植物生理学综合实验.ppt

植物生理综合实验 细胞死活与H2O2鉴定 学号姓名 一实验目的 1 了解信号物质 激素对植物子叶的影响2 掌握细胞死活与过氧化氢鉴定方法 二实验原理 植物受到一些物质处理时 会作出相应的反应 产生活性物质 信号物质 一些细胞甚至会死亡 这些反应可被检测 三实验内容 一 茉莉酸甲酯对黄瓜子叶的作用二 一些物质对茉莉酸甲酯作用的影响1 SNP Hb2 乙烯利 CoCl23 H2O2供体 H2O2清除剂 SNP 硝普钠 是NO的供体 而NO是重要的植物信号物质 ETH 乙烯利 是乙烯供体 乙烯是一种植物生长激素 H2O2是信号物质 也是强氧化物 可以被检测 观察和测定指标1 观察茉莉酸甲酯处理黄瓜子叶的影响2 细胞死活鉴定 Trypanblue 3 活性氧的检测 DAB NBT活性检测 Trypanblue 台盼蓝DAB 二氨基联苯胺NBT 氮蓝四唑 1 细胞死活的鉴定 Trypanblue 原理 台盼蓝不能穿过活细胞质膜 只有死细胞染成蓝色 活细胞不能被染色 过程 取10片子叶到烧杯中 加入适量的台盼蓝染液 抽真空5min 使得染液渗透进入细胞 水浴煮沸2min 然后用2 5g ml的水合氯醛 95 酒精 脱色至组织透明 观察和拍照 死亡细胞被染成蓝色 透明后的叶片也可以保存在50 的甘油中 以备显微观察 2 过氧化氢活体组织的定位 DAB 原理 H2O2在过氧化酶的催化下可与DAB迅速反应生成棕色化合物 从而定位组织中的H2O2 植物叶片渗透 DAB 以定位H2O2是一种应用比较普遍的组织染色方法 取处理后的黄瓜子叶浸入1mg mlDAB的磷酸缓冲液 0 02mol L pH7 0 中 抽真空5min 然后于黑暗中放置8h 将叶片置于饱和水氨醛 95 酒精 中脱去叶绿素 观察和拍照 透明后的叶片也可以保存在在50 的甘油中 以备显微观察 3 氮蓝四唑 NBT 进行O 组织化学定位原理 NBT在O 的作用下还原成不溶于水的蓝色二甲替 此法测定灵敏度高 常用于O 的组织化学定位 取子叶放入含有0 1 NBT的10mM磷酸缓冲液中 0 02mol L pH7 0 中 真空渗透5min 然后将叶片置于饱和水氨醛 95 酒精 中 水浴煮沸2min进行固定和脱色 待叶绿素完全褪去后进行观察和拍照 透明后的叶片也可以保存在在50 的甘油中 以备显微观察 种子萌发所用的黄瓜品种为粤秀3号 采用滤纸培养法萌发种子 将种子均匀地拜访在铺有2层滤纸的保鲜盒中 加适量的水 以倾斜保鲜盒时在角底处约有1ml水为准 置28 光照培养箱培养5 7d 子叶处理摘取子叶整齐地摆放在铺有2层滤纸的培养皿中 9cm 取10对子叶 叶面朝上 叶背面贴靠滤纸 加入不同溶液进行处理 溶液不能太多 倾斜培养皿时 只能有约1ml液体 置光照培养箱中培养 28 光照12h 培养1d 3d 5d取出培养皿观察和拍照 然后放回培养箱继续培养 培养7d观察和拍照后进行下一步实验 四实验结果分析4 1各小组的实验结果第一组 蒸馏水 茉莉酸甲酯 5 10 4mol L 茉莉酸甲酯 5 10 5mol L 茉莉酸甲酯 5 10 6mol L 蒸馏水 茉莉酸甲酯 5 10 4mol L 茉莉酸甲酯 5 10 5mol L 茉莉酸甲酯 5 10 6mol L 蒸馏水 茉莉酸甲酯 5 10 4mol L 茉莉酸甲酯 5 10 5mol L 茉莉酸甲酯 5 10 6mol L 蒸馏水 茉莉酸甲酯 5 10 4mol L 茉莉酸甲酯 5 10 5mol L 茉莉酸甲酯 5 10 6mol L 蒸馏水 茉莉酸甲酯 5 10 5mol L 茉莉酸甲酯 5 10 4mol L 茉莉酸甲酯 5 10 6mol L 茉莉酸甲酯 5 10 4mol L 蒸馏水 茉莉酸甲酯 5 10 5mol L 茉莉酸甲酯 5 10 6mol L 第二组 浓度为100umol LSNP对黄瓜子叶的影响 200umol LSNP处理下的黄瓜子叶 300umol LSNP处理下的黄瓜子叶 SNP处理子叶染色后结果展示 第三组 25umol LHb处理下的黄瓜子叶 50umol LHb处理下的黄瓜子叶 100umol LHb处理下的黄瓜子叶 Hb处理的黄瓜子叶经染色后的变化 第四组 过氧化氢 0 6 H2O2 0 8 H2O2 1 2 H2O2 10月23日 0 6 H2O2 0 9 H2O210月24日 1 2 H2O2 0 6 H2O2 0 9 H2O210月26日 1 2 H2O2 0 6 H2O2 0 9 H2O211月12日 1 2 H2O2 第四小组 DAB染色 台盼蓝染色 NBT染色 H2O2处理从左到右的顺序浓度分别为0 6 0 8 1 2 0 6g LVc处理下的黄瓜子叶 第五组Vc 0 8g LVc处理下的黄瓜子叶 1 0g LVc处理下的黄瓜子叶 第六组ETH 第六小组 ETH处理 25umol LCOCl2处理下的黄瓜子叶 第七组 50umol LCOCl2处理下的黄瓜子叶 75umol LCOCl2处理下的黄瓜子叶 第七小组 5 10 4mol LMJ 300umol LSNP 第八组 5 10 6mol LMJ 100umol LHb 5 10 6mol LMJ 1 0g LETH 5 10 4mol LMJ 75umol LCOCl2 第八小组 5 10 4mol LMJ 1 0g LVc 第九组 5 10 5mol LMJ 1 0g LVc 5 10 5mol LMJ 1 2g LH2O2 5 10 6mol LMJ 1 2g LH2O2 4 2实验结果分析 第一组茉莉酸甲酯由第一组的实验现象可以看出 随着茉莉酸甲酯的浓度的增高 植物衰老的现象越来越明显 而且做细胞活性实验后 也是随着茉莉酸甲酯的浓度越高 叶片也从透明到逐渐染成深色 这是因为随着茉莉酸甲酯的浓度越高 导致子叶片的死细胞也会越来越多 所以叶片的染色也是越来越深 茉莉酸甲酯在植物生长和发育过程中是体现出类似激素的作用 能够促进种子的萌发 植物的生长 开花 还能促进叶片的衰老 块茎形成 果实成熟等 从第一组的实验可以看出茉莉酸甲酯促进了叶片的衰老 并且浓度越高 对细胞的衰老作用就越强 第二组硝普钠SNP 从第二组的实验现象可以看出 随着硝普钠的浓度越来越高 子叶的衰老现象就越来越不明显 叶片的死细胞也越来越少 染色现象也越来越浅 这是由于 硝普钠SNP是NO的供体 随着硝普钠SNP的浓度越高 那么培养基中的NO的浓度就越高 NO是具有生物活性和信号转导作用的易扩散分子 是植物细胞生长发育以及生理活动的调节因子 它不仅对植物的许多生命活动如种子萌发 叶片扩展 根系生长 逆境生理以及细胞的程序性死亡等具有直接的生理调节功能 而且作为防御反应中的关键信使 NO对植物凋亡有调控作用 对植物叶片的衰老的诱导作用与乙烯相似 可以通过调控NO的浓度水平来调节细胞凋亡的进程 NO对子叶的影响就是延缓子叶的衰老 第三组牛血红蛋白Hb 牛血红蛋白 NO是具有生物活性和信号转导作用的易扩散分子 是植物细胞生长发育以及生理活动的调节因子 它不仅对植物的许多生命活动如种子萌发 叶片扩展 根系生长 逆境生理以及细胞的程序性死亡等具有直接的生理调节功能 而且作为防御反应中的关键信使 NO对植物凋亡有调控作用 对植物叶片的衰老的诱导作用与乙烯相似 可以通过调控NO的浓度水平来调节细胞凋亡的进程 本实验通过添加牛血红蛋白 作为NO的清除剂 具有降低植物细胞内NO浓度而起到对细胞生长衰老的调节作用 第四组H2O2过氧化氢 从实验结果可以看出 过氧化氢的浓度越高 那么叶片的衰老速度也就越快 在测细胞的活性时 所对应的叶片的染色就越深 说明 高浓度的过氧化氢是促进叶肉细胞衰老的 导致在高浓度的情况下叶片的死亡细胞就越多 H2O2是信号物质 也是强氧化物 过氧化氢对植物叶片的生长具有促进衰老的作用 H2O2可以直接或间接地氧化细胞内核酸 蛋白质等生物大分子 并使细胞膜脂质过氧化损伤 从而加速细胞的衰老和解体 是信号物质 也是强氧化物 第五组Vc 从第五组的实验现象来看 叶片并没有因为维生素C的在培养基中的含量增多而促进叶肉细胞的衰老 反而是因为维生素C含量的增多延缓了叶片的衰老 那是由于维生素C是过氧化酶的清除剂 H2O2可以直接或间接地氧化细胞内核酸 蛋白质等生物大分子 并使细胞膜脂质过氧化损伤 从而加速细胞的衰老和解体 是信号物质 也是强氧化物 而当加入维生素C时 则就抑制了过氧化物的作用 从而 抑制植物叶片的衰老 第六组ETH ETH是乙烯利 是乙烯的供体 它既能促进营养器官的生长 又能影响开花结果 并且在植物抗逆中发挥作用 乙烯是一种气体 是能够促进衰老的植物激素 这样是符合我们的实验结果的 随着ETH的浓度升高 在培养皿中释放的乙烯浓度也越来越高 叶片的衰老现象也越来越明显 相对应的叶片的染色也越来越深 第七组CoCL2 CoCL2对叶片对起延缓衰老的作用 适宜范围浓度的钴对植物种子萌发 幼苗生长具有一定的促进作用 钴有可能通过调节活性酶和乙烯的代谢而发挥其生理作用 钴是乙烯合成的一种重要的抑制剂 通过抑制该酶的活性显著抑制乙烯的产生 所以CoCL2对叶片的生长具有延缓衰老的作用 第八组MJ与NO H2O2的关系 由于茉莉酸甲酯对叶片是起到一个促进衰老的作用 而NO是起一个延缓叶片衰老的作用 所以第八组的第一个实验现象可以看出 两种试剂的作用是相互抵消了的 第二个试验中的牛血红蛋白是减缓叶片衰老的 所以当他和茉莉酸甲酯一起使用是 也是呈一个作用相互抵消的效果的 第八组的第三个实验是用茉莉酸甲酯和乙烯利一起运用 由于茉莉酸甲酯和乙烯都是促进叶片衰老的 所以 此时 两者的作用相互叠加了 第四个实验是将茉莉酸甲酯和氯化钴一起合用 氯化钴是起减缓衰老的作用的 所以两者的作用相互抵消了 第九组MJ与NO H2O2的关系 第九组组要是两个实验 第一个是将茉莉酸