Small Molecule Signaling in Caenorbditis elegans.doc

秀丽隐杆线虫中的小分子信号Frank C.Schoroeder哈佛医学院，波士顿，马萨诸塞州哈佛医学院生物化学与分子药理学系02115摘要：虽然在很多年前便已经完成秀丽隐杆线虫基因组测序，但是对于生物小分子信号在的作用仍知之甚少。最近媒体报道了两种甾体类信号分子，这两种甾体类信号分子通过核受体DAF-12调节秀丽隐杆线虫生长繁殖及多尔停顿期。这两种化合物，被命名为胆酸，代表秀丽隐杆线虫284种核受体中的第一种内源性配体。因其生命周期短及遗传温和性，长期以来，秀丽隐杆线虫一直是遗传学家和分子生物学家所钟爱的有机体。作为基因组被测序完成的第一批生物体之一，秀丽隐杆线虫的许多生理途径与更高等动物的相应的生理途径具有相似性，这对于人类疾病相关的研究具有重要的意义。其特定的意义在于信号途径调节发育，包括控制生长、繁殖成熟以及线虫的最终寿命，从而为更为高等的动物中的类似的内分泌信号提供线索。令人惊讶的是，小分子信号在秀丽隐杆线虫内分泌信号中的作用鲜为人知。Motola等人(1)利用遗传信息来推导出一种小分子信号的结构、功能的著名例子，现在已确定了两种甾体类激素，dafachronic acid 1和dafachronic acid 2（图1），就如期待已久的内源性配体的核受体DAF12一样。图1.通过DAF-12调控线虫生殖生长。在有利的环境条件下，信号通过TGF-和胰岛素/胰岛素样生长因子激活合成4-7-dafachronic acid （1和2）所需的包括daf-9在内的基因，4-7-dafachronic acid 与促进生殖生长DAF-12结合。在不利的条件下，DAF-9是无活性；因此该dafachronic acid合成停止，从而没有配体结合的DAF-12诱发多尔滞育（未显示）。daf-36的功能就像Rieske样氧化酶，其中诱发了 2 中的 7双键合成(8) 线虫的生命周期，在成年以前通常包括四个幼虫时期，其中包括一个独特的代谢滞育期，滞育期似乎使幼虫停止老化。在不利的环境条件下，生长与生殖成熟相比具有优先性，幼虫进入所谓的“dauer”阶段（用德国“dauer”代表持久），相比线虫14天的正常寿命而言，可被替代的、不进食的幼虫期可以持续长达2个月(2)。当恢复有利条件时，dauer幼虫开始进食并恢复正常发育直到成年。这样一个明确的代谢滞育阶段的发现表明存在一个精心设计的通路，其控制和协调过渡整个生物体相关阶段所需的细胞程序(3)。事实上，与dauer形成有关的基因研究提出了在代谢调节、生殖发育，线虫寿命方面的的令人瞩目的见解。遗传筛选突变体，要么不能达到dauer的阶段，要么形成的dauer幼虫是由已经确定36个基因直接参与调控的dauer阶段(2)。核受体DAF-12似乎是控制dauer停顿期形成的信号通路中的一个主开关（dauer形成）。丢失DAF-12以及某些DAF-12突变体将导致幼虫不能获得dauer阶段，并进一步发展为异时性的表型，dauer阶段的形成以及适当的发育时间需要DAF-12(3)。DAF-12线虫是至少284个核受体中的一个，其中许多核受体已被证明在生殖发育和代谢起着重要作用(4)；然而，在Motola等人确定dafachronic acid之前，不曾确定一个调节它们功能的单一受体。在DAF-12的情况下，有力的证据不断表明存在着抑制其多尔停顿期活动和触发生殖发育相关功能的小分子配体。两个重要的信号转导通路交汇于DAF-12，胰岛素/ IGF-1（类胰岛素生长因子1）通路通过daf-2和和转录因子DAf-16起作用，DAf-16是蠕虫基因FOXO的同源基因，以及TGF-（转化生长因子）信号通路，通过daf-4和Smad转录因子daf-3起作用（图1）。这些途径已被证明使非自主性细胞运作，这表明它们直接或间接诱导小分子配体DAF-12产生。特别重要的是发现了仅在一些特定的细胞类型中表达的细胞色素P450酶CYP2，DAF-9，是上游DAF-12之后使非独立细胞直接运作的配体(5)。此外，daf-12突变映射的假定激素的预测结合位点与DAF-10突变体的十分相似(6)。作为哺乳动物CYP2酶可以代谢的类固醇激素和脊椎动物的同源DAF-12代表类固醇激素受体(3)，看起来，DAF-10参与甾体配体DAF-12的合成。更多的证据表明，来自野生型蠕虫的脂溶性提取物能拯救由于daf-9缺陷产生多尔构造的蠕虫个体DAF-10缺陷(7)，表明这些提取物中存在着可疑固醇激素。为了确定可疑的小分子激素，传统的天然产物化学家可能已经采取蠕虫脂溶性提取物的行动引导分馏法，来分离纯化的活性组分并通过光谱法确定它们的结构。然而，Motola 等人采用了不同的方法。第一步，他们筛选各种市售的用来与DAF-12结合的类固醇，通过gal4-daf-12共转染实验，确定了3-氧化固醇、3-胆烷酸，作为DAF-12弱激活剂。而相应的醇，石胆酸并没有激活作用，得出的结论是3-胆烷酸是必不可少的。为了确定一个3 -胆烷酸官能化的相关性及进一步探讨DAF-9的作用，Motola等人利用含DAF-9的微粒体来培养一系列的含3-keto-sterols，并筛选能够拯救DAF-9缺陷型蠕虫的终提取物。来自DAF-9微粒体的提取物与4-cholesten-3-one或lathosterone一起培养，两胆固醇代谢产物称为线虫的发生，能100%的拯救DAF-9缺陷型的突变体，产生的表型从野生型别无二致，而对照组将daf(-)突变体暴露于非代谢4-cholesten-3-one或lathosterone中时并不能恢复。这些结果表明，DAF-9编码一种将3-ketosterols 4-cholesten-3-one和lathosterone转化为能激活DAF-12的甾体激素的酶。另外，来自DAF-9微粒体的4-cholesten-3-one或lathosterone 的代谢产物显示，DAF-9羟化并进一步氧化的底物以非选择性的方式在C-26 / C-27侧链中获得额外的化学特性，产生两个非对映体的dafachronic acid 1和dafachronic acid 2（来自多尔的形成和异时性）。Motola等人通过短的分级方法确定了野生型蠕虫脂溶性提取物中存在dfachronic acid。利用合成样品1，作者证明了在共转染实验及拯救DAF-10突变体时，事实上，是由（25S)的1和2构成的非对映异构体的配体激活了DAF-12。1和2都具有很强的活性。250 nM的（25S）-4-dafachronic acid(1)便足以拯救DAF-9（）的蠕虫，看来（25）-7-dafachronic acid(2)，在尚未被合成可能会表现出更高的比活性。正如预期的那样，该dafachronic acid在胰岛素/胰岛素样生长因子和TGF-通路的下游起作用；然而，胰岛素信号转导可能的dafachronic acid 的下游也起作用，或通过一个平行的通路，例如（25）-4-dafachronic acid (1)不能完全拯救的救援一定的daf-2突变体时。看来，这两个dafachronic acid具有不同的生物学功能，当（25S)-7-dafachronic acid (2)可合成时，这将进行更为细致的探讨。此外，问题仍然是较不活跃的（25R）- 1和2的非对映异构体是否是在体内产生的，如果是的话，他们会有什么作用。有强有力的证据表明，daf-12不仅在多尔期和生殖生长中起着至关重要的作用，而且在通过daf-16控制成虫寿命的过程中也起着决定性的作用(8)。若以后两配体可被合成以及其衍生物可作为DAF-12激动剂或拮抗剂时将大大有助于DAF-12生物学功能的进一步探索。该dafachronic acid的鉴定仅代表线虫分子内分泌学的开始，一个化学家可能会问，为什么要这么长时间？在地球上，作为仅次于果蝇和拟南芥的最好研究的较高等的生命形式之一，我们对线虫的小分子化学的认识似乎十分的不足。最近郑某等人(9)解决了另一个长期存在的秀丽隐杆线虫信号管的问题：dauer阶段触发进入和退出的环境线索是什？20多年前，谜语，Riddle 和Golden(10)便已经证明有一组线虫释放的不知名的小分子构成进入dauer阶段的一个主要线索。郑某等人现在确定的双脱氧糖蛔糖苷，被称为“daumone”(3)，为持久性信息素；然而，daumone信号的确切机制尚不清楚。图2.持久性激素的结构 不过，线虫生物学上的更多的发现表明小分子信号的存在，其识别将大大有助于理解相应的途径。例如，通过DAF-12 daf-16控制成虫寿命和生殖的过程可能涉及其他的小分子信号(8)。而且，正如Motila等人指出的dafachronic acid作为核受体DAF-12那样，284个核受体中仍剩下283 核受体仍未得到识别，为小分子化学家提供大量的的机会。参考文献1 Motola D L, CumminsC L,RottiersV,et al.Identification of Ligands fore DAF-12 that govern dauer formation and reproduction inC. ElegansJ.Cell, 2006, 124: 12091223.2 Riddle D LAlbert,P S. inC. elegans IIF. Cold Spring Harbor, Cold Spring Harbor Laboratory Press,1997.3 Antebi A,Yeh W H,Tait D, et al.daf-12encodes a nuclear receptor that regulates the dauer diapause and developmental age inC. ElgansJ.Genes, 2004 ,14:15121527.4 Gissendanner C R,Crossgrove K.,Kraus K A,et al. Expression and function of conserved nuclear receptor genes inCaenorhabditis elegansJ. Biol,2004, 266:399416.5Mak H Y, Ruvkin G.Intercellular signaling of reproductive development by theC. Elegans DAF-9 cytochrome P450J. Development, 2004, 131: 17771786.6JiaK.,Albert P S, Riddle D L. DAF-9, a cytochrome P450 regulatingC. eleganslarval development and adult longevityJ. Development,2002,129: 221231.7 Gill M S, Held J M, FisherA L, et al. Lipophilic regulator of a developmental switch inCaenorhabditis elegansJ.Aging Cell,2004,3:413421.8Berman J R, Kenyon C.Germ-cell loss extendsC. eleganslife span through regulation of DAF-16 bykri-1and lipophilic hormone signalingJ. Cell, 2006, 124: 10551068.9Jeong P Y, Jung M.,YimY H, et al. Chemical struct