRNA降解，稳定或翻译抑制物。此外，Ago蛋白质丰富转录后的miRNA调节和内源性Ago2损失削弱了表达和成熟miRNA的活动。Ago2这个特定功能是独立的切片机的功能和内切酶的活动。最大的可能，Ago蛋白质的结合能力成熟miRNA的稳定这些短期分子。因此，Ago2是一个主要的候选者，以协调miRNA的调控，其生物合成及其功能。最近发现拆开脯氨酰- 4 -羟基化和Ago2的磷酸化是Ago2活动的调控机制。人类Ago2在Ser387残基在细胞压力的条件下被MPA激酶磷酸化的，以将Ago2定位到加工体上。P -机构的非编码mRNA的表达，翻译抑制，包括Ago2蛋白质和miRNAs。此外，Ago2蛋白脯氨基700羟基化I型胶原脯氨酰- 4 -羟化酶（P4H（一）稳定它。微RNA重新入核。与大多数其他动物miRNA的，成熟的人类miR 29b，主要是定位于核中。它有一个独特的六核苷酸终端主题，可转让核本地化元素，这表明，尽管它短， miRNA的可能含有顺式调控元件。 NRDE - 3，是众多的线虫Argonaute家族中的一员，参加核输入。在一个人类细胞中的一小部分细胞Ago2池核区域是受RNA-GTP穿梭蛋白Importin-8影响的，这也是需要miRNA的引导下的一个子集的mRNAs细胞质调控。miRNA的重新入核是特别重要的，因为积累的证据表明miRNA的能在转录水平调控核内基因表达。半衰期和微RNA降解。与我们日益关注的miRNA加工知识比较，令人惊讶的知之甚少的半衰期和个别miRNA的退化。只有在拟南芥对一个家族核酸外切酶被识别。成熟的miRNA的一般较稳定，如大多数miRNA的后RNA干扰消耗加工酶。不过，尚未确定的机制可以控制miRNA的消耗量。在显著减少了miR - 122在1小时后，肝细胞干扰素治疗支持这一看法。此外，miRNA的活动也可以在加工后通过被调控阻止他们的目标mRNA的RNA结合蛋白到 miRNA的结合位点。结论和展望：微RNA的特异性加工和后转录调控的细胞影响总之，miRNA的生物合成不再会被认为在所有miRNA都普遍存在的一种通用途径。许多步骤可以以多种方式进行、省略或替换，对个别miRNA而言